Biosynthesis of Nucleic Acids核酸

1、第十三章第十三章 核酸的生物合成核酸的生物合成Biosynthesis of Nucleic Acids 1958 年年 Crick 提出中心法則的概念：提出中心法則的概念：DNA RNAProtein一、一、DNA的生物合成的生物合成1、信息流與中心法則、信息流與中心法則 1961 年年 法國(guó)巴塞爾研究所法國(guó)巴塞爾研究所 Jacob 和和 Monod 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) mRNAProteinDNA RNA復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄1965 年年 破譯了遺傳密碼破譯了遺傳密碼20 世紀(jì)六十年代的信息流概念：世紀(jì)六十年代的信息流概念：轉(zhuǎn)譯轉(zhuǎn)譯翻譯翻譯1970 年年 美國(guó)有兩家實(shí)驗(yàn)室分別獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了美國(guó)有兩家實(shí)驗(yàn)室

2、分別獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了 逆轉(zhuǎn)錄酶。從那時(shí)至今，中心法則概逆轉(zhuǎn)錄酶。從那時(shí)至今，中心法則概 念為：念為：ProteinDNA RNA轉(zhuǎn)譯轉(zhuǎn)譯逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制：DNA（或（或 RNA）以自己為模板，合成與自己）以自己為模板，合成與自己 完全相同的完全相同的 DNA（或（或 RNA）的過(guò)程叫復(fù)制。）的過(guò)程叫復(fù)制。轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄：以：以 DNA 為模板，按堿基配對(duì)原則合成相應(yīng)為模板，按堿基配對(duì)原則合成相應(yīng) RNA鏈的過(guò)程，叫轉(zhuǎn)錄。鏈的過(guò)程，叫轉(zhuǎn)錄。翻譯翻譯：以：以 mRNA 為模板，按為模板，按 mRNA 上每三個(gè)核苷上每三個(gè)核苷 酸決定一個(gè)氨基酸的原則合成特定多肽鏈的酸決定一個(gè)氨基酸

3、的原則合成特定多肽鏈的 過(guò)程叫翻譯（或轉(zhuǎn)譯）。過(guò)程叫翻譯（或轉(zhuǎn)譯）。逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄：以：以 RNA 為模板，按堿基配對(duì)原則合成相應(yīng)為模板，按堿基配對(duì)原則合成相應(yīng) DNA鏈的過(guò)程，叫逆轉(zhuǎn)錄。鏈的過(guò)程，叫逆轉(zhuǎn)錄。 親代親代DNA分子分子2、 DNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制：DNA復(fù)制時(shí)，兩條鏈分開(kāi)，分別復(fù)制時(shí)，兩條鏈分開(kāi)，分別以每一條鏈為模板，按堿基配對(duì)原則，合成對(duì)以每一條鏈為模板，按堿基配對(duì)原則，合成對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)鏈。結(jié)果，由一個(gè)應(yīng)的互補(bǔ)鏈。結(jié)果，由一個(gè) DNA 分子形成了兩分子形成了兩個(gè)與原來(lái)的個(gè)與原來(lái)的 DNA 分子完全相同的分子完全相同的 DNA 分子。分子。由于子代由于子代 DNA 分子中的兩

4、條鏈，一條來(lái)自親代分子中的兩條鏈，一條來(lái)自親代 DNA，另一條是新合成的，所以就稱這種復(fù)制，另一條是新合成的，所以就稱這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。方式為半保留復(fù)制。 15NDNA（14N- -15N）DNA14NDNA（14N- -15N）DNA3、DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方式復(fù)制的起點(diǎn)和方式 復(fù)制子復(fù)制子：基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位：基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位叫復(fù)制子，其含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)，可叫復(fù)制子，其含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)，可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)。能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)。復(fù)制叉復(fù)制叉：DNA合成時(shí)的生長(zhǎng)點(diǎn)。合成時(shí)的生長(zhǎng)點(diǎn)。4、原核生物原核生物 DNA 的復(fù)制的復(fù)制 實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌（實(shí)驗(yàn)材料

5、：大腸桿菌（E.coli）、DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶聚合反應(yīng)有關(guān)的酶、DNA 聚合酶聚合酶 DNA 指導(dǎo)下的指導(dǎo)下的 DNA 聚合酶聚合酶或：或： 依賴于依賴于 DNA 的的 DNA 聚合酶聚合酶 1956年，美國(guó)年，美國(guó)Kornberg（獲（獲1959年諾貝爾獎(jiǎng)）年諾貝爾獎(jiǎng)）（ Kornberg 酶）酶） DNA聚合酶聚合酶：相對(duì)分子質(zhì)量：相對(duì)分子質(zhì)量：103 000，由，由單一鏈組成，活性部位含有單一鏈組成，活性部位含有 Zn2+。DNA 聚合酶聚合酶催化反應(yīng)的條件：催化反應(yīng)的條件：n1dTTP+DNAn4dCTPn3dGTPn2dATPMg2+DNA Pol1dAMPn2dGMPn3dCM

6、Pn4DNA+dTMPn1(n1+n2+n3+n4)PPi引物引物（模板）（模板） 底物（底物（dNTP）、模板（）、模板（DNA）、）、 引物（必須具有游離的引物（必須具有游離的3- -OH）、）、Mg2+DNA 聚合酶聚合酶的特點(diǎn)：的特點(diǎn)： A聚合反應(yīng)具有方向性，新合成鏈的延聚合反應(yīng)具有方向性，新合成鏈的延伸方向?yàn)樯旆较驗(yàn)?5 3聚合反應(yīng)不能從頭開(kāi)始，必須要有引物。聚合反應(yīng)不能從頭開(kāi)始，必須要有引物。新合成鏈的性質(zhì)完全取決于模板鏈的性質(zhì)新合成鏈的性質(zhì)完全取決于模板鏈的性質(zhì) 模板：模板：DNA DNA 聚合酶聚合酶：E.coliDNA 聚合酶聚合酶是一個(gè)多功能的酶：是一個(gè)多功能的酶： 具有從

7、具有從 5 3聚合酶功能聚合酶功能 具有從具有從 3 5核酸外切酶功能核酸外切酶功能 具有從具有從 5 3核酸外切酶功能核酸外切酶功能 DNA聚合酶聚合酶：催化：催化DNA合成的速度只有合成的速度只有體內(nèi)體內(nèi) DNA復(fù)制速度的復(fù)制速度的 1%；持續(xù)合成能力低；許；持續(xù)合成能力低；許多影響多影響DNA復(fù)制的基因突變均與酶復(fù)制的基因突變均與酶無(wú)關(guān)。無(wú)關(guān)。1969 年發(fā)現(xiàn)一年發(fā)現(xiàn)一 E.coli 突變株，突變株，DNA 聚合酶聚合酶活力只活力只有野生型酶活力的有野生型酶活力的 0.51%，其復(fù)制正常進(jìn)行，其復(fù)制正常進(jìn)行，但損傷修復(fù)功能缺陷。但損傷修復(fù)功能缺陷。、DNA 聚合酶聚合酶和和 197019

8、71 年年 DNA 聚合酶聚合酶和和 與聚合酶與聚合酶的的共同點(diǎn)共同點(diǎn)：在聚合反應(yīng)中，要模：在聚合反應(yīng)中，要模板、引物、板、引物、Mg2+、dNTP、聚合方向：、聚合方向：5 3、均、均具有具有 3 5核酸外切酶功能。核酸外切酶功能。 與聚合酶與聚合酶的的區(qū)別區(qū)別：無(wú)：無(wú) 5 3核酸外切酶功核酸外切酶功能。另外，三個(gè)酶的活力（聚合速度、持續(xù)合成能。另外，三個(gè)酶的活力（聚合速度、持續(xù)合成能力）也各不相同。能力）也各不相同。DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因*pol Apol Bpol C=dna E分子數(shù)細(xì)胞分子數(shù)細(xì)胞4001001020不同種類亞基數(shù)目

9、不同種類亞基數(shù)目1710相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量103 00088 000*830 00035核酸外切酶核酸外切酶53核酸外切酶核酸外切酶 聚合速度聚合速度 （核苷酸分）（核苷酸分）1 0001 2002 40015 00060 000持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力32001 500500 000功能功能切除引物、修復(fù)切除引物、修復(fù)修復(fù)修復(fù)復(fù)制復(fù)制 * ：對(duì)于多亞基酶，僅列出聚合活性亞基的結(jié)構(gòu)基因：對(duì)于多亞基酶，僅列出聚合活性亞基的結(jié)構(gòu)基因* ：僅聚合活性亞基。聚合酶：僅聚合活性亞基。聚合酶和和共有許多輔助亞基共有許多輔助亞基 酶酶的溫度敏感條件致死突變株于的溫度敏感條件致死突變株于45以上環(huán)境中，

10、酶以上環(huán)境中，酶將失活。將失活。 酶酶為多亞基酶。為多亞基酶。DNA聚合酶聚合酶全酶由全酶由10個(gè)亞基組成，含有個(gè)亞基組成，含有 Zn 原子。原子。具催化活性具催化活性具具 3 5外外切酶功能切酶功能組建核心酶組建核心酶使核心酶使核心酶二聚化二聚化具依賴具依賴 DNA 的的ATP 酶活酶活力力夾子裝置器，夾子裝置器，幫助幫助 -亞基亞基夾住夾住 DNA滑動(dòng)夾子，使酶滑動(dòng)夾子，使酶具持續(xù)合成能力具持續(xù)合成能力在在 復(fù)合物的幫復(fù)合物的幫助下，助下， 夾子夾夾子夾住模板與引物組住模板與引物組成的雙鏈并轉(zhuǎn)移成的雙鏈并轉(zhuǎn)移到核心酶上，開(kāi)到核心酶上，開(kāi)始始 DNA 復(fù)制。復(fù)制。 -亞基：具聚合酶活性亞基：

11、具聚合酶活性 -亞基：具亞基：具 3 5核酸外切酶校對(duì)功能核酸外切酶校對(duì)功能 -亞基：組建核心酶（亞基：組建核心酶（、 組成核心酶）組成核心酶） （ Tau） -亞基：負(fù)責(zé)核心酶的二聚化亞基：負(fù)責(zé)核心酶的二聚化 -亞基：具依賴亞基：具依賴 DNA 的的ATP 酶活力酶活力 、 （ Chi）及及 （ Psi） -亞基：與亞基：與 -亞亞 基一起形成基一起形成復(fù)合物：夾子裝置器，幫助復(fù)合物：夾子裝置器，幫助 -亞亞 基夾住基夾住 DNA -亞基：形成滑動(dòng)夾子，使酶具持續(xù)合成能力亞基：形成滑動(dòng)夾子，使酶具持續(xù)合成能力具催化活性具催化活性具具 3 5外外切酶功能切酶功能組建核心酶組建核心酶使核心酶使核

12、心酶二聚化二聚化具依賴具依賴 DNA 的的ATP 酶活酶活力力夾子裝置器，夾子裝置器，幫助幫助 -亞基亞基夾住夾住 DNA滑動(dòng)夾子，使酶滑動(dòng)夾子，使酶具持續(xù)合成能力具持續(xù)合成能力在在 復(fù)合物的幫復(fù)合物的幫助下，助下， 夾子夾夾子夾住模板與引物組住模板與引物組成的雙鏈并轉(zhuǎn)移成的雙鏈并轉(zhuǎn)移到核心酶上，開(kāi)到核心酶上，開(kāi)始始 DNA 復(fù)制。復(fù)制。、DNA 聚合酶聚合酶和和 DNA 聚合酶聚合酶和和于于 1999 年發(fā)現(xiàn)，它們年發(fā)現(xiàn)，它們涉及涉及 DNA 的錯(cuò)誤傾向修復(fù)。的錯(cuò)誤傾向修復(fù)。 當(dāng)當(dāng) DNA 受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生這受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，由于這兩個(gè)酶對(duì)兩個(gè)酶，由于這兩個(gè)酶對(duì)

13、DNA 的修復(fù)缺乏準(zhǔn)的修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性，所以出現(xiàn)高的突變率。確性，所以出現(xiàn)高的突變率。 高突變率雖然會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少高突變率雖然會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細(xì)胞得以可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細(xì)胞得以存活。存活。 動(dòng)物及一些噬菌體的能量供體是動(dòng)物及一些噬菌體的能量供體是細(xì)菌的細(xì)菌的能量供體是能量供體是 、DNA 連接酶（多核苷酸連接酶）連接酶（多核苷酸連接酶） 19671968 年在研究環(huán)狀年在研究環(huán)狀 DNA 的復(fù)制時(shí)發(fā)現(xiàn)的復(fù)制時(shí)發(fā)現(xiàn) DNA 連接酶可催化連接酶可催化 DNA 鏈上的缺刻（切口：鏈上的缺刻（切口：nick）封閉）封閉、解鏈蛋白與解旋蛋白、解鏈蛋白

14、與解旋蛋白 （E.coli DNA 長(zhǎng)長(zhǎng) 1 mm。設(shè)其。設(shè)其 30復(fù)制一復(fù)制一代。反方向旋轉(zhuǎn)一圈解開(kāi)代。反方向旋轉(zhuǎn)一圈解開(kāi) 3.4 nm 的的 10 個(gè)堿基個(gè)堿基對(duì)，則每分鐘要旋轉(zhuǎn)：對(duì)，則每分鐘要旋轉(zhuǎn)：1063.43010 000 轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)）、DNA 解螺旋酶（解螺旋酶（解鏈酶解鏈酶：helicase） 由由 ATP 提供能量可解開(kāi)雙螺旋。每消耗提供能量可解開(kāi)雙螺旋。每消耗 2 分子分子ATP，解開(kāi)，解開(kāi) 1 個(gè)個(gè) bp。E.coli 的參與的參與 DNA 復(fù)復(fù)制的解螺旋酶為制的解螺旋酶為 Dna B 蛋白，其沿模板鏈從蛋白，其沿模板鏈從 5 3方向移動(dòng)并解鏈。方向移動(dòng)并解鏈。、單鏈結(jié)合蛋白單

15、鏈結(jié)合蛋白（SSB 蛋白）蛋白） E.coli 的的 SSB 蛋白由蛋白由 4 個(gè)相同的亞基組成。個(gè)相同的亞基組成。其功能在于：其功能在于：穩(wěn)定解開(kāi)的穩(wěn)定解開(kāi)的 DNA 單鏈，阻止復(fù)性單鏈，阻止復(fù)性并保護(hù)單鏈部分不被核酸酶降解并保護(hù)單鏈部分不被核酸酶降解。、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶細(xì)菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA旋轉(zhuǎn)酶：旋轉(zhuǎn)酶：gyrase） 兼具內(nèi)切酶和連接酶的活性。在兼具內(nèi)切酶和連接酶的活性。在 ATP 提供能量的提供能量的情況下，可連續(xù)地引入負(fù)超螺旋，每分鐘可引入情況下，可連續(xù)地引入負(fù)超螺旋，每分鐘可引入約約 100 個(gè)負(fù)超螺旋。在無(wú)個(gè)負(fù)超螺旋。在無(wú) ATP 存在時(shí)，可松弛

16、負(fù)存在時(shí)，可松弛負(fù)超螺旋，但速度較引入負(fù)超螺旋慢超螺旋，但速度較引入負(fù)超螺旋慢 10 倍。倍。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶引入負(fù)超螺旋，可以消除復(fù)制引入負(fù)超螺旋，可以消除復(fù)制時(shí)（復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)）所帶來(lái)的扭曲張力，從而促時(shí)（復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)）所帶來(lái)的扭曲張力，從而促進(jìn)進(jìn) DNA 雙鏈的解開(kāi)。雙鏈的解開(kāi)。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 I：？又名又名RNA聚合酶，可催化引物的合成：以聚合酶，可催化引物的合成：以DNA為模板，以四種為模板，以四種NTP為底物，需要為底物，需要Mg2+、合成、合成方向方向53。E.coli 的引物合成酶為的引物合成酶為Dna G蛋白蛋白IV、引物酶、引物酶、DNA 的復(fù)制過(guò)程的復(fù)制過(guò)程

17、5 3 3 5 3 5 3 5 雙螺旋雙螺旋DNA解螺旋方向解螺旋方向 DNA 復(fù)制時(shí)：復(fù)制時(shí)：5 3模板鏈的復(fù)制問(wèn)題模板鏈的復(fù)制問(wèn)題、DNA的半不連續(xù)復(fù)制和岡崎片段的半不連續(xù)復(fù)制和岡崎片段 DNA 復(fù)制時(shí)的引物復(fù)制時(shí)的引物1968 年年 日本日本 岡崎岡崎 用用 3H 標(biāo)記的脫氧胸苷（標(biāo)記的脫氧胸苷（ 3H- -dTTP DNA）標(biāo)記被）標(biāo)記被 T4 噬菌體感染的噬菌體感染的 E.coli，低溫，低溫（8）下保溫一段時(shí)間，以蔗糖做密度介質(zhì)，）下保溫一段時(shí)間，以蔗糖做密度介質(zhì)，進(jìn)行密度梯度離心。發(fā)現(xiàn)：短時(shí)間內(nèi)合成的都是進(jìn)行密度梯度離心。發(fā)現(xiàn)：短時(shí)間內(nèi)合成的都是較短的較短的 DNA 片段（片段（

18、810S），時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)較），時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)較大的分子（大的分子（70100S）。）。T4 噬菌體的溫度敏感突變株（其噬菌體的溫度敏感突變株（其 DNA 連接連接酶在酶在20時(shí)有正常的活力，在時(shí)有正常的活力，在 44以上時(shí)失活）以上時(shí)失活）在在44條件下培養(yǎng)，條件下培養(yǎng)，E.coli 體內(nèi)積累大量的小片體內(nèi)積累大量的小片段段 DNA。 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈滯后鏈滯后鏈復(fù)制叉移動(dòng)方向復(fù)制叉移動(dòng)方向?qū)槠螌槠螌槠螌槠危褐敢杂H代：指以親代 5 3鏈為模板，沿著鏈為模板，沿著 與復(fù)制叉相反的方向所合成的一些小片段。與復(fù)制叉相反的方向所合成的一些小片段。 原核生物岡崎片段長(zhǎng)：原核生物岡崎片段長(zhǎng)： 真

19、核生物岡崎片段長(zhǎng)：真核生物岡崎片段長(zhǎng)：半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制：DNA 兩條鏈的復(fù)制方式不一樣。兩條鏈的復(fù)制方式不一樣。 一條鏈連續(xù)復(fù)制，另一條鏈不連續(xù)復(fù)制一條鏈連續(xù)復(fù)制，另一條鏈不連續(xù)復(fù)制 半不連續(xù)復(fù)制。半不連續(xù)復(fù)制。前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈：以：以 3 5鏈為模板合成的鏈叫前導(dǎo)鏈鏈為模板合成的鏈叫前導(dǎo)鏈 或領(lǐng)先鏈，該鏈連續(xù)合成?；蝾I(lǐng)先鏈，該鏈連續(xù)合成。滯后鏈滯后鏈：以：以 5 3鏈為模板合成的鏈叫滯后鏈鏈為模板合成的鏈叫滯后鏈 或后續(xù)鏈，該鏈不連續(xù)合成?；蚝罄m(xù)鏈，該鏈不連續(xù)合成。、復(fù)制過(guò)程、復(fù)制過(guò)程 復(fù)制過(guò)程：起始、延長(zhǎng)和終止三個(gè)階段復(fù)制過(guò)程：起始、延長(zhǎng)和終止三個(gè)階段、起始、起始 特定的起始位點(diǎn)：原核

20、生物特定的起始位點(diǎn)：原核生物一個(gè)；真核一個(gè)；真核 生物生物多個(gè)。靠許多酶和蛋白因子共同多個(gè)?？吭S多酶和蛋白因子共同。 E.coli 復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列Dna G 由解旋蛋白和解鏈蛋白催化，由解旋蛋白和解鏈蛋白催化，（復(fù)制眼或復(fù)制泡）（復(fù)制眼或復(fù)制泡）（引物合成酶）（引物合成酶）（解螺旋酶）（解螺旋酶）（識(shí)別起點(diǎn)）（識(shí)別起點(diǎn)）（DNA結(jié)結(jié)合蛋白）合蛋白）（幫助（幫助DnaB結(jié)合于起點(diǎn)）結(jié)合于起點(diǎn)） ATP拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶。 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，合成岡崎片段時(shí)，底物中既有實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，合成岡崎片段時(shí)，底物中既有dNTP，也有，也有NTP。 噬菌體噬菌體M13感染細(xì)菌后，

21、感染細(xì)菌后，DNA合成的啟動(dòng)合成的啟動(dòng)可被利福平抑制。可被利福平抑制。 新合成新合成DNA鏈的鏈的 5 端以共價(jià)鍵連著一小段端以共價(jià)鍵連著一小段RNA。 在前引發(fā)復(fù)合物存在的條件下，引物合成酶在前引發(fā)復(fù)合物存在的條件下，引物合成酶或或RNA聚合酶即可催化引物的合成：以聚合酶即可催化引物的合成：以DNA為為模板，以四種模板，以四種NTP為底物，需要為底物，需要Mg2+、合成方、合成方向向53。E.coli 的引物合成酶為的引物合成酶為Dna G蛋白蛋白 引物長(zhǎng)度：幾個(gè)至十幾個(gè)核苷酸或更多。引物長(zhǎng)度：幾個(gè)至十幾個(gè)核苷酸或更多。、延長(zhǎng)、延長(zhǎng) 由由 DNA 聚合酶聚合酶發(fā)揮發(fā)揮 5 3的聚合功能，的聚

22、合功能，在在RNA引物的引物的 3- -OH端逐個(gè)添加脫氧核苷酸。端逐個(gè)添加脫氧核苷酸。前導(dǎo)鏈和滯后鏈同時(shí)合成，前者持續(xù)合成，后前導(dǎo)鏈和滯后鏈同時(shí)合成，前者持續(xù)合成，后者分段合成。者分段合成。、終止、終止 切除引物、填補(bǔ)缺口（切除引物、填補(bǔ)缺口（gap）。邊切邊補(bǔ)，）。邊切邊補(bǔ)，由由 DNA 聚合酶聚合酶發(fā)揮發(fā)揮 5 3外切酶的功能及外切酶的功能及 5 3聚合酶的功能來(lái)完成。聚合酶的功能來(lái)完成。 最后由最后由 DNA 連接酶將各個(gè)岡崎片段連接連接酶將各個(gè)岡崎片段連接成完整的成完整的 DNA 鏈。鏈。、復(fù)制的真實(shí)性（忠實(shí)性）、復(fù)制的真實(shí)性（忠實(shí)性）、DNA聚合酶的選擇作用和校對(duì)功能：聚合酶的選擇

23、作用和校對(duì)功能： 第一重校對(duì)：按堿基配對(duì)原則選擇核苷酸第一重校對(duì)：按堿基配對(duì)原則選擇核苷酸 第二重校對(duì)：第二重校對(duì)： 3 5外切酶的校對(duì)功能外切酶的校對(duì)功能、引物合成的作用：、引物合成的作用： DNA聚合的起始階段，聚合的起始階段，5末端通常不穩(wěn)定，末端通常不穩(wěn)定，此時(shí)合成此時(shí)合成RNA引物，雖然出現(xiàn)錯(cuò)配的可能性大，引物，雖然出現(xiàn)錯(cuò)配的可能性大，但在完成引物功能后就被切除，代之以高保真的但在完成引物功能后就被切除，代之以高保真的DNA鏈。鏈。5、真核生物、真核生物 DNA 的復(fù)制的復(fù)制 真核生物真核生物 DNA 與組蛋白構(gòu)成核小體，以染色質(zhì)與組蛋白構(gòu)成核小體，以染色質(zhì)形式存在于細(xì)胞核中。其復(fù)制

24、大致過(guò)程與形式存在于細(xì)胞核中。其復(fù)制大致過(guò)程與E.coli 相似：相似： 復(fù)制方式：半保留復(fù)制復(fù)制方式：半保留復(fù)制 具體復(fù)制過(guò)程：半不連續(xù)復(fù)制具體復(fù)制過(guò)程：半不連續(xù)復(fù)制 聚合反應(yīng)：由聚合反應(yīng)：由 DNA 聚合酶催化（聚合酶催化（ Mg2+、模板、引、模板、引 物、物、dNTP、聚合方向：、聚合方向：5 3） 復(fù)制過(guò)程也需各種解鏈蛋白和解旋蛋白的參與、復(fù)制過(guò)程也需各種解鏈蛋白和解旋蛋白的參與、RNA引物引物與原核生物與原核生物 DNA 復(fù)制的不同之處：復(fù)制的不同之處： 、真核生物的復(fù)制起始點(diǎn)、真核生物的復(fù)制起始點(diǎn) 有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行雙向復(fù)制。有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行雙向復(fù)制。 E.co

25、li 每個(gè)復(fù)制叉移動(dòng)速度為每個(gè)復(fù)制叉移動(dòng)速度為 50 000 bpmin 哺乳動(dòng)物復(fù)制叉移動(dòng)速度為哺乳動(dòng)物復(fù)制叉移動(dòng)速度為1 0003 000bpmin 真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前，不再重新真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前，不再重新開(kāi)始復(fù)制（真核生物在快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的開(kāi)始復(fù)制（真核生物在快速生長(zhǎng)時(shí)，往往采用更多的復(fù)制起點(diǎn)）；而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，起點(diǎn)可以復(fù)制起點(diǎn)）；而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。DNA聚合聚合酶酶 （）DNA聚合聚合酶酶 （M）DNA聚合聚合酶酶（）定位定位細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體線粒體細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核亞基數(shù)目亞

26、基數(shù)目41221外切酶活性外切酶活性無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)3 5外切酶外切酶3 5外切酶外切酶3 5外切酶外切酶引物合成酶活引物合成酶活性性有有無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力中等中等高高高高有有PCNA時(shí)高時(shí)高高高抑制劑抑制劑蚜腸霉素蚜腸霉素雙脫氧雙脫氧TTP 雙脫氧雙脫氧TTP蚜腸霉素蚜腸霉素蚜腸霉素蚜腸霉素功能功能修復(fù)修復(fù)線粒體線粒體DNA復(fù)制復(fù)制修復(fù)、填修復(fù)、填補(bǔ)缺口補(bǔ)缺口PCNA：增殖細(xì)胞核抗原，相當(dāng)于：增殖細(xì)胞核抗原，相當(dāng)于 E.coli DNA聚合酶聚合酶的的 亞基（亞基（夾子）夾子） RP-A相當(dāng)于原核的相當(dāng)于原核的SSB蛋白；蛋白；RF-C相當(dāng)于原核的相當(dāng)于原核的 復(fù)合物復(fù)合物、真

27、核生物的、真核生物的 DNA 聚合酶聚合酶、真核生物的岡崎片段和引物長(zhǎng)、真核生物的岡崎片段和引物長(zhǎng) 岡崎片段：岡崎片段：100200 個(gè)堿基，引物：約個(gè)堿基，引物：約 10 個(gè)堿基個(gè)堿基、真核生物、真核生物DNA復(fù)制具復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制復(fù)制具復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制（6）端粒）端粒DNA復(fù)制復(fù)制5、DNA 的損傷修復(fù)的損傷修復(fù)最多見(jiàn)的是：最多見(jiàn)的是：T T、DNA 損傷損傷 在一些因素的影響在一些因素的影響下，下，DNA 正常的雙螺旋正常的雙螺旋結(jié)構(gòu)造到破壞，使其功結(jié)構(gòu)造到破壞，使其功能受到影響，從而引起能受到影響，從而引起生物突變，甚至導(dǎo)致死生物突變，甚至導(dǎo)致死亡亡 DNA 損傷的原因損傷的原因、物理因素

28、：紫外線、物理因素：紫外線、 電離輻射、各種放電離輻射、各種放 射性射線射性射線、化學(xué)因素：、化學(xué)因素： 烷基化試劑烷基化試劑 化學(xué)化學(xué) 誘變劑誘變劑 亞硝酸類化亞硝酸類化 合物合物、生物因素：黃曲霉、生物因素：黃曲霉 素等素等（造成（造成 AP 位點(diǎn)）位點(diǎn)）、損傷修復(fù)、損傷修復(fù) 在一定條件下，生物機(jī)體能使其在一定條件下，生物機(jī)體能使其 DNA 的損的損傷得到修復(fù)，這就叫傷得到修復(fù)，這就叫 ，這是生，這是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中獲得的一種保護(hù)功能。物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中獲得的一種保護(hù)功能。 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞對(duì) DNA 損傷的修復(fù)系統(tǒng)有五種：直接損傷的修復(fù)系統(tǒng)有五種：直接修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)和易

29、錯(cuò)修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)和易錯(cuò)修復(fù)。修復(fù)。、直接修復(fù)（光復(fù)活修復(fù)）、直接修復(fù)（光復(fù)活修復(fù)） 機(jī)制：可見(jiàn)光（最有效波長(zhǎng)機(jī)制：可見(jiàn)光（最有效波長(zhǎng)400nm）激活）激活了了，它能分解由于紫外線照射所形成，它能分解由于紫外線照射所形成的嘧啶二聚體。的嘧啶二聚體。、切除修復(fù)（暗修復(fù)）、切除修復(fù)（暗修復(fù)） 所謂切除修復(fù)，就是在一系列酶的作用下，所謂切除修復(fù)，就是在一系列酶的作用下，切除損傷部位而代之以正常的結(jié)構(gòu)。切除修復(fù)切除損傷部位而代之以正常的結(jié)構(gòu)。切除修復(fù)可對(duì)多種損傷進(jìn)行修復(fù)?？蓪?duì)多種損傷進(jìn)行修復(fù)。 切除修復(fù)的方式：切除修復(fù)的方式： 先切后補(bǔ)與先補(bǔ)后切。先切后補(bǔ)與先補(bǔ)后切。 切除修復(fù)包括兩

30、個(gè)過(guò)程：一是由細(xì)胞內(nèi)特切除修復(fù)包括兩個(gè)過(guò)程：一是由細(xì)胞內(nèi)特異的酶找到異的酶找到DNA的損傷部位，切除含有損傷結(jié)的損傷部位，切除含有損傷結(jié)構(gòu)的核酸鏈；二是修復(fù)合成并連接。構(gòu)的核酸鏈；二是修復(fù)合成并連接。 原核生物擔(dān)負(fù)損傷修復(fù)的主要酶：原核生物擔(dān)負(fù)損傷修復(fù)的主要酶：DNA聚合酶聚合酶 真核生物承擔(dān)損傷修復(fù)的主要酶：真核生物承擔(dān)損傷修復(fù)的主要酶：DNA聚合酶聚合酶 和和DNA聚合酶聚合酶 ：短片段修復(fù)、長(zhǎng)片短片段修復(fù)、長(zhǎng)片段修復(fù)段修復(fù) 細(xì)胞切除修復(fù)系統(tǒng)和癌癥的關(guān)系：細(xì)胞切除修復(fù)系統(tǒng)和癌癥的關(guān)系： ：患者皮膚缺乏與核苷患者皮膚缺乏與核苷酸切除修復(fù)有關(guān)的酶，對(duì)紫外線引起的酸切除修復(fù)有關(guān)的酶，對(duì)紫外線引起

31、的DNA損傷不能修復(fù)。因此切除修復(fù)系統(tǒng)的損傷不能修復(fù)。因此切除修復(fù)系統(tǒng)的障礙可能是引起癌癥的一個(gè)原因。障礙可能是引起癌癥的一個(gè)原因。 在某些情況下無(wú)法為修復(fù)提供正確的模在某些情況下無(wú)法為修復(fù)提供正確的模板，復(fù)制叉遇到未修復(fù)的損傷鏈，正常的復(fù)板，復(fù)制叉遇到未修復(fù)的損傷鏈，正常的復(fù)制過(guò)程受阻，此時(shí)將進(jìn)行制過(guò)程受阻，此時(shí)將進(jìn)行或易錯(cuò)修或易錯(cuò)修復(fù)（暗修復(fù)）。復(fù)（暗修復(fù)）。AABBBBAAaaabbb6、細(xì)菌的限制、細(xì)菌的限制- -修飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括二類酶活性：修飾甲基化酶和該系統(tǒng)包括二類酶活性：修飾甲基化酶和限制性內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶。 類型類型酶：酶：多亞基雙功能酶，對(duì)多亞基雙功能酶，對(duì)D

32、NA的甲的甲基化和切割由同一酶完成?；颓懈钣赏幻竿瓿?。 類型類型酶：酶：兩個(gè)亞基雙功能酶，兩個(gè)亞基雙功能酶，M亞基負(fù)亞基負(fù)責(zé)識(shí)別與修飾，責(zé)識(shí)別與修飾，R亞基負(fù)責(zé)切割。亞基負(fù)責(zé)切割。 類型類型酶：酶：最重要、應(yīng)用最多的修飾最重要、應(yīng)用最多的修飾-限限制系統(tǒng)，其修飾、限制活性由分開(kāi)的兩個(gè)酶來(lái)制系統(tǒng)，其修飾、限制活性由分開(kāi)的兩個(gè)酶來(lái)完成。完成。、限制性內(nèi)切酶、限制性內(nèi)切酶 、屬于核酸內(nèi)切酶，作用于雙鏈、屬于核酸內(nèi)切酶，作用于雙鏈 DNA。 ds DNA 5- G A A T T C - 3 3- C T T A A G - 5、識(shí)別位點(diǎn)具特殊核苷酸序列、識(shí)別位點(diǎn)具特殊核苷酸序列 一般由一般由4

33、6個(gè)核苷酸組成，呈回文結(jié)個(gè)核苷酸組成，呈回文結(jié)構(gòu)（構(gòu)（180旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)或叫二元對(duì)稱結(jié)構(gòu)）旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)或叫二元對(duì)稱結(jié)構(gòu)） Eco R的識(shí)別序列的識(shí)別序列、切口、切口 齊頭切口：產(chǎn)生平頭末端齊頭切口：產(chǎn)生平頭末端 交錯(cuò)切口：產(chǎn)生粘性末端交錯(cuò)切口：產(chǎn)生粘性末端 粘性末端處，堿基相互配對(duì)，在一定條件粘性末端處，堿基相互配對(duì)，在一定條件下，能重新配對(duì)組成下，能重新配對(duì)組成 dsDNA ，在基因工程中，在基因工程中，粘性末端具有重要作用。粘性末端具有重要作用。 5- G A A T T C - 3 3- C T T A A G - 5MeMe、修飾甲基化酶、修飾甲基化酶 ds DNA 修飾甲基化酶與限制

34、性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)相同。修飾甲基化酶與限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)相同。其作用：將其中某一堿基甲基化，使該序列不被限其作用：將其中某一堿基甲基化，使該序列不被限制性內(nèi)切酶識(shí)別。制性內(nèi)切酶識(shí)別。 Eco R的識(shí)別序列的識(shí)別序列 修飾甲基化酶識(shí)別同一序列修飾甲基化酶識(shí)別同一序列 甲基化酶作用時(shí)甲基的供體：甲基化酶作用時(shí)甲基的供體：S腺苷甲硫腺苷甲硫氨酸，甲基的受體：氨酸，甲基的受體：DNA 分子上的分子上的 A 或或 C。 限制限制-修飾系統(tǒng)僅在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)修飾系統(tǒng)僅在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)意義：意義：在基因工程中：限制性在基因工程中：限制性內(nèi)切酶可作為切割內(nèi)切酶可作為切割DNA分子的手術(shù)刀，可制

35、作分子的手術(shù)刀，可制作DNA限制酶譜，分離限制片段，進(jìn)行限制酶譜，分離限制片段，進(jìn)行 DNA體外體外重組等，是十分有用的工具酶。重組等，是十分有用的工具酶。 1975 年，限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)者：年，限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)者：Smith 獲諾貝爾獎(jiǎng)。獲諾貝爾獎(jiǎng)。7、基因工程與、基因工程與 DNA 克隆克隆 對(duì)攜帶遺傳信息的分子進(jìn)行設(shè)計(jì)對(duì)攜帶遺傳信息的分子進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的分子工程，包括基因重組、克隆和表達(dá)。和施工的分子工程，包括基因重組、克隆和表達(dá)。其核心是構(gòu)建重組其核心是構(gòu)建重組 DNA。 將將 DNA 的限制酶切片插入克隆的限制酶切片插入克隆載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖，以獲得相載體，導(dǎo)入宿主

36、細(xì)胞，經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖，以獲得相同同 DNA 擴(kuò)增分子的過(guò)程。擴(kuò)增分子的過(guò)程。 也叫分子克隆。也叫分子克隆。 將外源將外源 DNA 帶入宿主細(xì)胞并進(jìn)帶入宿主細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制的運(yùn)載工具。通常由質(zhì)粒、病毒或一段染行復(fù)制的運(yùn)載工具。通常由質(zhì)粒、病毒或一段染色體色體 DNA 經(jīng)改造而成。經(jīng)改造而成。該質(zhì)粒帶有給定的該質(zhì)粒帶有給定的 DNA 片段（具抗藥片段（具抗藥性）性）含有帶抗藥性質(zhì)粒含有帶抗藥性質(zhì)粒的細(xì)菌能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌能夠生長(zhǎng)鑒定并擴(kuò)大培養(yǎng)鑒定并擴(kuò)大培養(yǎng)純化質(zhì)粒純化質(zhì)粒 DNA 通過(guò)在細(xì)菌中生長(zhǎng)可擴(kuò)增百萬(wàn)以上，當(dāng)細(xì)菌通過(guò)在細(xì)菌中生長(zhǎng)可擴(kuò)增百萬(wàn)以上，當(dāng)細(xì)菌增殖期結(jié)束后，分離純化雜交的質(zhì)粒增殖期結(jié)束后，分離

37、純化雜交的質(zhì)粒 DNA ，并，并用同一限制酶進(jìn)行酶切，即可得到原來(lái)的用同一限制酶進(jìn)行酶切，即可得到原來(lái)的 DNA 片段的拷貝。片段的拷貝。8、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)與）技術(shù)與 DNA 擴(kuò)增擴(kuò)增 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的體外酶促擴(kuò)增，也的體外酶促擴(kuò)增，也叫無(wú)細(xì)胞分子克隆法。叫無(wú)細(xì)胞分子克隆法。 PCR技術(shù)中每一循環(huán)均包括三階段反應(yīng)：技術(shù)中每一循環(huán)均包括三階段反應(yīng)：（兩條鏈分開(kāi)）（兩條鏈分開(kāi)）（模板（模板- -引物二者堿基配對(duì)）引物二者堿基配對(duì)）（DNA聚合酶以聚合酶以 4 種種 dNTP 為底物，在為底物，在引物引導(dǎo)下合成與模板互補(bǔ)的引物引導(dǎo)下合成與模板互

38、補(bǔ)的DNA）。重復(fù)此過(guò)）。重復(fù)此過(guò)程，程，DNA 以指數(shù)方式擴(kuò)增。以指數(shù)方式擴(kuò)增。二、二、RNA的生物合成（轉(zhuǎn)錄）和加工的生物合成（轉(zhuǎn)錄）和加工 也叫也叫 DNA 指導(dǎo)下的指導(dǎo)下的 RNA 合成，即以合成，即以 DNA 為模板，在為模板，在 RNA 聚合酶的催化下，合成聚合酶的催化下，合成 RNA 的過(guò)程。的過(guò)程。1、原核生物、原核生物 RNA 的合成的合成、原核生物的、原核生物的 RNA 聚合酶聚合酶 1960年前后年前后 RNA 聚合酶，該酶也叫依賴聚合酶，該酶也叫依賴于于 DNA 的的 RNA 聚合酶，或叫聚合酶，或叫 DNA 指導(dǎo)下的指導(dǎo)下的 RNA 聚合酶。聚合酶。(n1+n2+n3

39、+n4)PPi AMPn1+ CMPn4 UMTPn3 GMPn2RNA Pol2+Mgn2GTPn3UTPn4CTPDNA+n1ATP2+or MnRNA 聚合酶催化反應(yīng)的條件：聚合酶催化反應(yīng)的條件： 以以 4 種種 NTP 為底物、需要適當(dāng)?shù)臑榈孜?、需要適當(dāng)?shù)?DNA 鏈鏈為模板、需要二價(jià)金屬離子（為模板、需要二價(jià)金屬離子（Mg2+ 或或 Mn2+），），聚合反應(yīng)方向：聚合反應(yīng)方向：5 3。 RNA 聚合酶可以啟動(dòng)新鏈的合成；且無(wú)外聚合酶可以啟動(dòng)新鏈的合成；且無(wú)外切酶活性，故無(wú)校正與修復(fù)功能。切酶活性，故無(wú)校正與修復(fù)功能。 在催化聚合反應(yīng)時(shí)：在催化聚合反應(yīng)時(shí)：RNA 聚合酶以雙鏈聚合酶以雙

40、鏈 DNA 為模板時(shí)的活性要大于單鏈為模板時(shí)的活性要大于單鏈 DNA。、轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性、轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性 在體內(nèi)，在體內(nèi)，DNA 兩條鏈中僅有一條可用于轉(zhuǎn)兩條鏈中僅有一條可用于轉(zhuǎn)錄，或者某些區(qū)域以這條鏈轉(zhuǎn)錄，另一些區(qū)域錄，或者某些區(qū)域以這條鏈轉(zhuǎn)錄，另一些區(qū)域以另一條鏈轉(zhuǎn)錄，這就叫以另一條鏈轉(zhuǎn)錄，這就叫轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性。 用于轉(zhuǎn)錄的鏈用于轉(zhuǎn)錄的鏈模板鏈（負(fù)（）鏈、非模板鏈（負(fù)（）鏈、非編碼鏈、反義鏈），與模板鏈對(duì)應(yīng)的鏈為編碼鏈編碼鏈、反義鏈），與模板鏈對(duì)應(yīng)的鏈為編碼鏈（正（正（+）鏈、有義鏈）。）鏈、有義鏈）。 編碼鏈與編碼鏈與 RNA 鏈堿基序列相同，僅以鏈堿基序列相同，僅以 U 代

41、代替替 T。編碼鏈無(wú)轉(zhuǎn)錄功能，只能進(jìn)行復(fù)制。但現(xiàn)。編碼鏈無(wú)轉(zhuǎn)錄功能，只能進(jìn)行復(fù)制。但現(xiàn)在認(rèn)為：編碼鏈對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程可能具有調(diào)節(jié)作用。在認(rèn)為：編碼鏈對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程可能具有調(diào)節(jié)作用。G、轉(zhuǎn)錄過(guò)程、轉(zhuǎn)錄過(guò)程 轉(zhuǎn)錄過(guò)程可人為分為四個(gè)階段：轉(zhuǎn)錄過(guò)程可人為分為四個(gè)階段：模板的識(shí)模板的識(shí)別別、轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始、轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄的延伸及及轉(zhuǎn)錄的終止轉(zhuǎn)錄的終止。 、模板的識(shí)別、模板的識(shí)別 模板鏈上每轉(zhuǎn)錄一個(gè)模板鏈上每轉(zhuǎn)錄一個(gè)RNA，就要有一個(gè)特，就要有一個(gè)特殊的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)即殊的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)即啟動(dòng)子啟動(dòng)子。 RNA 聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段 DNA 序列就叫序列就叫。 上游上游

42、 10 下游下游 35（識(shí)別位點(diǎn)）（識(shí)別位點(diǎn)）（緊密結(jié)合位點(diǎn)）（緊密結(jié)合位點(diǎn)）+1（起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)）（起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)） 、轉(zhuǎn)錄的起始、轉(zhuǎn)錄的起始 在轉(zhuǎn)錄泡上，開(kāi)始聚合反應(yīng)，合成在轉(zhuǎn)錄泡上，開(kāi)始聚合反應(yīng)，合成 RNA 鏈最鏈最初的初的 29 個(gè)核苷酸。第一個(gè)核苷酸往往是帶有三個(gè)核苷酸。第一個(gè)核苷酸往往是帶有三個(gè)磷酸基的鳥(niǎo)苷或腺苷（個(gè)磷酸基的鳥(niǎo)苷或腺苷（pppG 或或 pppA），隨后），隨后 因子脫離核心酶，起始階段結(jié)束。因子脫離核心酶，起始階段結(jié)束。pppG+ pppNpppGpN-OH、轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng) 因子的脫落，使核心酶可以離開(kāi)啟動(dòng)因子的脫落，使核心酶可以離開(kāi)啟動(dòng)子沿著子沿著 DNA

43、分子向前移動(dòng)，解鏈區(qū)也跟著移分子向前移動(dòng)，解鏈區(qū)也跟著移動(dòng)，動(dòng)，RNA 鏈得以不斷延長(zhǎng)。鏈得以不斷延長(zhǎng)。RNA 鏈延伸方向：鏈延伸方向：5 3，延伸速度：，延伸速度：2550 核苷酸秒。核苷酸秒。 RNA 聚合酶能夠局部解開(kāi)聚合酶能夠局部解開(kāi) DNA 的兩條鏈，并以的兩條鏈，并以其中的一條鏈為模板，在其上合成出互補(bǔ)鏈。其中的一條鏈為模板，在其上合成出互補(bǔ)鏈。、轉(zhuǎn)錄的終止、轉(zhuǎn)錄的終止 DNA 分子上終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)分子上終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)特殊的特殊的核苷酸序列叫核苷酸序列叫。 在在 Nus A 因子的幫助下，核心酶識(shí)別轉(zhuǎn)因子的幫助下，核心酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，停止錄終止信號(hào)，停止 RNA 鏈的延長(zhǎng)。酶與

44、鏈的延長(zhǎng)。酶與 RNA 鏈離開(kāi)模板，鏈離開(kāi)模板，DNA 恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)?；謴?fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)。4、RNA 生物合成的抑制劑生物合成的抑制劑、嘌呤和嘧啶類似物、嘌呤和嘧啶類似物 例如：例如： 6-巰基嘌呤巰基嘌呤 5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶 NNNNSHNNOOF 作用：酶的抑制劑；或滲入核酸分子。作用：酶的抑制劑；或滲入核酸分子。、DNA 模板功能的抑制物模板功能的抑制物 一些化合物能夠與一些化合物能夠與 DNA 結(jié)合，使之失去模板功結(jié)合，使之失去模板功能，從而抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能，從而抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、烷基化試劑、烷基化試劑、放線菌素、放線菌素 有抗菌和抗癌有抗菌和抗癌作用。作用。 放線菌素放線菌素 D能

45、能與與 DNA 形成非共價(jià)形成非共價(jià)的復(fù)合物，是原核的復(fù)合物，是原核及真核及真核 RNA 聚合酶聚合酶的專一性抑制劑。的專一性抑制劑。、嵌入染料、嵌入染料 具扁平芳香族發(fā)色團(tuán)，可插入到具扁平芳香族發(fā)色團(tuán)，可插入到 dsDNA 相相鄰堿基對(duì)之間，是鄰堿基對(duì)之間，是 RNA 聚合酶的抑制劑。并能聚合酶的抑制劑。并能在插入后使在插入后使 DNA 復(fù)制時(shí)缺失或增添一個(gè)核苷酸，復(fù)制時(shí)缺失或增添一個(gè)核苷酸，從而導(dǎo)致移碼突變從而導(dǎo)致移碼突變、RNA 聚合酶的抑制物聚合酶的抑制物 利福平（利福霉利福平（利福霉素素B衍生物）及利鏈菌衍生物）及利鏈菌素均是細(xì)菌素均是細(xì)菌 RNA 聚合聚合酶的抑制劑，能與細(xì)酶的抑制

46、劑，能與細(xì)菌菌 RNA 聚合酶的聚合酶的 - -亞亞基結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)基結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中鏈的延長(zhǎng)反錄過(guò)程中鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)。應(yīng)。 -鵝膏蕈堿是從毒蘑菇中提取出來(lái)的一種鵝膏蕈堿是從毒蘑菇中提取出來(lái)的一種八肽化合物，它是真核生物八肽化合物，它是真核生物 RNA 聚合酶的抑聚合酶的抑制劑。主要通過(guò)抑制真核制劑。主要通過(guò)抑制真核 RNA 聚合酶聚合酶而阻而阻斷真核生物蛋白質(zhì)的合成。斷真核生物蛋白質(zhì)的合成。5、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工 由由 RNA 聚合酶剛轉(zhuǎn)錄出來(lái)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，聚合酶剛轉(zhuǎn)錄出來(lái)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，通常不具生物活性，叫通常不具生物活性，叫 RNA 前體前體。RNA 前體經(jīng)前體經(jīng)一

47、系列的變化成為成熟分子的過(guò)程，叫一系列的變化成為成熟分子的過(guò)程，叫 RNA 的的成熟成熟或或轉(zhuǎn)錄后的加工轉(zhuǎn)錄后的加工。、rRNA 前體的加工前體的加工、原核生物、原核生物 rRNA 前體的加工前體的加工 原核生物原核生物 rRNA 前體為前體為 30S rRNA，內(nèi)含，內(nèi)含 5S、23S 及及 16S rRNA以及一個(gè)或幾個(gè)以及一個(gè)或幾個(gè) tRNA，需進(jìn)，需進(jìn)行復(fù)雜的剪接加工。行復(fù)雜的剪接加工。（主要在核糖上）（主要在核糖上）、真核生物、真核生物 rRNA 前體的加工前體的加工 哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物 rRNA 前體為前體為 45S rRNA，內(nèi)含，內(nèi)含 5.8S、28S 及及 18S rRNA。其

48、加工過(guò)程類似于原核生物。其加工過(guò)程類似于原核生物。 rRNA 前體合成、加工及裝配成核糖體的場(chǎng)所在前體合成、加工及裝配成核糖體的場(chǎng)所在核仁。核仁。 真核生物真核生物5S rRNA的基因也是排列成行，由的基因也是排列成行，由 RNA聚合酶聚合酶轉(zhuǎn)錄，經(jīng)適當(dāng)加工后與轉(zhuǎn)錄，經(jīng)適當(dāng)加工后與28S及及18S rRNA及相關(guān)蛋白質(zhì)組裝成核糖體大亞基；及相關(guān)蛋白質(zhì)組裝成核糖體大亞基；18S rRNA與相關(guān)蛋白質(zhì)組裝成核糖體小亞基，再通過(guò)核與相關(guān)蛋白質(zhì)組裝成核糖體小亞基，再通過(guò)核孔轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)參與核糖體循環(huán)。孔轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)參與核糖體循環(huán)。（主要在核糖上）（主要在核糖上）、tRNA 前體的加工前體的加工、原核生

49、物、原核生物 tRNA 前體的加工前體的加工 由核酸內(nèi)切酶在由核酸內(nèi)切酶在 tRNA 的兩端切斷的兩端切斷 由核酸外切酶從由核酸外切酶從 3端逐個(gè)切去附加的序端逐個(gè)切去附加的序列，進(jìn)行修剪列，進(jìn)行修剪 在在 tRNA 的的 3端加上端加上 - -C- -C- -AOH 序列序列 核苷酸的修飾與異構(gòu)化核苷酸的修飾與異構(gòu)化內(nèi)切酶內(nèi)切酶5端成熟酶端成熟酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶外切酶外切酶3端成熟酶端成熟酶I、真核生物、真核生物 tRNA 前體的加工前體的加工 與原核生物類似的與原核生物類似的 RNase P 切除切除 5端的附端的附加序列，加序列，3端附加序列的切除則需多種內(nèi)切酶端附加序列的切除則需多種內(nèi)切酶

50、和外切酶的共同作用。和外切酶的共同作用。 真核生物真核生物 tRNA 前體前體 3端不含端不含 CCA 序列，序列，所以也需加工上去。所以也需加工上去。 核苷酸的修飾與異構(gòu)化核苷酸的修飾與異構(gòu)化 有居間序列（內(nèi)含子）的要將該序列切除有居間序列（內(nèi)含子）的要將該序列切除、mRNA 前體（前體（hnRNA）的加工）的加工 原核生物原核生物 mRNA 一般不需加工，即可直接一般不需加工，即可直接作為模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。作為模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。 真核生物的真核生物的mRNA為單順?lè)醋?。大多?shù)蛋為單順?lè)醋?。大多?shù)蛋白質(zhì)基因存在居間序列（內(nèi)含子），且由于真白質(zhì)基因存在居間序列（內(nèi)含子），且由于真核生物

51、成熟核生物成熟 mRNA 結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，故真核生物結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，故真核生物 mRNA 前體具復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后加工。前體具復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后加工。 真核生物真核生物mRNA 前體的一般加工過(guò)程：前體的一般加工過(guò)程：、 5端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu) m7G5ppp 5N1mpN2p、3末端的產(chǎn)生和多聚腺苷酸化末端的產(chǎn)生和多聚腺苷酸化、mRNA 內(nèi)部的甲基化內(nèi)部的甲基化 主要是主要是 N6 甲基腺嘌呤（甲基腺嘌呤（m6A）、mRNA 前體的剪接前體的剪接 切除內(nèi)含子，將外顯子準(zhǔn)確地連接起來(lái)切除內(nèi)含子，將外顯子準(zhǔn)確地連接起來(lái) 這是基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。這是基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)。 剪接需在拼接體形成之后

52、才能進(jìn)行，剪接需在拼接體形成之后才能進(jìn)行，snRNA（U族族 RNA）及幾十種蛋白質(zhì)參與此過(guò)程）及幾十種蛋白質(zhì)參與此過(guò)程6、RNA 復(fù)制復(fù)制 RNA 復(fù)制：復(fù)制：RNA 指導(dǎo)下的指導(dǎo)下的 RNA 合成。合成。 RNA 病毒：病毒： 一般一般 RNA病毒：以釋放毒病毒：以釋放毒素的形式使宿主得病，在宿主體內(nèi)增殖到一定程素的形式使宿主得病，在宿主體內(nèi)增殖到一定程度后，使宿主細(xì)胞破裂死亡；度后，使宿主細(xì)胞破裂死亡；致癌致癌 RNA 病毒：病毒：能引起鳥(niǎo)類、哺乳類等動(dòng)物白血病、肉瘤或其他能引起鳥(niǎo)類、哺乳類等動(dòng)物白血病、肉瘤或其他腫瘤的病毒。這類病毒浸染細(xì)胞后可使細(xì)胞發(fā)生腫瘤的病毒。這類病毒浸染細(xì)胞后可使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。惡性轉(zhuǎn)化。 RNA 復(fù)制酶催化反應(yīng)的條件：復(fù)制酶催化反應(yīng)的條件： 以以 4 種種 NTP 為底物、以為底物、以 RNA 鏈為模板、需鏈為模板、需要二價(jià)金屬離子（要二價(jià)金屬離子（Mg2+ 或或 Mn2+），聚合反應(yīng)方），聚合反應(yīng)方向：向：5 3。 RNA 復(fù)制酶也叫復(fù)制酶也叫