DNA重組的載體簡介

1、載體制備目的片段用限制性酶消化，去磷酸化膠純化質(zhì)粒純化限制性消化膠純化 將目的片段 克隆 到載體上轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌目的片段與載體連接或退火轉(zhuǎn)化非表達(dá)型宿主菌篩選陽性克??；菌落PCR，制備質(zhì)粒DNA,通過測定序列閱讀框，或進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄/翻譯誘導(dǎo)/轉(zhuǎn)化目的蛋白檢測質(zhì)粒穩(wěn)定性（選擇性操作）確定細(xì)胞及亞細(xì)胞組分，表達(dá)時(shí)間和溫和條件，分析蛋白溶解性及活性用SDS-PAGE、Western blot，定量分析，確定目的蛋白 放大實(shí)驗(yàn)純化目的蛋白放大培養(yǎng)制備粗蛋白親和純化切去融合標(biāo)簽并純化 將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞的核酶工具。一個(gè)完整的載體包含：內(nèi)切酶基因位點(diǎn)、標(biāo)記基因、抗性基因、無功能區(qū)域等表達(dá)載體

2、載體克隆載體原核表達(dá)載體真核表達(dá)載體植物表達(dá)載體特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列大腸桿菌表達(dá)載體：含啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號啟動(dòng)子：trp-lac(tac)啟動(dòng)子、噬菌體PL啟動(dòng)子、T7噬菌體啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-binding site,RBS)：起始密碼子(ATG)和SD序列轉(zhuǎn)錄終止序列 為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力 為外源細(xì)胞提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制和整合能力 為外源基因提供在受體細(xì)胞中的擴(kuò)增和表達(dá)能力 具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性和親和性 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別的切割位點(diǎn) 具有合適的選擇性

3、標(biāo)記概念： 質(zhì)粒（Plasmid）是一類存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中能獨(dú)立于染色體DNA而自主復(fù)制的共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA分子，也稱為cccDNA。基本特征自主復(fù)制性可擴(kuò)增性可轉(zhuǎn)移性不相容性1. 刪除不必要的DNA區(qū)域，盡量縮小質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量2. 滅活某些質(zhì)粒的編碼基因3. 加入易于識別的選擇性標(biāo)記基因4. 在選擇性標(biāo)記基因內(nèi)引入具有多種限制性內(nèi)切酶識別和切割位點(diǎn)，同時(shí)刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)5. 加裝特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件 質(zhì)粒圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 外源基因外源基因 終止子終止子 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 報(bào)告基因報(bào)告基因 終止子終止子 （標(biāo)記基因）（標(biāo)記基因） 目的片段目的片段 選擇

4、標(biāo)記選擇標(biāo)記 載體載體堿溶法將菌體懸浮于含有EDTA的緩沖溶液中加入溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁加入SDS-NaHO混合液，去膜釋放胞內(nèi)含物加入高濃度的醋酸鉀緩沖溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)離心取上清液，用苯酚-氯仿溶液處理，去除蛋白質(zhì)和核酸酶用乙醇或異丙醇沉淀水相的質(zhì)粒DNA用不含有DNase的Rnase降解殘余的RNA小分子沸水浴法用牙簽將生長在固體培養(yǎng)基上的菌體劃取少許，懸浮在含有EDTA、TritonX-100、溶菌酶的緩沖液中沸水浴中保溫3040s常溫離心，用牙簽挑去沉淀物乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA 縮短野生型-DNA的長度，提高外源DNA片段的有效裝載量 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 滅活某些與裂解周期有關(guān)的基因（生物污染） 引入合適的選擇標(biāo)記基因，便于重組噬菌體的檢測 在含有乳糖和氯化鎂的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌受體細(xì)胞至對數(shù)生長期 加入合適滴度的重組噬菌體懸浮液，37保溫1h 用新鮮的LB培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，繼續(xù)培養(yǎng)412h，此時(shí)培養(yǎng)液逐漸有渾濁變澄清，大腸桿菌細(xì)胞已經(jīng)完全被裂解 用固