細(xì)胞培養(yǎng)工程 05 細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器(I)

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器1細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)1. 生物反應(yīng)器概述2細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 基因工程技術(shù)出現(xiàn)之前 低血清貼壁培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，用于病毒疫苗生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)微生物發(fā)酵簡(jiǎn)史 1920s：酒精、甘油和丙酮等（厭氧發(fā)酵） 1940s：青霉素/抗生素、有機(jī)酸、微生素、激素等 （無菌技術(shù)與深層發(fā)酵 - 通氣/攪拌) 1950s：谷氨酸/氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸和部分抗生素 （代謝控制與菌種人工誘變） 1970s：定向育種、基因工程蛋白質(zhì)表達(dá)4細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)Molecular Cell Biology (5th ed.) by Lodish

2、 et al.微生物與動(dòng)物細(xì)胞的主要差異 尺度 細(xì)胞壁 生長(zhǎng)速度細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)5微生物與動(dòng)物細(xì)胞的主要差異 微生物細(xì)胞尺度小，有細(xì)胞壁，抗剪切力能力較強(qiáng)生長(zhǎng)速度快，溶解氧（DO）需求較高 通氣量：較高甚至很高 攪拌：能量輸入較高，主體混合與微混合（攪拌槳） 動(dòng)物細(xì)胞尺度大，無細(xì)胞壁，抗剪切力能力較差生長(zhǎng)速度慢，溶解氧（DO）需求較低 通氣量：較低 攪拌：能量輸入較低，主體混合（攪拌槳）6細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器：1980-90s（1） 微生物深層發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟 攪拌式生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)和性能 控制與配套設(shè)施 細(xì)胞培養(yǎng)從有血清貼壁到無血清懸浮的過渡 能否懸浮生長(zhǎng)（雜交瘤

3、細(xì)胞例外） 能否無血清生長(zhǎng) 能否耐受反應(yīng)器內(nèi)攪拌剪切力 能否耐受通氧（氣泡） 能否提高細(xì)胞密度，以提高生產(chǎn)效率7細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器：1980-90s（2） 經(jīng)過業(yè)內(nèi)十余年的不懈努力，攪拌式生物反應(yīng)器已經(jīng)成為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)普遍采用的設(shè)備 可以懸浮生長(zhǎng) 可以無血清甚至無蛋白生長(zhǎng) 經(jīng)過改進(jìn)攪拌槳設(shè)計(jì)，可以耐受攪拌剪切力 在提供保護(hù)劑的條件下，可以耐受通氧 通過培養(yǎng)基合理設(shè)計(jì)，可以提高細(xì)胞密度 盡管大規(guī)模生產(chǎn)不采用，但是新穎生物反應(yīng)器研發(fā)為干細(xì)胞、組織工程和新型技術(shù)奠定了基礎(chǔ) 中空纖維、水凝膠固定化、微膠囊等 允許灌流操作（抗體濃度達(dá)到 25 g/L）8細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)生物

4、反應(yīng)器的主要功能（1） 為細(xì)胞生長(zhǎng)提供一個(gè)與外界隔離的無菌環(huán)境 清洗（CIP） 高溫滅菌（SIP） 混合攪拌功能 克服細(xì)胞重力沉降，并使其分布均勻 降低氣泡尺度，延長(zhǎng)氣泡停留時(shí)間，提高氧傳質(zhì)效率 保證營(yíng)養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物分布均勻 避免溫度、酸堿度局部過高（溫度與 pH 控制啟動(dòng)）9細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)生物反應(yīng)器的主要功能（2） 通氧，避免培養(yǎng)基溶解氧（DO）過低 控制 對(duì)環(huán)境參數(shù)（攪拌槳轉(zhuǎn)速、細(xì)胞濃度、溫度、DO、pH 等）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控和記錄，并維持在較窄的設(shè)定范圍之內(nèi) 出液（連續(xù)培養(yǎng)），補(bǔ)料（流加培養(yǎng)）10細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)氣升式生物反應(yīng)器（Airlift Bioreactor） 剪切力較

5、小，90 年代曾用于大規(guī)模培養(yǎng) 操作靈活性較差，現(xiàn)不多用11細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)攪拌式生物反應(yīng)器 主流 操作靈活，可批次、流加或灌流，普遍使用12細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)A 20,000-liter cell culture bioreactor system is installed in a Lonza Biologics plant in Singapore. A large-sale chromatography system in a Lonza Biologics Singapore plant （2008.08）13細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)2.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)模式14細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開

6、大學(xué)生產(chǎn)細(xì)胞株 生產(chǎn)細(xì)胞株合成蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力主要取決于 表達(dá)載體設(shè)計(jì) 表達(dá)載體在宿主細(xì)胞染色體上的整合位點(diǎn)是否位于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)（低于染色體 3%） 克隆篩選 傳統(tǒng)：Limiting Dilution 現(xiàn)代方法：FACS 或其它專門儀器等 在沒有選擇壓力（如 MTX 對(duì) DHFR 系統(tǒng)）存在的條件下，細(xì)胞株必須能夠生長(zhǎng)足夠代時(shí)且保持穩(wěn)定的產(chǎn)物分泌能力15細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)細(xì)胞株的生產(chǎn)能力 合成蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力評(píng)估 單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的平均值 經(jīng)克隆篩選之后，每個(gè)細(xì)胞株為單克隆，其合成蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力基本上已經(jīng)達(dá)到上限，重復(fù)篩選進(jìn)一步提高產(chǎn)率的空間不大16細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)工藝過

7、程開發(fā)與優(yōu)化概括（1） 細(xì)胞馴化 來源可能是有血清貼壁培養(yǎng) 使細(xì)胞適應(yīng)無血清或無蛋白懸浮培養(yǎng) 動(dòng)力學(xué)研究 確定產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系 了解細(xì)胞的代謝特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)需求與副產(chǎn)物生成 了解物理參數(shù)的影響（如降溫）17細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)工藝過程開發(fā)與優(yōu)化概括（2） 培養(yǎng)基優(yōu)化 在滲透壓允許范圍內(nèi)，平衡底物比例，以 提高活細(xì)胞密度 提高產(chǎn)物濃度 減少代謝副產(chǎn)物生成 采用高通量培養(yǎng)體系和統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE），以提高篩選效率，降低工作量 和成本18細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)工藝過程開發(fā)與優(yōu)化概括（3） 反應(yīng)器操作模式 批次培養(yǎng)：培養(yǎng)基優(yōu)化，生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化 流加培養(yǎng)： 補(bǔ)料培養(yǎng)基優(yōu)化 延長(zhǎng)高密度培養(yǎng)時(shí)

8、間19P=qpCv(t)dt0t細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)010020030040050060070080090010001100110100Viable Cells (105/ml)t (hours)Viable Cells Viability0102030405060708090100Cell Weaning 20040221Viability（） 雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)馴化過程細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)21 抗體分泌 CHO 細(xì)胞的馴化細(xì)胞初始狀態(tài)：貼壁，10% 牛血清第一階段：懸浮馴化，10% 牛血清第二階段：無蛋白培養(yǎng)馴化細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)批次培養(yǎng)（間歇培養(yǎng)） 培養(yǎng)液接種細(xì)胞后，培養(yǎng)過程中

9、不再添加培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)并形成產(chǎn)物，在營(yíng)養(yǎng)消耗完后終結(jié)培養(yǎng)、回收產(chǎn)物 過程開發(fā)優(yōu)化最基本培養(yǎng)方式底物細(xì)胞產(chǎn)物22細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)批次培養(yǎng)（間歇培養(yǎng)） 培養(yǎng)液接種細(xì)胞后，培養(yǎng)過程中不再添加培養(yǎng)基或其它，細(xì)胞生長(zhǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)并形成產(chǎn)物，在營(yíng)養(yǎng)消耗完后終結(jié)培養(yǎng)、回收產(chǎn)物； 動(dòng)力學(xué)研究 確定產(chǎn)物分泌與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系 生長(zhǎng)相關(guān) 非生長(zhǎng)相關(guān) 復(fù)合型 計(jì)算 產(chǎn)物比生產(chǎn)速率 主要底物比消耗速率23細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)批次培養(yǎng) - 高通量細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 培養(yǎng)基成分品種多（50-70），且常伴有協(xié)調(diào)作用 每個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)細(xì)胞株呈現(xiàn)不同作用模式，包括生長(zhǎng)支持與生長(zhǎng)抑制（毒性），因此需要確定單一成分的可采用劑

10、量范圍，并為培養(yǎng)基優(yōu)化和反應(yīng)器操作模式選擇提供基礎(chǔ) 細(xì)胞計(jì)數(shù)工作量浩大 高通量培養(yǎng)結(jié)合 DOE24 細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)加料連續(xù)培養(yǎng)（Continuous culture） 培養(yǎng)液接種細(xì)胞后，在合適時(shí)間啟動(dòng)培養(yǎng)基連續(xù)添加，并同時(shí)連續(xù)收獲培養(yǎng)液，細(xì)胞密度、底物濃度和產(chǎn)物濃度處于穩(wěn)態(tài)； 缺乏競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)（與灌流相比較），目前不常用底物細(xì)胞產(chǎn)物收獲25細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)流加培養(yǎng)（Fed-batch culture） 先將一定量培養(yǎng)液加入反應(yīng)器，然后接種細(xì)胞。隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，啟動(dòng)新鮮培養(yǎng)基或成分添加機(jī)制，使細(xì)胞能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持較高密度生長(zhǎng)和代謝； 工業(yè)生產(chǎn)最主要的培養(yǎng)方式。底物細(xì)胞產(chǎn)物加料26

11、細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)灌流培養(yǎng)（Perfusion culture） 培養(yǎng)液接種細(xì)胞后，在合適時(shí)間啟動(dòng)培養(yǎng)基連續(xù)添加，并同時(shí)連續(xù)收獲培養(yǎng)液，經(jīng)細(xì)胞截留裝置，截留細(xì)胞回流到反應(yīng)器； 高細(xì)胞密度培養(yǎng)，目前尚有采用，。細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基產(chǎn)物回收產(chǎn)物回收27細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)截留裝置灌流培養(yǎng)（Perfusion culture） 主要細(xì)胞截留裝置 中空纖維系統(tǒng) 內(nèi)置鋼絲網(wǎng) 細(xì)胞沉降傾斜扁管 活細(xì)胞沉降速度高于死細(xì)胞 活細(xì)胞沉降至底板、回流，死細(xì)胞隨培養(yǎng)基溢出28細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)3.生物反應(yīng)器控制29細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)生物反應(yīng)器 過程參數(shù)檢測(cè)與控制 溶解氧（DO） 維持細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝 設(shè)定濃

12、度適中 始終處于被消耗狀態(tài) 矯正措施：通氧（頂部/底部） pH 乳酸形成（葡萄糖/谷氨酰胺代謝） 銨離子形成（谷氨酰胺/氨基酸代謝） CO2 形成 矯正措施：在 DO 或 pH 偏離設(shè)定值（范圍）時(shí)自動(dòng)啟動(dòng)通氣或泵入所需溶液30細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)生物反應(yīng)器 過程參數(shù)檢測(cè)與控制 控制理論：PID 反饋控制 Proportional：矯正量 Integral：矯正歸位 Differential：矯正速度31細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)生物反應(yīng)器 過程參數(shù)檢測(cè)與控制 DO 甘汞電極受溶液（化學(xué)成分）環(huán)境干擾比較大輸出信號(hào)：電壓 極譜氧電極電極不與培養(yǎng)基液體直接接觸，由一層膜隔離氧分子跨膜擴(kuò)散速率與DO

13、 濃度成正比輸出信號(hào)：電流 耐高溫滅菌 性能穩(wěn)定32 pH電極 耐高溫滅菌 性能穩(wěn)定 溫度電極 熱電偶 性能穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)生物反應(yīng)器 過程參數(shù)檢測(cè)與控制 生物反應(yīng)器控制的重要性 為細(xì)胞生長(zhǎng)提供一個(gè)穩(wěn)定的生理環(huán)境 DO、pH、溫度在線自動(dòng)控制相對(duì)比較容易實(shí)現(xiàn) 主要底物和代謝副產(chǎn)物通常在無菌取樣后分析葡萄糖葡萄糖氧化酶乳酸乳酸脫氫酶谷氨酰胺谷氨酸脫氫酶/心肌磺酶/天冬酰胺酶銨離子谷氨酸脫氫酶氨基酸HPLC 現(xiàn)已有多種酶電極分析裝置，可以提供在線檢測(cè)，并可以根據(jù)設(shè)定值添加以維持某種底物的濃度恒定，但購(gòu)置與使用成本很高。33細(xì)胞培養(yǎng)工程 南開大學(xué)支原體（Mycoplasma）http:/

14、年發(fā)現(xiàn)，為目前發(fā)現(xiàn)的最小、最簡(jiǎn)單的原核生物，大小介于細(xì)菌和病毒之間。支原體細(xì)胞中唯一可見的細(xì)胞器是核糖體。沒有細(xì)胞壁，多數(shù)成球形，具有較大的可變性。支原體可以在特殊的培養(yǎng)基上接種生長(zhǎng)，進(jìn)行臨床鑒定。形態(tài)形態(tài) 大小為 0.2 - 0.3 m，無細(xì)胞壁，形態(tài)呈現(xiàn)多形性，可通過濾膜； Giemsa 染色法呈淡紫色（革蘭氏染色不易著色）； 細(xì)胞膜膽固醇含量豐富，約占 36%。基因組基因組 一個(gè)環(huán)狀雙鏈 DNA，分子量小（僅有大腸桿菌的1/5），合成與代謝能力很有限。生長(zhǎng)生長(zhǎng)特性特性 繁殖方式多樣，二分裂繁殖為主，還有斷裂、分枝、出芽等方式； 支原體細(xì)胞分裂與其 DNA 復(fù)制不同步，可形成多核長(zhǎng)絲體；

15、體外培養(yǎng)需 10 - 20% 人或動(dòng)物血清（膽固醇）； 最適 pH 7.8 - 8.0 ，一般低于 7.0 則死亡（解脲脲原體，pH 6.0 - 6.5）； 大多數(shù)兼性厭氧，生長(zhǎng)緩慢，在瓊脂含量較少的固體培養(yǎng)基上孵育 2 - 3 天出現(xiàn)典型的 “荷包蛋樣” 菌落（圓形，直徑 10 - 16 m），核心部分較厚，向下長(zhǎng)入培養(yǎng)基，周邊為一層薄的透明顆粒區(qū)； 支原體可在雞胚絨毛尿囊膜或培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)；生化反應(yīng)分型生化反應(yīng)分型一般能分解葡萄糖的支原體不能利用精氨酸，能利用精氨酸的則不能分解葡萄糖，據(jù)此可將支原體分為兩類；解脲脲原體不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。表面抗原表面抗原 各種支原體都具有型特異性，少有交叉反應(yīng)。抵抗力抵抗力 支原體對(duì)熱的抵抗力與細(xì)菌相似；對(duì)環(huán)境滲透壓敏感，滲透壓的突變可致細(xì)胞破裂；對(duì)重金屬鹽、石炭酸、來蘇爾