組蛋白H2A的研究進展

1、組蛋白H2A的研究進展真核細胞的DNA并不是游離存在的，而是纏繞在組蛋白的外圍，與組蛋白一起構(gòu)成染色質(zhì)的核小體。在染色質(zhì)中，由147個堿基對的DNA在由H2A-H2B二聚體、（H3-H4）2四聚體組成的八聚體上纏繞形成核小體核心32。核小體核心再加上一段含有H1組蛋白的連接DNA就構(gòu)成了染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)核小體。在H1、H2A、H2B、H3和H4五種組蛋白中，H1的種族保守性很低，但有組織特異性，而另外四種組蛋白具有高度的保守性。1組蛋白基因簡介1.1 組蛋白的基礎研究組蛋白的分子量多在10000-20000之間，H1分子量最大，可達到23000。組蛋白是一組等電點大于10.0的堿性蛋白，5種組

2、蛋白都含有大量帶正電的堿性氨基酸賴氨酸和精氨酸，能夠同DNA中帶負電荷的磷酸基團相互作用。其中H3、H4富含精氨酸，H1富含賴氨酸；H2A、H2B介于兩者之間33,34。H2A、H2B、H3、H4均由球形部和尾部構(gòu)成，球形部依靠精氨酸殘基與磷酸二酯骨架間的靜，如基因表達和損傷DNA的修復35。組蛋白基因在各種生物體內(nèi)重復的次數(shù)不一樣，但都在中度重復的范圍內(nèi)。通常每種組蛋白的基因在同一種生物中拷貝數(shù)是相同的。不同生物中組蛋白基因在基因組中的排列不一樣，組蛋白基因沒有一定的排列方式，而在拷貝數(shù)高的基因組中，大部分組蛋白基因串聯(lián)重復形成基因簇?；蚪M中存在大量重復序列用以編碼組蛋白是有其重要意義的。

3、DNA復制時，組蛋白也要成倍增加，而且往往在DNA合成一小段后，組蛋白馬上就要與其相結(jié)合，這要求在較短的時間內(nèi)合成大量的組蛋白，因而需要有大量的組蛋白基因存在。組蛋白作為核小體的基本組分，是染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能必需的。過去相當長一段時間里，人們對組蛋白的認識僅僅只停留在對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的維持方面，是否具有其他生物學功能了解甚少。目前對于組蛋白的研究多集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子以及組蛋白的乙?；?、去乙?；侨绾卧诤诵◇w及整個核內(nèi)區(qū)域改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)方面36,37。核心組蛋白H2A和H2B在細胞內(nèi)的運動比H3和H4要快，這種運動依賴于轉(zhuǎn)錄活動的進行，只有在轉(zhuǎn)錄頻繁發(fā)生的地方，H2A和H2B才會表現(xiàn)出比一般情況下活

4、躍的運動，轉(zhuǎn)錄過程似乎還會影響核小體的結(jié)構(gòu)38。為了研究蛋白分子在細胞內(nèi)的動態(tài)分布狀況，常用的方法是將所研究的蛋白與報告基因構(gòu)建成融合蛋白，使這個融合蛋白在細胞中表達，通過熒光顯微鏡觀察蛋白在細胞內(nèi)的定位及動態(tài)。應用光漂白恢復（FRAP）39技術(shù)可以進一步分析蛋白在細胞內(nèi)的運動速率，擴散系數(shù)以及蛋白之間的相互關系。1.2 組蛋白的變體型研究近十年的研究表明38,40,核小體已不是簡單的“染色質(zhì)上的珠子”，而是染色體特殊化和動態(tài)的參與者。組蛋白成分及其共價修飾決定了核小體的狀態(tài)，進而決定細胞的狀態(tài)，組蛋白的成分除了常規(guī)的H2A、H2B、H3、H4和H1,還包括其他的組蛋白變體。這些組蛋白變體的尾

5、部包含多種修飾位點41-43,可經(jīng)過特定的表觀修飾，改變核小體的空間構(gòu)象和穩(wěn)定性，決定基因轉(zhuǎn)錄的激活或沉默，DNA的修復，染色體的異染色化等。在組蛋白替換過程中，組蛋白變體通過相應的染色質(zhì)重構(gòu)復合物組裝入核小體，不同的變體有著不同的組裝途徑440組蛋白和對應變體的替換是細胞對特定的生理狀態(tài)和所受的刺激的反應。對組蛋白變體的研究是近年來表觀遺傳學研究的新熱點，也是對“組蛋白密碼”的新的詮釋。在真核生物的5種組蛋白中，組蛋白H4是最保守的，至今未發(fā)現(xiàn)變體的存在45,已發(fā)現(xiàn)的H3變體有著絲粒特異的CenH3和轉(zhuǎn)錄激活的核小體中的H3.346,還有精巢特異的H3t47。H2B的變體僅在精細胞中發(fā)現(xiàn)，包

6、括TH2B、TSH2B、H2BFWT,H1的變體是組織特異的或是發(fā)育時期特異的48。而組蛋白H2A是最不保守的，變體最多，H2A-H2B二聚體在低離子強度條件下不穩(wěn)定，更易游離于核小體。已發(fā)現(xiàn)的H2A變體有H2A.Z、H2A.X、macroH2A、H2A-Bbd（Barrbodydeficient）和精巢特異的TH2A共5種。2 H2A蛋白的分子結(jié)構(gòu)及成員種類H2A組蛋白是染色質(zhì)核小體組蛋白核心的成員之一，在細胞內(nèi)H2A主要以4種形式存在49:4%的游離細胞核內(nèi)；3%處于活躍的轉(zhuǎn)錄中,遷移速度很快（t1/2=6min）；40%結(jié)合在染色質(zhì)上，運動慢（t1/2=130min）；53%結(jié)合在異染色

7、質(zhì)上,幾乎不發(fā)生運動（ti/2>530min）。除了主要組成部分H2A1和H2A2外，目前認為還有H2A.Z、H2A.X（80年代發(fā)現(xiàn)）、macroH2A1、macroH2A2（90年代發(fā)現(xiàn)）和H2A-BBD（21世紀初發(fā)現(xiàn)）等5個亞型。與常規(guī)型H2A相比，變體型的差異主要在于C端（如圖）,C端的異質(zhì)性決定了它們功能的不同50:H2AH2AXH2AZmacroH2AH2ABBDH2A.X的竣基端含有一個保守的色氨酸殘基（Ser139）,在DNA雙鏈斷裂修復時發(fā)生磷酸化反應；H2A.Z的末端序列和轉(zhuǎn)錄激活聯(lián)系密切，能防止沉默的蔓延；MacroH2A的C端有較大的球形結(jié)構(gòu)域，在哺乳動物失活的

8、X染色體中大量存在；H2A-BBD的N端和C端變化最大，不包含其它亞型的保守為點，是分子量最小的H2A變體形式，在哺乳動物失活的X染色體中發(fā)生缺失。常規(guī)型H2A和對應變體的替換是細胞對特定的生理狀態(tài)和所受的刺激的反應。處于不同狀態(tài)的染色質(zhì)需要相應的組蛋白變體維持結(jié)構(gòu)，以完成其生物學功能。在H2A的替換過程中，H2A變體通過相應的染色質(zhì)重構(gòu)復合物組裝入核小體，不同的變體有著不同的組裝途徑51,52。組蛋白變體的存在反應了生物體極其靈活而又復雜的生理調(diào)節(jié)機制，其中MacroH2A和H2A-BBD是生物體進化至脊椎動物才出現(xiàn)的亞型53。3 H2A-X的結(jié)構(gòu)特點及功能研究3.1 H2A-X結(jié)構(gòu)特點及主

9、要功能域在大多數(shù)哺乳動物組織和細胞中，H2A.X編碼基因位于11q23.22-q23.3,含量大概占總H2A的2%10%54,在低等真核生物中H2A.X的含量較高，在出芽酵母中幾乎可達到100%。H2A.X多肽鏈有142個氨基酸殘基，比常規(guī)H2A多13個殘基，H2A.X的N端120個殘基與常規(guī)H2A的該段氨基酸序列幾乎完全相同，C端的22個殘基序列與目前已知的脊椎動物H2A家族其他蛋白序列沒有同源性，但是與一些低等真核生物的H2A蛋白的C端序列有同源性。這段同源序列在進化上高度保守，包括一個139位為絲氨酸殘基的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸(Ser-Gln-Glu,SQE)結(jié)構(gòu)域55。Rogako

10、u等國于1998年首先發(fā)現(xiàn)用IR及其他引起DNA雙鏈斷裂的藥物處理細胞后，可引起SQE吉構(gòu)域中的Ser殘基的迅速磷酸化，并將磷酸化的H2AX命名為丫-H2AX。進一步的研究表明，丫-H2AX焦點的形成沒有細胞特異性57,并且無論何種因素誘導的DSBs都伴隨有H2AX的磷酸化和簇集。SQE結(jié)構(gòu)域是H2A.X功能行駛中的關鍵性作用位點，它所包含的Ser殘基可以被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)家族成員毛細血管共濟失調(diào)突變基因(ataxiatelangiectasiamutatedgene,ATM)Rad3相關蛋白(ATMandRad3-rel

11、atedprotein,ATR)及DNA依賴性蛋白激酶(DNA-dependentproteinkinase,DNA-PK)等磷酸化58,磷酸化后的H2A.X標記為丫-H2A.X,這種磷酸化過程伴隨著DNA的斷鏈修復同時進行。過程如下：DNA-PK促進磷酸化的起始，并一直伴隨著信號傳遞，DNA-PK可能在DNA重組的部分特異性磷酸化H2A.X;ATM可能是在DNA雙鏈損傷后主要的必需分子；ATR是在DNA復制停止時出現(xiàn)的。由于加入的磷酸基團帶有二價負電荷，它可以誘導Y-H2A.X磷酸化位點處轉(zhuǎn)錄激活。理論上，解凝區(qū)域酶更容易進入，便于DNA修復復合體聚集到受損位點。另外，Y-H2A.X作為一種

12、化學信號，可以促進后續(xù)反應的進行以及蛋白因子間的相互作用，如在人類細胞中，當DNA雙鏈損傷時59,Rad50/51和BRCAI聚集于T-H2A-X位點。3.2 H2A-X的功能研究H2A.X在DNA出現(xiàn)斷裂時替代常規(guī)H2A,它對DNA修復有重要作用。DNA損傷有許多不同的形式，如堿基修飾、DNA單鏈斷裂(DNAsinglestrandedbreaks,SSBs)、DNA鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)以及DNA雙鏈斷裂(DNAdoublestrandedbreaks,DSBs)等，其中DSBs被認為是DNA最嚴重的損傷。與DNA斷裂相關的很多細胞生物學過程，都會引起H2A.X轉(zhuǎn)錄后的磷酸化修飾60,這些過程包括

13、DNA雙鏈斷裂的修復、配子減數(shù)分裂聯(lián)會復合體中的染色體的交換與重組、免疫球蛋白發(fā)生過程中細胞凋亡中的DNA降解、V(D)J剪切、分類轉(zhuǎn)換重組。另外，H2A.X的高磷酸化也是細胞凋亡的特征之一。細胞自身調(diào)控的程序性DSBs會誘導T-H2AX焦點的形成。這些細胞自身調(diào)控的程序性DSBs包括細胞凋亡、生殖細胞減數(shù)分裂時的DNA重組及哺乳動物免疫系統(tǒng)發(fā)育時DNA重組過程中發(fā)生的DSBs。在細胞凋亡過程中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase齦激活，降解DNase的抑制物ICAD從而激活DNase,DNase再將DNA降解成片段。H2AX的磷酸化和簇集在細胞凋亡過程中是一個普遍存在的現(xiàn)象61,并且和D

14、NA片段的形成緊密相連，協(xié)同發(fā)生。在生殖細胞第一次減數(shù)分裂偶線期中，同源染色體開始配對，形成聯(lián)會復合體。到雙線期時，兩條非姐妹染色單體之間發(fā)生交叉連接而出現(xiàn)重組。這一重組過程是由在細線期形成的Spo112依賴的DSBs起始的。Mahadevaiah62等發(fā)現(xiàn)丫H2AX焦點在Spo11誘導的DSBs位點形成，并隨著同源染色體開始聯(lián)會而消失。另有研究表明，丫-H2A-X也是XY性染色體的凝縮必須的，所以推論染色質(zhì)動態(tài)的變化能導致H2A-X的磷酸化。Sokolov63實驗證明H2A-X陰性鼠雖能成活，但個體發(fā)育生長較小，免疫球蛋白分泌能力低，對電離輻射敏感，月中瘤易感性高，易患T/B淋巴細胞瘤或?qū)嶓w瘤，雄性鼠的生育能力低，H2A-X陰性細胞有絲分裂后基因組缺失率高于H2A-X陽性的細胞，說明H2A-X除了承擔維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能外，還有許多其他特殊的生物學功能。近幾年的研究表明，組蛋白H2A-X在DNA損傷修復、細胞周期