ELISA檢測(cè)乙肝抗體HBsAb

1、肝表面抗體肝表面抗體ELISA檢測(cè)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪康?.1.掌握掌握ELISAELISA的原理和操作方法。的原理和操作方法。2.2.熟悉酶標(biāo)儀的使用方法。熟悉酶標(biāo)儀的使用方法。免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是用是用熒光素、酶熒光素、酶、或者、或者放射性核素放射性核素等標(biāo)記抗體或等標(biāo)記抗體或抗原，利用標(biāo)記技術(shù)的高度敏感性進(jìn)行的抗原抗體的反應(yīng)。抗原，利用標(biāo)記技術(shù)的高度敏感性進(jìn)行的抗原抗體的反應(yīng)。Y細(xì)胞1細(xì)胞2標(biāo)記物標(biāo)記物熒光素?zé)晒馑胤派院怂胤派院怂孛该阜派涿庖呒夹g(shù)放射免疫技術(shù)免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù) 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。用酶標(biāo)記的抗原或

2、抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 可用酶標(biāo)測(cè)定可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光密度（儀測(cè)定光密度（ODOD）來反應(yīng)抗原或抗體含量，靈敏度可達(dá)到）來反應(yīng)抗原或抗體含量，靈敏度可達(dá)到ng-pg/mlng-pg/ml水平。水平。Y酶酶酶具有高效催化性酶具有高效催化性：可以加快化學(xué)反應(yīng)的速度：可以加快化學(xué)反應(yīng)的速度 ；在反應(yīng)前后，；在反應(yīng)前后，沒有質(zhì)和量的改變；微量的酶便可發(fā)揮巨大的催化作用。沒有質(zhì)和量的改變；微量的酶便可發(fā)揮巨大的催化作用。 DH2 + H2O2D + 2H2O酶酶無色無色有色有色 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶免疫組化法酶免疫組化法用于檢測(cè)可溶性抗用于檢測(cè)可溶性抗原或抗體原或抗

3、體用于檢測(cè)組織中或用于檢測(cè)組織中或細(xì)胞表面的抗原細(xì)胞表面的抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-ELISA ELISA是一種免疫測(cè)定（是一種免疫測(cè)定（immunoassay，IA）。）。 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記；抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記； 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物；加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物；產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。性或定量分析。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-ELISA 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 抗原或抗體吸附到固相載體表面后，以及抗原抗體與抗原

4、或抗體吸附到固相載體表面后，以及抗原抗體與酶連接后，仍保持免疫活性和酶活性，當(dāng)酶遇到相應(yīng)底物酶連接后，仍保持免疫活性和酶活性，當(dāng)酶遇到相應(yīng)底物時(shí)，在酶的催化下引起底物水解顯色。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中時(shí)，在酶的催化下引起底物水解顯色。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行進(jìn)行定定性或定量分析。性或定量分析。 此法的特異性及靈敏度與熒光及同位素標(biāo)記相似，但此法的特異性及靈敏度與熒光及同位素標(biāo)記相似，但其方法較以上兩者簡便，且不需特殊貴重儀器。因此，這其方法較以上兩者簡便，且不需特殊貴重儀器。因此，這項(xiàng)技術(shù)目前正越來越廣泛地被應(yīng)用到醫(yī)學(xué)

5、的各個(gè)領(lǐng)域中。項(xiàng)技術(shù)目前正越來越廣泛地被應(yīng)用到醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域中。ELISAELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：方法中有三個(gè)必要的試劑：（1 1）固相的抗原或抗體，即）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑免疫吸附劑 （immunosorbentimmunosorbent）；）；（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為 結(jié)合物結(jié)合物 （conjugateconjugate）；）；（3 3）酶反應(yīng)的底物。）酶反應(yīng)的底物。ELISAELISA的類型的類型 間接法（間接法（測(cè)抗體測(cè)抗體） 雙抗體夾心法（

6、雙抗體夾心法（測(cè)大分子抗原測(cè)大分子抗原） 競爭法（競爭法（測(cè)小分子抗原測(cè)小分子抗原） 間接法間接法將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原；將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原；加酶標(biāo)抗體：與固相抗原抗體復(fù)合物中的加酶標(biāo)抗體：與固相抗原抗體復(fù)合物中的 抗體結(jié)合，使該抗體問接地標(biāo)記上酶；抗體結(jié)合，使該抗體問接地標(biāo)記上酶；加受檢血清：其特異抗體與抗原結(jié)合，加受檢血清：其特異抗體與抗原結(jié)合， 形成固相抗原抗體復(fù)合物。形成固相抗原抗體復(fù)合物。固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包

7、被抗原就可利用就可利用同一酶標(biāo)抗抗體同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。 雙抗體夾心法雙抗體夾心法特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體；特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體；標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合成固相抗原復(fù)合物；標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合成固相抗原復(fù)合物；加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合，加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合，酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)；酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)；酶標(biāo)抗體血清樣品或參比品底物加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物底物成為有色產(chǎn)物酶

8、標(biāo)儀測(cè)定OD值終止液根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被就可用于包被固相載體固相載體和制備和制備酶結(jié)合物酶結(jié)合物而建立此法。而建立此法。競爭法競爭法 用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體表面，以測(cè)定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成兩組

9、：一組加酶標(biāo)記抗原和待測(cè)抗原的混經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和待測(cè)抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的未知物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的未知抗原的量?？乖牧?。 這種這種方法所測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位就可，因此，對(duì)小分子抗原如激素和藥物之類的測(cè)定常用此法。該法的優(yōu)點(diǎn)是快，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)保溫洗滌過程，但需用較多量的酶標(biāo)記抗原。 操作步驟操作步驟 1. 1.從冰箱取出試劑盒，室溫平衡從冰箱取出試劑盒，室溫平衡3030分鐘。分鐘。 2.2.按如下方式加按如下方式加待測(cè)

10、血清待測(cè)血清，每孔，每孔1 1滴。滴。待待2 2待待3 3待待1 1陽性陽性陰性陰性空白空白3.3.每孔加每孔加酶結(jié)合物酶結(jié)合物1 1滴（滴（孔上方懸空滴加，無氣泡孔上方懸空滴加，無氣泡），混勻，），混勻，空白孔不加，置空白孔不加，置3737度溫箱度溫箱3030分鐘。分鐘。4.4.取出反應(yīng)板，棄液，拍干。取出反應(yīng)板，棄液，拍干。5.5.每孔每孔注滿注滿洗滌液洗滌液，（，（不要溢出不要溢出）靜置）靜置5 5秒后棄液，拍干，秒后棄液，拍干，重復(fù)洗滌重復(fù)洗滌5 5次，拍干。次，拍干。6.6.每孔加每孔加顯色劑顯色劑A A和和B B各各1 1滴，置滴，置3737度溫箱度溫箱1515分鐘。分鐘。7.7.

11、每孔加每孔加終止液終止液1 1滴混勻，觀察結(jié)果。滴混勻，觀察結(jié)果。 結(jié)果觀察結(jié)果觀察 結(jié)果觀察結(jié)果觀察乙型肝炎病毒采用乙型肝炎病毒采用ELISAELISA檢測(cè)法具有檢測(cè)法具有操作簡便操作簡便、靈敏度高靈敏度高、試試劑成本低劑成本低、環(huán)保環(huán)保和和適用于大批量人群適用于大批量人群抗原、抗體篩查等優(yōu)點(diǎn)抗原、抗體篩查等優(yōu)點(diǎn), ,目前在國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室被廣泛使用。目前在國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室被廣泛使用。 缺點(diǎn)易產(chǎn)生缺點(diǎn)易產(chǎn)生假陽性假陽性結(jié)果。結(jié)果。酶標(biāo)儀洗板機(jī)酶標(biāo)儀洗板機(jī) 排槍加樣排槍加樣酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀乙肝病毒（乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）抗原,抗體:1、表面Ag（HBsAg） HBsAb2、核心抗原（HBcAg） HBcAb3、e抗原（HBeAg） HBeAb兩對(duì)半： HBsAg HBsAb HBcAb HBeAg HBeAb HBV-Ag、Ab檢測(cè)結(jié)果臨床分析檢測(cè)結(jié)果臨床分析HBsAg HBeAg HBsAb HBcAb HBeA