流式分析技術PPT學習教案

1、會計學1流式分析流式分析(fnx)技術技術第一頁，共76頁。第一節(jié) 概述 一、工作原理 二、散射光的測定 三、熒光測量(cling) 四、細胞分選原理第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示(xinsh)與分析 一、參數(shù) 二、數(shù)據(jù)顯示(xinsh)方式 三、設門分析技術第三節(jié) 流式細胞儀免疫分析的技術要求(yoqi)一、免疫檢測樣品制備二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色三、免疫膠乳顆粒的應用四、流式細胞免疫學技術的質量控制第1頁/共76頁第二頁，共76頁。思考題小結(xioji)第2頁/共76頁第三頁，共76頁。流式細胞術(flow cytometry, FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單

2、個細胞理化特性進行(jnxng)多參數(shù)定量分析和分選的新技術。 第3頁/共76頁第四頁，共76頁。 流式細胞術最大的特點(tdin)是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。 細胞不被破壞，測量(cling)快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞術的特點(tdin)第4頁/共76頁第五頁，共76頁?？焖贉y量并可分類收集的高技術。第一節(jié) 概述(i sh)第5頁/共76頁第六頁，共76頁。第6頁/共76頁第七頁，共76頁。細胞組成細胞組成細胞功能細胞功能大小大小細胞表面細胞表面/ /胞漿胞漿/ /核核-特異性抗

3、原特異性抗原粒度粒度細胞活性細胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞內(nèi)細胞因子胞內(nèi)細胞因子蛋白質含量蛋白質含量激素結合位點激素結合位點鈣離子鈣離子, PH, PH值值, , 膜電位膜電位酶活性酶活性流式細胞儀常檢測(jin c)的細胞特性第7頁/共76頁第八頁，共76頁。采用激光(jgung)作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。 一、工作(gngzu)原理 第8頁/共76頁第九頁，共76頁。 （1）

4、液流系統(tǒng)(xtng) （2） 光學系統(tǒng)(xtng) （3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(xtng)1.流式細胞儀的基本(jbn)結構：第9頁/共76頁第十頁，共76頁。（1）液流系統(tǒng)(xtng)第10頁/共76頁第十一頁，共76頁。噴嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液液流系統(tǒng)(xtng)示意圖第11頁/共76頁第十二頁，共76頁。FCM的液流系統(tǒng)（如何(rh)形成單個細胞流）樣本(yngbn)管鞘液管第12頁/共76頁第十三頁，共76頁。n光電倍增管：光電倍增管：FS, SSFS, SS（散射（散射光），光）， FL1, FL2, FL3, FL1, FL2, F

5、L3, FL4FL4（熒光）（熒光）（2）光學系統(tǒng)第13頁/共76頁第十四頁，共76頁。FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector光學系統(tǒng)示意圖第14頁/共76頁第十五頁，共76頁。（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第15頁/共76頁第十六頁，共76頁?；竟ぷ?gngzu)原理第16頁/共76頁第十七頁，共76頁。單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本(jbn)過程第17頁/共76頁第十八頁，共76頁。區(qū)別區(qū)別流式細胞儀流式細胞儀顯

6、微鏡顯微鏡光源光源激光激光自然光、燈光自然光、燈光對象對象細胞、生物粒子細胞、生物粒子細胞、組織等細胞、組織等承載工具承載工具鞘液及流動室鞘液及流動室載玻片載玻片檢測信號檢測信號光學信號光學信號形態(tài)及染色形態(tài)及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大電路、放大電路目鏡目鏡物鏡、光學放大物鏡、光學放大統(tǒng)計統(tǒng)計計算機，計算機，50005000人工，人工，200200結果結果多參數(shù)，綜合分析多參數(shù)，綜合分析簡單，單參數(shù)簡單，單參數(shù)流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別(qbi)第18頁/共76頁第十九頁，共76頁。 細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360立體角方向散射(snsh)的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形

7、狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關，主要分為前向散射(snsh)光和側向散射(snsh)光。二、散射光的測定(cdng)第19頁/共76頁第二十頁，共76頁。第20頁/共76頁第二十一頁，共76頁。第21頁/共76頁第二十二頁，共76頁。FALS SensorLaser前向散射光示意圖第22頁/共76頁第二十三頁，共76頁。側向散射光（side scatter, SS）：激光束照射細胞(xbo)時，光以90角散射的訊號，用于檢測細胞(xbo)內(nèi)部結構屬性。第23頁/共76頁第二十四頁，共76頁。FALS Sensor90LS SensorLaser側向(c xin)散射光示意圖第24頁/共76頁第二十五頁

8、，共76頁。淋巴細胞單核細胞中性(zhngxng)粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別(jinbi)出某些亞群 第25頁/共76頁第二十六頁，共76頁。三、熒光(ynggung)測量第26頁/共76頁第二十七頁，共76頁。激發(fā)(jf)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)第27頁/共76頁第二十八頁，共76頁。第28頁/共76頁第二十九頁，共76頁。熒光(ynggung)補償?shù)?9頁/共76頁第三十頁，共76頁。 通過流式細胞儀進行細胞分選主要(zhyo)是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。四、細胞(xbo)分選原理第30頁/共76頁第三十一頁，共76頁

9、。細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體(jngt)產(chǎn)生(chnshng)機械振動不充電(chng din)充電（一）分選基本原理第31頁/共76頁第三十二頁，共76頁。n分選得率：從一群體細胞懸液分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再中分辨出目的細胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。得率。與分選速度成反比。（二）分選的技術(jsh)要求第32頁/共76頁第三十三頁，共76頁。n第二節(jié) 數(shù)據(jù)(shj)的顯示與分析第33頁/共76頁第三十四頁，共76頁。一、 參數(shù)(cnsh)第34

10、頁/共76頁第三十五頁，共76頁。n直分析(fnx)方圖設門分析(fnx):REGION和GATE設置二、數(shù)據(jù)顯示方式第35頁/共76頁第三十六頁，共76頁。（一）單參數(shù)(cnsh)直方圖第36頁/共76頁第三十七頁，共76頁。單參數(shù)(cnsh)直方圖細胞相對數(shù)量信道(channel )第37頁/共76頁第三十八頁，共76頁。用顆粒密度反映同樣散射光或用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)(cnsh)直方圖第38頁/共76頁第三十九頁，共76頁。1.雙參數(shù)(cnsh)直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度第39頁/共76頁第四十頁，共76頁。雙參

11、數(shù)(cnsh)直方圖點圖第40頁/共76頁第四十一頁，共76頁。2. 二維等高圖第41頁/共76頁第四十二頁，共76頁。二維等高圖第42頁/共76頁第四十三頁，共76頁。3. 假三維等高圖第43頁/共76頁第四十四頁，共76頁。（三）三參數(shù)(cnsh)直方圖第44頁/共76頁第四十五頁，共76頁。（四）流式細胞儀的多參數(shù)(cnsh)分析第45頁/共76頁第四十六頁，共76頁。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形(jxng)門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 三、設門分析(fnx)技術第46頁/共76頁第四十七頁，共76頁。A 淋巴細胞B 單核細胞C 中性(zhngxng)粒細胞A、B、C均

12、為任意(rny)門第47頁/共76頁第四十八頁，共76頁。線性門第48頁/共76頁第四十九頁，共76頁。第49頁/共76頁第五十頁，共76頁。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時，起就可以(ky)由四個區(qū)域構成，即G=D1+D2+D3+D4。 第50頁/共76頁第五十一頁，共76頁。第51頁/共76頁第五十二頁，共76頁。單細胞懸液一、免疫檢測樣品(yngpn)制備第52頁/共76頁第五十三頁，共76頁。第53頁/共76頁第五十四頁，共76頁。二、常用的熒光染料與標記(bioj)染色第54頁/共76頁第五十五頁，共7

13、6頁。FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光(jgung)細胞(xbo)懸液異硫氰酸熒光(ynggung)素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料第55頁/共76頁第五十六頁，共76頁。名稱名稱染料染料激發(fā)激發(fā)波長波長熒光顏熒光顏色色溶解性溶解性對對PHPH敏感敏感性性特點特點異硫氰酸熒異硫氰酸熒光素光素FITCFITC488488綠綠 525525易易敏感敏感易溶于水，與抗體結易溶于水，與抗體結合不影響特異性合不影響特異性得州紅得州紅Texas Texas redred568568紅紅 615615不易不易不敏感不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后

14、量子產(chǎn)穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低額低藻紅蛋白藻紅蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具較多發(fā)光基團，消具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488別藻青蛋白別藻青蛋白APCAPC633633紅紅670670能量傳遞復能量傳遞復合染料合染料PEcy5PEcy5488488紅紅670670易易不敏感不敏感減少交叉，成本高減少交叉，成本高常用的幾類熒光(ynggung)染料第56頁/共76頁第五十七頁，共76頁。能量傳遞(chund)復合染料第57頁/共76頁第五十八頁，共76頁。PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色(

15、hngs)熒光花青(hu qn)苷5藻紅蛋白(dnbi)能量傳遞復合染料機制第58頁/共76頁第五十九頁，共76頁。（二）免疫熒光標記(bioj)第59頁/共76頁第六十頁，共76頁。三、免疫膠乳顆粒(kl)技術的應用第60頁/共76頁第六十一頁，共76頁。微小的乳膠微球分別(fnbi)染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）第61頁/共76頁第六十二頁，共76頁。第62頁/共76頁第六十三頁，共76頁。通過對標記不同(b tn)熒光素分子的檢測，實現(xiàn)FCM對可溶性物質的定量分析第63頁/共76頁第六十四頁，共76頁。（一）單細

16、胞懸液制備(zhbi)的質控第64頁/共76頁第六十五頁，共76頁。（二）免疫熒光染色(rns)的質控第65頁/共76頁第六十六頁，共76頁。n絕對計數(shù)校準絕對計數(shù)校準: : 保證計數(shù)的保證計數(shù)的準確性。準確性。（三）儀器(yq)操作的質控第66頁/共76頁第六十七頁，共76頁。本次實驗結果可靠。本次實驗結果可靠。（四）免疫檢測的質控第67頁/共76頁第六十八頁，共76頁。第68頁/共76頁第六十九頁，共76頁。一、淋巴細胞及其亞群的分析(fnx)第69頁/共76頁第七十頁，共76頁。三、淋巴(ln b)造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案(fng n)、判

17、斷預后及檢出微小殘留病變第70頁/共76頁第七十一頁，共76頁。CD4+Th細胞(xbo)、CD4+/CD8+比例MDR(+)表示對化療(hu lio)藥物耐藥五、AIDS病檢測中的應用第71頁/共76頁第七十二頁，共76頁。HLA-B27可出現(xiàn)(chxin)在58%97%的強直性脊椎炎(As) 患者第72頁/共76頁第七十三頁，共76頁。matching, FCXMmatching, FCXM）和群體反）和群體反應性抗體（應性抗體（Panel reactive Panel reactive antibody, PRAantibody, PRA）檢測。）檢測。第73頁/共76頁第七十四頁，共76頁。思考題1.流式細胞儀的分析檢測原理是什么？2.流式細胞儀分析中前向散射光、側向散射光和熒光的檢測意義。3.何謂熒光補償？何謂“液相芯片”技術？4.細胞分選的基本原理。5.FCM分析中有哪些數(shù)據(jù)顯示方式，如何解讀結果及其設門分析的意義？6.如何進行FCM分析檢測樣品的制備？7.流式細胞分析前如何驗證儀器工作狀態(tài)(zhungti)，采用何種校正物？8.流式細胞免疫分析的質量控制包括哪些方面？9.流式細胞術有哪些臨床應用價值？10.流式細胞儀分析中常見的熒光素有那些？他們的特性如何？第74頁/共76頁第七十五頁，共76頁