HPLC測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法驗(yàn)證

1、精益生產(chǎn)精益生產(chǎn) 智能管理智能管理HPLC測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法確認(rèn)發(fā)言人：程紅波日期：2016-3-15方法確認(rèn)方法確認(rèn)（HPLC法）目的：目的：證明HPLC方法適合于重組人粒細(xì)胞 刺激因子蛋白質(zhì)含量檢測(cè)要求依據(jù)：依據(jù)：中國(guó)藥典2015年版洗脫梯度洗脫梯度（2015年版中國(guó)藥典）按下表進(jìn)行梯度洗脫 編號(hào)編號(hào)時(shí)間時(shí)間/分分A/%B/%1060402402080345010045060405606040A：0.1%三氟乙酸的水溶液 B： 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液 含量計(jì)算公式含量計(jì)算公式供試品蛋白質(zhì)含量（ug/ml)=CRAXnXARnR式中 CR為復(fù)溶所得標(biāo)準(zhǔn)品溶液的蛋白質(zhì)含量， ug/ml；

2、AR為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均峰面積； AX為供試品溶液的平均峰面積； nR為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的稀釋倍數(shù)； nX為供試品溶液的倍數(shù)； 方法比較方法比較（ lowry與HPLC）Folin-酚（酚（lowry）HPLC要求人為精確控制操作時(shí)間要求人為精確控制操作時(shí)間設(shè)備控制時(shí)間，減少人為誤差設(shè)備控制時(shí)間，減少人為誤差操作復(fù)雜，干擾因素較多操作復(fù)雜，干擾因素較多操作簡(jiǎn)便，干擾因素較少操作簡(jiǎn)便，干擾因素較少重復(fù)性、精密度較差重復(fù)性、精密度較差重復(fù)性、精密度較好重復(fù)性、精密度較好只適用于檢測(cè)原液的蛋白質(zhì)含量只適用于檢測(cè)原液的蛋白質(zhì)含量適用于原液及成品的蛋白質(zhì)含量適用于原液及成品的蛋白質(zhì)含量/2015年版年版中國(guó)藥典

3、中國(guó)藥典首次規(guī)定的首次規(guī)定的檢測(cè)方法檢測(cè)方法方法比較方法比較（lowry與HPLC）批序號(hào)批序號(hào)lowrylowry法（法（ug/ml)ug/ml)HPLCHPLC法法(ug/ml)(ug/ml)原液批原液批1 11477147714171417原液批原液批2 21393139313581358原液批原液批3 31432143213791379原液批原液批4 41466146614131413原液批原液批5 51389138913271327原液批原液批6 61456145614151415原液批原液批7 71395139513521352原液批原液批8 81428142813861386結(jié)論

4、：結(jié)論：lowrylowry法與法與HPLCHPLC法所測(cè)得的濃度存在一定的差異！法所測(cè)得的濃度存在一定的差異！色譜圖比較色譜圖比較工作標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖例供試品色譜圖例25.75725.688重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（出峰時(shí)間）（出峰時(shí)間）批序號(hào)批序號(hào)類(lèi)別類(lèi)別規(guī)格（規(guī)格（ug/mlug/ml）平均峰出峰時(shí)間平均峰出峰時(shí)間 RSDRSD值值(%)(%)/ /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品757525.546 25.546 0.057 0.057 / /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品15015025.537 25.537 0.038 0.038 / /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品30030025.535 25.535 0.023 0.023 原液批原液批1

5、 1供試品供試品30030025.541 25.541 0.050 0.050 成品批成品批1 1供試品供試品757525.544 25.544 0.048 0.048 成品批成品批2 2供試品供試品15015025.506 25.506 0.033 0.033 成品批成品批3 3供試品供試品30030025.594 25.594 0.040 0.040 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：RSD值值1%，符合，符合2015年版年版中國(guó)藥典中國(guó)藥典要求要求重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（峰面積）（峰面積）實(shí)驗(yàn)結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：RSD值值1%，符合，符合2015年版年版中國(guó)藥典中國(guó)藥典要求要求批序號(hào)批序號(hào)類(lèi)別類(lèi)別規(guī)格規(guī)格平

6、均峰面積平均峰面積RSD值值/標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品75ug/ml4406.24 0.08%/標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品150ug/ml4610.70 0.13%/標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品300ug/ml4722.04 0.53%原液批原液批1供試品供試品300ug/ml4749.36 0.52%成品批成品批1供試品供試品75ug/ml4559.72 0.58%成品批成品批2供試品供試品150ug/ml5063.89 0.23%成品批成品批3供試品供試品300ug/ml5372.14 0.40%精密度實(shí)驗(yàn)精密度實(shí)驗(yàn)（出峰時(shí)間）（出峰時(shí)間）批序號(hào)批序號(hào)類(lèi)別類(lèi)別規(guī)格（規(guī)格（ug/ml)ug/ml)平均峰面積平均峰面積RSDRSD值（

7、值（% %）分析員分析員A A 分析員分析員B B 分析員分析員A A 分析員分析員B B/ /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品757525.51125.51125.53425.5340.032 0.032 0.056 0.056 / /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品15015025.53725.53725.56725.5670.077 0.077 0.061 0.061 / /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品30030025.56125.56125.58125.5810.062 0.062 0.033 0.033 原液批原液批2 2供試品供試品30030025.55425.55425.54425.5440.035 0.035 0.047 0.047

8、 成品批成品批4 4供試品供試品30030025.53825.53825.53625.5360.035 0.035 0.048 0.048 成品批成品批5 5供試品供試品15015025.57925.57925.66725.6670.064 0.064 0.073 0.073 成品批成品批6 6供試品供試品757525.56425.56425.81825.8180.059 0.059 0.043 0.043 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：RSD值值2%，符合，符合2015年版年版中國(guó)藥典中國(guó)藥典要求要求精密度實(shí)驗(yàn)精密度實(shí)驗(yàn)（峰面積）（峰面積）批序號(hào)批序號(hào)類(lèi)別類(lèi)別規(guī)格規(guī)格（ug/ml)ug/ml)平均峰面

9、積平均峰面積RSDRSD值（值（% %）分析員分析員A A 分析員分析員B B 分析員分析員A A 分析員分析員B B/ /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品75753660.263660.26 3677.383677.381.30 1.30 1.11 1.11 / /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品1501503715.153715.15 3722.893722.891.27 1.27 0.97 0.97 / /標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品3003003478.193478.19 3500.133500.130.93 0.93 1.59 1.59 原液批原液批2 2供試品供試品3003003424.813424.81 3434.333434.331.84 1.84 1.06 1.06 成品批成品批4 4供試品供試品3003004513.684513.68 4538.384538.381.28 1.28 0.99 0.99 成品批成品批5 5供試品供試品1501504273.844273.84 4333.334333.331.26 1.26 1.01 1.01 成品批成品批6 6供試品供試品75753832.753832.75 3839.973839.971.10 1.10 1.66 1.66 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：RSD值值2%，符合，符合2015年版年版中國(guó)藥典中國(guó)藥典要求要求1、 通過(guò)對(duì)峰面積及出峰時(shí)間