植物組織培養(yǎng)試驗

1、植物組織培養(yǎng)試驗植物組織培養(yǎng)技術(shù)實驗指導實驗一組培室設(shè)備參觀及器皿的洗滌和滅菌一、目的要求：1 .通過參觀，了解組織培養(yǎng)室的幾個主要組成部分和各部分應(yīng)有的基本設(shè)備以及有關(guān)儀器的用途與功能。2 .通過實際操作，學會洗滌劑的配制和各種器皿的清洗和滅菌方法。二、材料用具：高壓滅菌鍋、烘箱、超凈工作臺、雙筒解剖鏡、酸度測定儀、空調(diào)機、控溫儀、百分之一與萬分之一天平、電爐、玻璃器皿（試管、三角瓶、移液管、漏斗、燒杯、容量瓶、試劑瓶、量筒酒精燈），以及鐐子、解剖刀、解剖針、手術(shù)剪，肥皂、洗衣粉、重銘酸鉀、濃硫酸等。三、說明：在進行各類具體的組培實驗前，首先了解組培室的結(jié)構(gòu)及主要設(shè)備的用途和性能是十分必要的

2、，總體上的了解有利于以后各實驗的進行以及正確的使用各種儀器和設(shè)備。植物組織培養(yǎng)是一項十分細致的工作，為了保證植物外植體不受污染，第一關(guān)就是要對各種器皿進行清洗和消毒，使它們保持無菌狀態(tài)，做這些工作同樣有一套科學的方法和需要熟練的技巧，因此每個學生必須學好這套基本功。四、方法和步驟：首先在老師帶領(lǐng)下參觀組培室，并聽取講解，然后配制洗液，稱取工業(yè)用重銘酸鉀40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制濃硫酸（或廢硫酸）配好的溶液呈紅色，銘酸洗液是一種強氧化劑，去污能力強，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蠟等則用此液無效，銘酸洗液可反復使用，直到溶液呈青褐色為止。此溶液腐蝕性強，洗滌時需

3、注意。每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗凈一泡入洗衣粉水溶液中進行洗刷一清水反復沖洗一蒸儲水淋一遍一烘干備用。然后清洗部分較臟的玻璃器皿，方法：采用先堿后酸，即用洗衣粉洗刷后沖洗干凈一晾干一侵入酪酸洗液，浸泡時間視器皿的骯臟程度而定一清水反復沖洗干凈一蒸儲水淋洗一遍一烘干備用。帶有石蠟或膠布的器皿：先將其除去，再用常規(guī)洗滌，石蠟用水煮沸數(shù)次即可去掉，膠布粘著物則需用洗衣粉液煮沸數(shù)小時，再用水沖洗，涼干后浸入洗液，以后的步驟同前。對器皿和用具進行高壓滅菌，即用手提式高壓滅菌鍋，在1.1個大氣壓下保持1520分鐘。解剖刀、手術(shù)剪、解剖針、鐐子等用具在接種前還要用百分之七十的酒精棉球擦一下，再用酒精

4、燈的火焰滅菌,冷卻后即可應(yīng)用。五、作業(yè)：試闡述為什么要對器皿和用具進行嚴格的洗滌和滅菌？實驗二母液的制備及培養(yǎng)基的配制、滅菌一、目的要求：通過掌握培養(yǎng)基對母液制備及常用培養(yǎng)基的配制和滅菌方法，為植物組織培養(yǎng)準備合適的營養(yǎng)條件。二、材料用具：高壓滅菌鍋、冰箱、普通及精密天平、電爐、鋁鍋、玻璃器皿（燒杯、量微、容量瓶、移液管、試劑瓶、三角瓶、漏斗），化學試劑（CaCl2-2HO,KNO3MgSO-7HO,NHNO,KHPO,NaEDTAFeSO-7HO,MgSO-4HO,ZnSO7HO,H3BO3KI,NaMo。2HO,CuSO5HO,C0CI26HO,甘氨酸，鹽酸硫胺素，鹽酸毗哆醇，煙酸，肌醇，

5、蔗糖，瓊脂，若干種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及天然復合物，HCL,NaOH酉精），以及稱量紙、藥匙、玻璃棒、精密度紙，瓶蓋用紙，線繩或橡皮筋、鉛筆、標簽紙。三、說明:植物材料培養(yǎng)要獲得成功，并正常生長，培養(yǎng)基的組成成分是一個決定性因素，不同植物要求不同的培養(yǎng)基，因此，在進行大量工作之前，對不同培養(yǎng)基應(yīng)進行分析、比較、試驗，選擇或發(fā)展出一個符合試驗材料需要的適宜培養(yǎng)基。大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基由無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機附加物等。四、方法和步驟：(一)母液的制備母液的配制是按所使用藥品的類別，而分別配成大量元素、微量元素、維生素和鐵鹽等。配制母液時特別要注意無機鹽成分在一起，可能產(chǎn)生的

6、化學反應(yīng)，如Ca2+和s6-4,Ca2+,Mg2PO-4一起溶解后，會產(chǎn)生硫酸鈣或磷酸鈣的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液貯存，應(yīng)分別配制和保存。配制母液時要用雙重蒸儲水等純度較高的水，藥品應(yīng)采用化學純或分析純級，藥品的稱量及定容都要準確，各種藥品先以少量蒸儲水使其充分溶解，然后按培養(yǎng)基上的排列順序混合?，F(xiàn)以Murashige和Skoog(1962)培養(yǎng)基為例敘述如下：根據(jù)各種藥品的特點，母液可配成4種。MS§養(yǎng)基母液的配制成分規(guī)定用量儲備液擴稱取量母液定配1LMSW/mg.L-1大倍數(shù)/mg溶體積養(yǎng)基吸取/ml重/ml母液I大里兀系KNO19002038000NHNO165020

7、33000MgSO-7HO370207400100050KHPO170203400CaCb2HO440208800母液n微里:兀素MnSO-4HO22.32004460ZnSO7HO8.62001720HBO6.2200124010005KI0.83200166NaMoO2HO0.2520050CuSO-5HO0.0252005CoCb6Ho0.0252005母液田鐵鹽NS2-EDTA37.3200746010005FeSO7屋O27.82005560甘氨酸2.0200400鹽酸硫胺素0.120020(Vit.Bi)鹽酸毗哆醇0.5200100(Vit.B6)10005煙酸0.5200100(

8、Vit.B3)肌醇10020020000母液IV有機物質(zhì)1 大量元素和微量元素母液的配制按規(guī)定用量，稱取所需的各種藥品，在配制時為減少工作量，可以把幾種藥品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中（見表1）.但由于各種藥品的混合，可能發(fā)生反應(yīng)，生成沉淀物，以致母液失效.為避免類似現(xiàn)象發(fā)生，在大量元素、微量元素和維生素及氨基酸的母液配制時，可采用如下2種做法加以解決：將要配在同一母液的大量元素、微量元素和維生素及氨基酸等化合物，按“表1”所列藥品的先后順序溶解藥品，待前一種藥品完全溶解后再加入后一種化學藥品，以此類推；使每種成份分別完全溶解，再把它們彼此混合.2 鐵鹽母液的配制鐵鹽的成份含硫酸亞鐵

9、（FeSO7HO）和乙二胺四乙酸二鈉（Na-EDTQ這兩種化合物的溶解和混合較為嚴格，必須按如下方法配制，否則將會產(chǎn)生沉淀.該方法是：分別溶解FeSO-7HO和Na-EDTA加熱并不斷攪拌，使之完全溶解，冷卻，將2種溶液混合，調(diào)PH至5.5,用蒸溜水加至所需容積，棕色瓶保存于冰箱之中.3 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基的重要組分之一，一般是植物激素類物質(zhì)，如生長素類的IAA、舊A、NAA赤霉素類的GA,細胞分裂素類的2,4-D、KT和6-BA等.由于大多數(shù)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)難溶于水，因此配制方法也各不相同：IAA,舊A和GA先用少量95嘴精溶解，再加水定容，搖勻后貯于試劑瓶中、貼

10、上標簽后，存放在冰箱中；NAAM用熱水或少量95%酉精溶解，再加水定容至所需容積；2,4-D可溶于少許1molL-1的NaOH§液中，然后加水定容；KT和6-BA可用少量1molL-1的HCl溶解，再加水定容；玉米素先溶于少量95%酉精中，然后加水定容.植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度通常用ppm（mgg-ml-1）和molL-1表示，在配制母液時，常以ppm較為方便，一般配制成0.5ppm的母液，這個濃度既便于計算，也可避免冷藏時形成結(jié)晶.在植物組織培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中往往要加入一些有機附加物，如椰子汁，以促進組織培養(yǎng)活性.由于椰子汁的活性成分是耐熱的，在配制時，要先把由果實中采集到的汁液加熱煮沸

11、以除去其中的蛋白質(zhì)，過濾，然后置塑料瓶中貯存于的-200c的低溫冰箱內(nèi).(二)培養(yǎng)基的配制1量取所配培養(yǎng)基總體積的2/3體積的蒸儲水，如要配l升培養(yǎng)基，先量取約700ml體積的水。表2根據(jù)培養(yǎng)基配方，用量筒量取所需要的各種元素的母液。物質(zhì)加入體積或重量大量元素母液(20x)50ml微量元素母液(200x)5ml鐵鹽母液(200x)5ml有機物質(zhì)母液(200x)5ml蔗糖30g瓊脂8g吸取母液時，注意應(yīng)先將幾種母液按順序排好，不要弄錯以免使培養(yǎng)基中藥品成分發(fā)生改變。在培養(yǎng)不同的外植體時，應(yīng)加入不同的激素。加入一種母液后應(yīng)先攪拌均勻，避免因不均而使局部濃度過高而引起沉淀，瓊脂可于加入蔗糖調(diào)節(jié)完pH

12、值后再加入，此時應(yīng)注意攪拌，以免瓊脂或蔗糖沉淀于燒杯底而炭化。加熱至沸騰片刻，以使瓊脂充分溶解，檢查時可注意燒杯內(nèi)溶液是否透明。3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，用pH計或pH試紙測定培養(yǎng)基的pH按照培養(yǎng)材料的要求分別用1mol/LNaOH§液、1mol/LHCl溶液來調(diào)節(jié)所配制培養(yǎng)基的pH值，一般培養(yǎng)基的pH值約為5.8,培養(yǎng)的材料不同，對培養(yǎng)基的pH值要求也不同。4分裝將配制好的培養(yǎng)基分別裝在事先洗凈的三角瓶，用錫鉗紙封口，注明標簽，然后和用牛皮紙或報紙包好的培養(yǎng)皿及用三角瓶裝好的蒸儲水一道進行高壓滅菌。5培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌法，即將分裝好的培養(yǎng)基放在高壓滅菌鍋中，加熱，待

13、壓力上升到0.5kg/cm2時，打開放氣閥排凈冷空氣，關(guān)閉放氣閥繼續(xù)加熱使壓力穩(wěn)定在1.1-1.2kg/cm2,溫度為121攝氏度的條件下，維持15-20分鐘，培養(yǎng)基滅菌時間不宜過長，以防引起培養(yǎng)基成分的變化，滅菌后的培養(yǎng)基置于室溫下貯存（最適宜的溫度為10攝氏度），一般培養(yǎng)基在滅菌后二星期內(nèi)應(yīng)用。6培養(yǎng)基的保存消毒過的培養(yǎng)基通常放在接種室或培養(yǎng)室中保存,般應(yīng)在消毒后的兩周內(nèi)用完，最好不要超過一個月。實驗三細葉連翹愈傷組織的誘導和增殖一、目的要求：掌握植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法。二、實驗原理：植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細胞具有全能性，所謂細胞全能性是指植物體任何一個細胞都攜帶著一套發(fā)育成完

14、整植株的全部遺傳信息，在離體培養(yǎng)情況下，這些信息可以表達，產(chǎn)生出完整植株。要使細胞所具有的全能性表達出來，除了生長以外，還要經(jīng)過脫分化和再分化等過程。分化了的植物根、莖、葉細胞，通過脫分化培養(yǎng)可以產(chǎn)生愈傷組織。愈傷組織是一種能迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞團。愈傷組織經(jīng)過進一步的分化培養(yǎng)，提供不同的營養(yǎng)和激素成分，又可再生出完整的小植株。植物組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅具有重大的理論意義，而且在生產(chǎn)實踐中已顯示了廣泛的應(yīng)用前景。三、材料用具：細葉連翹葉片、分析天平、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室、剪刀、鐐子、手術(shù)刀、電爐、燒杯、試劑瓶、培養(yǎng)瓶、酒精燈、精密pH試紙四、試驗方案本試驗以MSW養(yǎng)基

15、為基本培養(yǎng)基，采用正交設(shè)計探索生長因子6-BA、2,4-D、NAA寸細葉連翹幼嫩葉片愈傷組織誘導的適用量，每個因子設(shè)三種水平（表1）,構(gòu)成三因素三水平的試驗設(shè)計（表2）表1葉片愈傷誘導正交設(shè)計因素水平表因素水平6-BA2,4-DNAAmg/Lmg/Lmg/L10.10.10.120.50.50.531.01.01.0表2葉片愈傷誘導正交設(shè)計表處理6-BA2,4-DNAA10.10.10.120.10.50.530.11.01.040.50.10.550.50.51.060.51.00.171.00.11.081.00.50.191.01.00.5本試驗以MSW養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用隨機區(qū)組試驗

16、探索生長因子6-BA、NAA寸細葉連翹愈傷組織增殖的適用量，每個因子設(shè)三種水平,構(gòu)成9個處理的隨機區(qū)組試驗設(shè)計(表3)。表3愈傷增殖激素組合配比表(單位：mg/L)四、方法和步驟1 愈傷組織的誘導(1) 將細葉連翹的幼嫩葉片用自來水沖洗凈，再用飽和的洗衣粉浸泡30min,沖洗30min,在超凈工作臺中，用70濃醇浸泡30S,無菌水沖洗一次，轉(zhuǎn)入0.1%升汞中消毒8min,在消毒過程中不斷振蕩使外植體充分接觸消毒劑，倒出消毒劑，用無菌水沖洗葉片3-5次。(2) 將消毒后的葉片在無菌濾紙上吸干水，用無菌解剖刀切成0.5cmx0.5cm的小片。(3) 將切好的小葉片接入表2所示9種培養(yǎng)基中。(4)

17、在25C土1C,光照16h/d條件下進行培養(yǎng)。(5)1周后在葉片切口邊緣出現(xiàn)愈傷組織，培養(yǎng)4-6周，愈傷組織達到高峰。2 愈傷組織的增殖(1) 將生長良好的愈傷組織從外植體上切下，切掉變成褐色的部分，其余部分切成約黃豆大小，接入表3所示9種培養(yǎng)基中。在25C土1C,光照16h/d條件下進行培養(yǎng)。(3)愈傷組織生長旺盛，呈淺綠色或淺黃色，質(zhì)地較為疏松。3實驗結(jié)果觀察及記錄對愈傷組織誘導及生長情況拍照記錄。材料接種后，在固定周期內(nèi)對材料的污染率、褐化率、死亡率、愈傷啟動率以及愈傷組織誘導率等情況做觀察記載及必要的統(tǒng)計，并根據(jù)需要調(diào)整試驗步驟。以下為一些數(shù)據(jù)記錄公式：啟動率=未污染外植體啟動數(shù)/未污

18、染外植體總數(shù)x100%污染率=接種污染數(shù)/接種總數(shù)x100%死亡率=未污染死亡數(shù)/未污染總數(shù)X100%褐化率=未污染褐化數(shù)/未污染總數(shù)X100%愈傷組織誘導率=產(chǎn)生愈傷組織的塊數(shù)/接種的總塊數(shù)X100%其中，有部分外植體并未完全褐化，也長出部分愈傷組織，對于此種外植體，記錄數(shù)據(jù)時，既將其當成褐化外植體同時也當成產(chǎn)生愈傷的外植體。用SPSS計分析軟件進行數(shù)據(jù)的方差分析。實驗四樹型金銀花愈傷組織的誘導和增殖的研究實驗一、實驗設(shè)計1研究的技術(shù)路線在查閱有關(guān)文獻資料的基礎(chǔ)上，結(jié)合預備試驗，主要采用芽、幼嫩莖段和幼嫩葉片，著重從誘導愈傷方面研究樹型金銀花愈傷最佳誘導體系，主要采用單因素、雙因素、以及多因

19、素正交設(shè)計的方法，同時用多元分析法進行分析，從而摸索出最佳誘導愈傷條件。篩選出最優(yōu)體系，具體技術(shù)路線如下圖：外植體選取匚。外植體表面滅菌口愈傷組織的誘導匚二愈傷組織的增殖圖1技術(shù)路線2試驗方案植物的最佳繁育方法，首先是由其遺傳特異性決定的，單就組織培養(yǎng)而言，它還受植物基因型、外植體種類、部位及培養(yǎng)基種類、激素類型及濃度、培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。本試驗在參考已有資料的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計和隨機區(qū)組試驗設(shè)計，注重啟動培養(yǎng)基配方的研究，各階段設(shè)計方案如下：2.1 芽愈傷組織的誘導本試驗以MSW養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，MSW養(yǎng)基配方見表2、表3和表4。采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計探索生長調(diào)節(jié)因子6-BA,NAA對樹

20、型金銀花頂芽或側(cè)芽誘導愈傷組織的適用量，6-BA,NAA8個處理的隨機區(qū)組試驗設(shè)計（表2）。表2芽愈傷誘導激素組合配比表（單位：mg/L）水平因素123456786-BA11.522.511.522.5NAA0.050.050.050.050.10.10.10.12.2 莖段愈傷組織的誘導本試驗以MSW養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，MSW養(yǎng)基配方見表1。表2.3表2.4。采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計探索生長調(diào)節(jié)因子6-BA,NAA對樹型金銀花莖段誘導愈傷組織的適用量，6-BA,NAA8個處理的隨機區(qū)組試驗設(shè)計（表2）。2.3 葉片愈傷組織的誘導（1） 正交實驗設(shè)計本試驗也是以M湍養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用正交設(shè)計探索

21、生長因子6-BA、2,4-D、NAAW及蔗糖濃度對樹型金銀花幼嫩葉片愈傷組織誘導的適用量，每個因子設(shè)三種水平（表3）,構(gòu)成四因素三水平的試驗設(shè)計（表4）。表3葉片愈傷誘導正交設(shè)計因素水平表因素水平2,4-D6-BANAA蔗糖mg/Lmg/Lmg/Lg/L10.50.11.01521.00.52.03032.01.03.045表4葉片愈傷誘導正交設(shè)計表處理2,4-D6-BANAA蔗糖10.50.111520.50.523030.51345410.1245510.5315611130720.1330820.5145921215(2)單因素誘導葉片愈傷本試驗也是以MSW養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用隨機區(qū)組

22、試驗設(shè)計探索生長因子2,4-D不同濃度對樹型金銀花幼嫩葉片愈傷組織誘導的影響，該因子設(shè)四種水平(表5),構(gòu)成單因素四水平的試驗設(shè)計。表5葉片愈傷誘導2,4-D單因素水平表水平(mg/L)12342,4-D0.51.01.52.03試驗方法3.1 培養(yǎng)基的選擇查閱的中文文獻和外文文獻中絕大多數(shù)金銀花的組培都選用MS(MurashingandSkoog,1962)培養(yǎng)基，這說明M湍養(yǎng)基為金銀花組培的經(jīng)典培養(yǎng)基，故三種外植體均選取MSW養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,以節(jié)約時間和減少浪費。3.2 培養(yǎng)基的火菌根據(jù)試驗設(shè)計各階段所需要培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制好后進行認真嚴格的濕熱滅菌，滅菌條件為121C,約110Pa下滅

23、菌20分鐘，滅菌完成后取出待其冷去凝固后使用。如果為固體培養(yǎng)基，則在取出后應(yīng)該適當搖蕩使培養(yǎng)基里面的瓊脂充分混勻，以防培養(yǎng)基凝固不好。3.3 激素的選取根據(jù)外植體的不同分別選取了不同的激素，這些激素分別是:6-BA、NAA2,4-D。3.4 外植體的選取冬芽選取3月份未萌發(fā)的芽，去除外層葉片。幼嫩莖段盡量選取莖段頂層。葉片選取幼嫩葉片。3.5 外植體滅菌滅菌試劑的選取75%酉精，0.1%升汞，30%次氯酸鈉。3.5.1 金銀花芽的滅菌由于金銀花芽外面常粘附有泥土，且冬芽的外層披一層絨毛，所以在進行滅菌前應(yīng)進行預處理，盡量減少其表面微生物數(shù)量，降低接種后的污染率。具體處理方法為：取回頂芽，將其最

24、外層葉片剝離，然后將其放入燒杯中，加純凈水和少量洗潔精后，放在雙向磁力加熱攪拌器雙向磁力加熱攪拌器上攪拌數(shù)分鐘，取出材料準備正式滅菌。a滅菌試劑分別選用75%酉精+0.1%升汞、75%酉精+30煙氯酸鈉這兩種組合進行對比滅菌處理，選擇最合適滅菌試劑。b滅菌時間75%酉精滅菌時間均為30s,0.1%升汞滅菌時間分為三個梯度，分別為6min、8min、10min;30喊氯酸鈉則分為兩梯度，分別為20min、30min。從而選擇最佳滅菌試劑以及其最佳滅菌時間。c滅菌流程75%®精+0.1%升汞先用75%酉精浸泡30s,然后用無菌水清洗一次，倒去無菌水后，再用0.1%升汞+12滴吐溫滅菌，滅

25、菌過程中不斷搖動廣口瓶使外植體充分接觸滅菌劑，然后，倒出滅菌劑，用無菌水清洗外植體5-6次,直到外植體上沒有泡沫即可。75嘴精+30噥氯酸鈉先用75%酉精浸泡30s,然后用無菌水清洗一次，倒去無菌水后，再用30%汞+12滴吐溫滅菌，滅菌過程中不斷搖動廣口瓶使外植體充分接觸滅菌劑，然后，倒出滅菌劑，用無菌水清洗外植體5-6次,直到外植體上沒有泡沫即可。3.5.2 金銀花幼嫩莖段的滅菌滅菌前莖段預處理：由于樹型金銀花莖段均為中空結(jié)構(gòu)，且表面披一層較致密絨毛，故在取材時不應(yīng)將材料剪的過短，防止外界細菌以及真菌通過中空管道直接進入莖段內(nèi)部，從而導致滅菌不徹底，另外，由于表面披絨毛，容易沾染微生物，且在

26、滅菌過程中滅菌劑不能很好的與精短表面接觸，故在滅菌處理前可用毛筆蘸取少許洗潔精或者吐溫來回輕輕刷洗其表面絨毛，減少其染菌幾率。a滅菌試劑選用75%酉精+0.1%升汞這一組合進行滅菌。b滅菌時間75%酉精滅菌時間30s,0.1%升汞滅菌時間為6min、8min、10min這三個梯度。c滅菌流程先用75%酉精浸泡30s,然后用無菌水清洗一次，倒去無菌水后，再用0.1%升汞+12滴吐溫滅菌，滅菌過程中不斷搖動廣口瓶使外植體充分接觸滅菌劑，然后，倒出滅菌劑，用無菌水清洗外植體5-6次,直到外植體上沒有泡沫即可。3.5.3 金銀花幼嫩葉片的滅菌滅菌前應(yīng)先用毛筆蘸取吐溫或者洗潔精來回刷洗其正反兩面，應(yīng)輕輕

27、刷洗，洗潔精或者吐溫的量不能太多，加1滴既可，加入過多會使葉片出現(xiàn)類似于被折疊后產(chǎn)生的變色以及變薄現(xiàn)象，可能原因是過量的清潔劑會使葉片細胞受到一定損傷。a滅菌試劑選用75%酉精+0.1%升汞這一組合進行滅菌。b滅菌時間75%酉精滅菌時間30s,0.1%升汞滅菌時間為3min、5min、6min這三個梯度。c滅菌流程先用75%酉精浸泡20s,然后用無菌水清洗一次，倒去無菌水后，再用0.1%升汞+1-2滴吐溫滅菌，滅菌過程中不斷搖動廣口瓶使外植體充分接觸滅菌劑，然后，倒出滅菌劑，用無菌水清洗外植體5-6次,直到外植體上沒有泡沫即可。3.6 外植體的接種3.6.1 芽的接種芽全部采取斜插入培養(yǎng)基的接

28、種方法進行接種。接種前先將滅菌好的冬芽放入已滅菌的帶濾紙的培養(yǎng)皿中，將其表面的水吸干，再用鐐子小心將芽最外層的因滅菌而褐化死亡的葉片剝?nèi)?，然后用解剖刀切去芽基部莖段的一部分制造上口后，將芽小心些插入培養(yǎng)基中即可將其放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)架培養(yǎng)。3.6.2 莖段的接種莖段也全部采取斜插入培養(yǎng)基的接種方法進行接種。接種前先將滅菌好的莖段放入已滅菌的帶濾紙的培養(yǎng)皿中，將其表面的水吸干，再用解剖刀小心將莖段兩端因滅菌而褐化死亡的部分切去，然后再用解剖刀將莖段切成約0.5cm長小段后，小心將這些小段平放在培養(yǎng)基中后，即可將其放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)架上培養(yǎng)。3.6.3 葉片的接種葉片接種前應(yīng)先對葉片進行預處理，首先將

29、滅菌好的葉片放入已滅菌的帶濾紙的培養(yǎng)皿中，在濾紙上吸干葉片表面水分后，用剪刀小心將葉片邊緣剪去薄薄一小圈，然后，用解剖刀將葉片在一部分接種時需要接觸培養(yǎng)基的一面小心輕輕劃上一些小傷口，另一部分不劃，最后用剪刀將葉片剪成0.5cmx0.5cm的小片，準備接種。葉片接種進行兩種接種方法的對比：a葉片正面朝上將一部分反面用解剖刀處理過的小葉片接種在培養(yǎng)基上，反面接觸培養(yǎng)基，而正面朝上接入培養(yǎng)基；另一部分反面沒有用解剖刀劃過傷口的葉片也接種在同樣的培養(yǎng)基上，進行比較；接種好后即可將它們放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)架上培養(yǎng)。b葉片反面朝上將一部分正面用解剖刀處理過的小葉片接種在培養(yǎng)基上，正面接觸培養(yǎng)基，而反面朝上接

30、入培養(yǎng)基；另一部正面沒有用解剖刀劃過傷口的葉片也接種在同樣的培養(yǎng)基上，進行比較；接種好后即可將它們放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)架上培養(yǎng)。3.7 培養(yǎng)條件3.7.1 芽和莖段的培養(yǎng)條件溫度24°C士2C,光照16h黑暗8小時的光暗交替培養(yǎng)，日光燈。3.7.2葉片的培養(yǎng)條件分兩部分進行培養(yǎng)，從而尋找哪種培養(yǎng)條件適合葉片愈傷組織的誘導，以下為兩中對比：a一部分葉片在溫度24C士2C下，暗培養(yǎng)15天左右，再進行光暗交替培養(yǎng)。b另一部分直接放在24C士2C下，光照16h黑暗8小時的光暗交替培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。3.8 試驗觀察與統(tǒng)計3.8.1 數(shù)據(jù)記錄及現(xiàn)象觀察材料接種后，在固定周期內(nèi)對材料的污染率、褐化率

31、、死亡率、愈傷啟動率以及愈傷組織誘導率等情況做觀察記載及必要的統(tǒng)計，并根據(jù)需要調(diào)整試驗步驟。以下為一些數(shù)據(jù)記錄公式：啟動率=未污染外植體啟動數(shù)/未污染外植體總數(shù)x100%污染率=接種污染數(shù)/接種總數(shù)x100%死亡率=未污染死亡數(shù)/未污染總數(shù)X100%褐化率=未污染褐化數(shù)/未污染總數(shù)X100%愈傷組織誘導率=產(chǎn)生愈傷組織的塊數(shù)/接種的總塊數(shù)X100%其中，有部分外植體并未完全褐化，也長出部分愈傷組織，對于此種外植體，記錄數(shù)據(jù)時，既將其當成褐化外植體同時也當成產(chǎn)生愈傷的外植體。3.8.2 數(shù)據(jù)處理與分析用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)的方差分析。實驗五園藝植物莖尖脫毒培養(yǎng)一、目的要求：練習對

32、莖尖外植體的剝離、滅菌和接種等無菌的操作方法，熟悉快速繁殖和獲得無病毒植株的全過程。二、材料用具：超凈工作臺、雙筒解剖鏡、剪刀、鐐子、解剖針、解剖刀、廣口瓶、燒杯、培養(yǎng)皿、酒精燈、升汞、酒精、吐溫20、無菌水、培養(yǎng)基、記號筆、紗布、酒精棉球、溫室盆栽葡萄、菊花的側(cè)芽、不結(jié)球白菜的側(cè)芽等材料。三、說明：植物莖尖處于比較幼嫩的部位，其細胞具有旺盛的生能力，易于培養(yǎng)而獲得成功。莖尖培養(yǎng)根據(jù)其目的不同，取材的大小有較大的差異，較小的僅為十至幾十微米的莖尖分生組織，較大的可利用幾十毫米的莖尖甚至更大的芽，但一般講莖尖愈小(小到50100微米的生度點)培養(yǎng)難度就越大，有的需要一年或更長的時間才能成苗，莖尖

33、越大培養(yǎng)越易獲得成功。如果進行植物快速繁殖，則采用較大的莖尖，以帶有葉原基的生長為宜，這樣既能提高成活率，又能加快繁殖速度，如以脫毒為目的，則采用較小的莖尖，因為病毒在植株上的分布是不均勻，一般幼嫩的組織器官中病毒含量極低，以生長點含病毒最少，甚至不含病毒，所以進行脫毒種苗培養(yǎng)，應(yīng)盡量采用極小的莖尖生長點進行培養(yǎng)，以獲得脫毒苗。四、方法和步驟(以葡萄為例)：(1)選擇品種性狀典型的，生長健壯無病蟲的葡萄植株，取其已萌動的頂芽或腋芽，或剪下35cm生長的莖頂端，剝?nèi)ゴ笕~片，先在流水中沖流23小時，吸干水分，再在70濃醇中浸半分鐘，然后放入0.1%升汞滴加12滴吐溫20的溶液中滅菌5分鐘，用無菌水

34、沖洗35次。(2)在超凈工作臺上把滅菌的莖尖放在雙筒解剖鏡下剝?nèi)ポ^小的葉片，根據(jù)不同目的，可取只帶23個葉原基的生長點甚至不帶葉原基的生長點，或帶23片幼葉的莖尖。生長點剝離方法：在解剖鏡下，一手用鐐子夾住無菌的莖尖，一手用較細的解剖針剝掉生長點外圍的葉片，直至達到晶瑩發(fā)亮的光滑頂為止，然后用解剖刀仔細切取所需莖尖，隨即接種在預先配制好的培養(yǎng)基上。(3)培養(yǎng)基：莖尖分化培養(yǎng)基：MS+BA1mg/L+NAA0.01mg/L+LH100mg/L,生根培養(yǎng)基：MS+IAA0.4mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.1mg/L.莖尖培養(yǎng)對培養(yǎng)容器無特殊要求，一般以15cmx20cm的試管，或50m

35、l三角瓶為宜，每支試管裝10ml培養(yǎng)基，每只三角瓶裝25ml培養(yǎng)基，每管或每瓶接種一個莖尖。(4)培養(yǎng)：接種的莖尖置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，溫度25攝氏度士2攝氏度，光照2000Lux,以日光燈為光源，每天照光10小時。五、作業(yè)：1、每人接種莖尖4個，要求二個剝至帶23個葉原基的生長點。2、定時觀察記錄：幼苗分化和生根情況。3、試述利用莖尖培養(yǎng)為什么能夠脫除病毒。實驗六園藝植物的花藥培養(yǎng)一、目的要求：學習園藝植物花藥的采集、滅菌、接種、培養(yǎng)等一整套花藥培養(yǎng)的具體方法。二、材料用具：蘋果花藥、批杷花藥、不結(jié)球白菜花藥、番茄花藥、四季海棠花藥、天竺葵花藥等，紗布、塑料袋、三角瓶、70%酉精、冰箱、顯微鏡、醋酸洋紅、載玻片、蓋玻片、MSW養(yǎng)基的各種化學藥品。各種滅菌、接種、培養(yǎng)用具和器皿等。三、說明：花藥培養(yǎng)是植物育種的一種有效方法，即用離體花藥培養(yǎng)的方法，使其中的花粉發(fā)育成一個完整的植株，這種花粉植株的染色體數(shù)目為體細胞的一半，稱為單倍體植物，據(jù)統(tǒng)治到1983年止，通過花藥培養(yǎng)已從250多種植物中得到了單倍體植株。利用花藥組織進行單倍體育種對多年生果樹和觀賞樹木而言比一、二年生