熒光報告基因試驗

1、熒光報告基因實驗一、什么是熒光素酶和雙熒光素酶?熒光素酶報告基因檢測是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(FireflyLuciferase)活性的一種報告系統。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence,可通過熒光測定儀設備測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，常應用于miRNA靶基因驗證及啟動子轉錄活性調控等方向研究。利用熒光素酶與底物結合發(fā)生化學發(fā)光反應的特性，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構建成熒光素酶報告質粒。然后轉

2、染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。螢火蟲熒光素酶是從甲蟲(Photinuspyralis)中分離得到，分子量為61kDa；海腎熒光素酶(RenillaLuciferase)則是從海腎(Renillareniformis)中分離，分子量為36kDa。(一)兩種酶的區(qū)別?1 .底物和輔因子不同：螢火蟲熒光素酶需要熒光素、氧氣、ATP和鎂離子同時存在才能發(fā)光；而海腎熒光素酶僅需要腔腸素(coelenterazin*和氧氣。.CQQHFir«(|ylucif

3、ecSMs*CQ?+Uight2 .發(fā)光的顏色不同：螢火蟲熒光素酶產生的光顏色呈現黃綠色，波長550-570nm；而海腎熒光素酶產生藍光，波長480nm。正是由于這兩種酶的底物和發(fā)光顏色不同，所以在雙報告實驗中得到廣泛應用。(二)為什么采用雙熒光素酶報告系統？單報告基因實驗往往會受到各種實驗條件的影響，而雙報告基因則通過共轉染的對照”作為內參為試驗提供一基準線，從而可以在最大程度上減小細胞活性和轉染效率等外在因素對實驗的影響，使得數據結果更為可信。一般情況下，海腎熒光素酶基因作為內參使用，將帶有海腎熒光素酶基因的質粒與報告基因質粒共轉染細胞；或是將兩個報告基因構建到同一個質粒上，分別用不同的啟

4、動子啟動其表達。計算結果時，將螢火蟲熒光素酶的檢測值比上海腎熒光素酶檢測值(FireflyLuciferase/RenillaLuciferase),這樣就可以減少內在變化因素對實驗準確性的影響，相當于做了標準化，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。(三)雙熒光素酶報告基因檢測有哪些常用的載體?1 .兩種熒光素酶分別位于兩個載體上。比如研究miRNA的靶基因實驗時，這兩種載體分別為：(1) pMIR-REPORT載體：它用來插入miRNA靶序列，評估細胞內miRNA功能。該載體包含一個CMV啟動子控制下的螢火蟲熒光素酶報告基因。在熒光素酶基因的3'UTR區(qū)域包含一個多克隆位點，用于插入預

5、測miRNA的結合靶序列或其他核甘酸序列。若熒光素酶活性下降，說明該段插入序列受到miRNA調節(jié)，這模仿了miRNA靶序列的作用方式。Purcncin-v；.LU£M中值pMIRREPORTLUCireraseAmptcilFin-CIWPromoder(2) pRL系列載體(以pRL-CMV為例)，pRL系列載體可在哺乳動物細胞中組成型地表達海腎熒光素酶。又如，研究轉錄因子和啟動子的實驗時，兩種載體分別為：(1) pGL4.20載體，pGL4.20載體含Luciferase熒光素酶報告基因，無啟動子，用于研究目的啟動子的功能，在熒光素酶基因的上游包含一個多克隆位點，用于插入啟動子序

6、列，若Luciferase熒光素酶活性上升，說明該段啟動子受到轉錄因子的調控。(2) pRL系列載體。svokai&pcilyTAjsiglSnthFPicpol/iM30?0BamHI領帕加a信仃61刖缶1口即用e國怕|tariwbCHQroijiHdreduction!ACg65IKpnVEcolCRlSkINrelECORV2.兩種熒光素酶位于同一個載體上。這樣偏差更小，畢竟轉染一個質粒比轉染兩個質粒要容易，在這方面，根據檢索到的資料顯示，現在的這類質粒比較有名的是Promega公司的pmirGLO質粒。、雙熒光素酶報告系統有哪些應用?（一）驗證microRNA同某基因mRNA靶

7、向互作。將待測mRNA的3'UTFff列插入報告基因載體，再共轉入該microRNA,如果螢光素酶活性下降，則提示為其靶序列。*U【RliKiteraextniRNAJllll.3,UTRlucifeie（二）驗證microRNA同IncRNA靶向互作。將候選的IncRNA序列插入報告基因載體中F-Luc的3'UTRE域，檢測螢光素酶活性。（三）驗證特定轉錄因子同其調控序列的作用。將該序列（通常為啟動子區(qū)域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉過表達該轉錄因子，可分析轉錄因子過表達是否提高螢光素酶活性。promotorluciferaseTranscripTionfactor

8、promotoi'hicifemse（四）啟動子結構分析。將啟動子區(qū)域序列（通常2k左右）進行分段截短，或對特定位點進行突變，再分別構建入luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。（五）啟動子SNP分析。一些基因的啟動子區(qū)域存在單核甘酸多態(tài)性，可運用螢光素酶報告系統分析其相對活性。（六）可以分析信號通路是否激活。將該信號通路的下游響應原件序列構建入報告基因載體，在不同上游信號條件下，螢光素酶活性代表了通路的下游響應。如將HIF1a的響應原件hypoxia-responsiveelement（HRE）插入luciferase報告載體構建穩(wěn)轉細胞株，可以用于低氧相關通路的研究。又如，

9、在GPCR研究中，將cAMPresponseelement（CRE）載入報告基因載體，構建穩(wěn)定表達細胞株后，可以用于分析GPCR的激活與抑制劑篩選。三、實驗步驟（以驗證GeneA為miRNA的靶基因為例）主要分為：質粒轉染細胞一雙報告基因檢測一統計學分析。1 .需要的病毒或者質粒：miRNA-Ctrl/miRNA-OE（miRNA的ctrl和OE可以提前包好病毒）pMIR-REPORT（不插入任何片段，作為control）pMIR-REPORT-WT（將GeneA的3'UT麗入pMIR-REPORT）pMIR-REPORT-MT（將GeneA的3'UTRS變后插入pMIR-RE

10、PORT）pMIR-REPORT-miRNApos（將miRNA的反向互補序列插入，作為陽性對照）pRL-CMV（作為內參）（根據實驗需要也可以再設置siRNA組）2 .實驗步驟（以24孔板為例） Day1種細胞于24孔板 Day2病毒感染（根據實驗加入一定量的miRNA-Ctrl/miRNA-OE） Day3Report質粒轉染（以24孔板一個孔為例，實驗時可配置成Mix逐孔加入以減少誤差）：25ulopti-MEM+300ngplasmid+10ngpRL-CMV25ulopti-MEM+0.45ullip20006h后血液（實驗分組可參考下圖，每個組可以設置3個重復孔）miRNA-Clr

11、lmiRNA-OE Day4雙報告基因檢測（1）1XcoldPBS清洗一遍，力口入80-100ullysisbuffer（buffer用量可以根據細胞量進行調整）；（2）在搖床上冰上被動裂解30min；（3） 4C,12000rpm離心10min；（4）吸取上清10ul于luciferase專用96孔板;（5）依次加入50ulFireflyLuciferaseBuffer（FB）或50ulRenillaLuciferaseBuffer（RB）（RB中加入腔腸素，現用現加,FB和RB可在441室再加入）；（6）酶標儀檢測發(fā)光。四、數據分析（以miRNA調控靶基因的實驗為例）1 .先計算出每孔的F

12、ireflyLuciferase/RenillaLuciferase的比值（F/R,第4列和第10列）；2 .求出miRNA-Ctrl三個重復孔的平均值（下圖第5列average。；3 .再以miRNA-Ctrl組的average1為標準1,用miRNA-OE組的F/R三個重復值（第10歹U）分別除以average1得到三個ratio（相當于進行了一個標準化）;4 .求出ratio的平均值作為average25 .分別用average1和average2的值作柱狀圖。mlbiNA-CTnFRF/Raverape1SOFRFRmoaerage2SD2/zee036919Q_26S666。.諛CW

13、11<74502O.2547760.94477-11076101Q152083control174KW0.2351&4contrcH124737211.2J3T31117fl701科?？?1407S0130?«0fi7104079636466球口.522412060C1S10066951220765070.338173056510605523650393102w34425512WT2229sai?03B31B706珈的341552240G53H42230619202T221/045354S96224使U.旬七州0<17166J.UJ2&S1牌，3H971.

14、3000/21.362/fSb也1181g33MI8/32200o.aesoaaMTaarr3&irC.G29&271.M61108S5迎0444724簽94454110505175124D7O314035900JD2377970.240743,0044734326«090.C653650.2715150313157339631miRNAp:,13465474024589iriRNA產S14P6093O.O&435913695TM023BM35437103007447H317M4五、常見問題分析正是由于報告基因檢測結果受多種因素影響，如載體狀態(tài)、細胞狀態(tài)、轉染

15、量、轉染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等，一旦某個細節(jié)處理不好，都可能導致實驗失敗或結果的不準確。（一）熒光值過高熒光值過高可通過以下方式嘗試解決:1 .減少質粒轉染量；2 .細胞樣品裂解后，離心取上清后可適當稀釋后檢測。注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實的表達水平，否則會造成檢測結果出現大的偏差。(二)熒光值過低若檢測到的熒光值比較低或無熒光值，可從樣品裂解效率、轉染效率、檢測過程等這幾方面進行考慮：1.轉染效率低(1)優(yōu)化轉染實驗條件；(2)確保轉染DNA的質量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質量進行鑒定；(3)選擇活性較高，處于指數分

16、裂期的細胞進行轉染。2 .檢測過程操作不規(guī)范(1)需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會造成檢測結果出現很大偏差；(2)室溫反應。反應時各個組分(細胞裂解產物，底物工作液等)都需要調整到室溫；(3)熒光素酶的半衰期一般約30min,加完底物后可立即檢測，盡量在30min內完成。3 .底物氧化失效(1)底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20C保存；海腎熒光素酶底物推薦-80C保存；(2)反應工作液建議現用現配。(三)復孔重復性差報告基因檢測實驗受多種因素影響，因此同批次樣品檢測值也可能出現浮動。除了引入另一個報告基因作為內參照避免實驗條件變化的干擾之外，一般還需設置3個復孔。想要得到一個準確

17、的結果，應盡可能減小復孔之間的差異性：1 .細胞裂解后建議離心取上清，保證樣本的均一性；2 .保證加樣的準確性，移液器需定期校準，確保移液精準；注：熒光素酶報告基因實驗的檢測結果非常靈敏，復孔之間的數值有一定差異是正常的，一般認為在同一個數量級的差異是可以接受的。六、熒光素酶報告基因還有哪些其他用法？熒光素酶基因還可以用來標記細胞和活體動物，步驟如下： 將熒光素酶基因插到預期分析的細胞染色體內； 通過單克隆細胞技術的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉移、分化時，熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達； 將標記好的細胞接種到實驗動物體內后，當外源(腹腔或靜脈注射)給予其底物熒光素(l

18、uciferin),即可在幾分鐘內產生發(fā)光現象。這種酶在ATP,氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內才會產生發(fā)光現象，并且發(fā)光光強度與標記細胞的數目線性相關。熒光素酶報告基因標記活體動物的應用領域：(1)月中瘤學：熒光素酶報告基因活體成像能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種癌癥模型中月中瘤的生長、轉移以及對藥物的反應。非常適合于月中瘤體內生長的定量分析，避免宰殺老鼠。(2)干細胞與免疫學：螢火蟲熒光素酶報告基因做示蹤標記干細胞，將目的基因與螢火蟲熒光素酶基因融合融合表達，做成轉基因小鼠，進行干細胞移植，可以用活體生物發(fā)光成像技術示蹤干細胞在體內的增殖、分化及遷徙的過程?？梢酝ㄟ^標記免疫細胞，觀察免疫細胞對月中瘤細胞等的識別和殺死功能，評價免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等。(3)蛋白質相互作用：可利用動物體內生物發(fā)光成像技術研究活體動物體內蛋白與蛋白的相互作用。其原理是將分開時都不單獨發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個不同的