第五章診斷酶學(自編)

1、第第 五五 章章診診 斷斷 酶酶 學學第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 通過本節(jié)學習，掌握的知識點通過本節(jié)學習，掌握的知識點1、酶的組成、結構及功能特點。、酶的組成、結構及功能特點。2、酶的催化機制。、酶的催化機制。3、什么是同工酶，、什么是同工酶，LDH、CK等同工酶的分等同工酶的分布及臨床意義。布及臨床意義。4、何謂工具酶，工具酶參與的指示反應。、何謂工具酶，工具酶參與的指示反應。5、終點法和動力學法測定代謝物濃度的原理、終點法和動力學法測定代謝物濃度的原理及區(qū)別。及區(qū)別。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述一、酶的概念與特征一、酶的概念與特征（一）、酶的概念：（一）、酶的概念： 酶是活細胞分泌產(chǎn)生的具有催化

2、活性的酶是活細胞分泌產(chǎn)生的具有催化活性的蛋白質或蛋白質或RNA。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述（二）酶的組成及功能（二）酶的組成及功能按照酶的分子組成：按照酶的分子組成： 單純酶：單純酶： 酶蛋白酶蛋白 結合酶：結合酶： 金屬離子金屬離子 輔助因子輔助因子 小分子有機化合物小分子有機化合物 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述（三）、酶的催化作用機制（三）、酶的催化作用機制1、酶的活性中心：、酶的活性中心： 酶分子中能和底物特異性結合并將底物酶分子中能和底物特異性結合并將底物轉化為產(chǎn)物的區(qū)域稱為酶的活性中心。轉化為產(chǎn)物的區(qū)域稱為酶的活性中心。 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述2、誘導契合學說、誘導契合學說 在酶促反應中

3、，酶與底物結合時，底在酶促反應中，酶與底物結合時，底物物首先和酶分子上的活性中心相結合，形成酶首先和酶分子上的活性中心相結合，形成酶-底物中間復合物（底物中間復合物（ES）。在構象上相互誘）。在構象上相互誘導，致使活性中心與底物完全緊密結合，這導，致使活性中心與底物完全緊密結合，這一過程稱為誘導契合學說。一過程稱為誘導契合學說。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述（四）酶促反應動力學（四）酶促反應動力學1、底物濃度對酶促反應速度的影響2、酶的濃度對酶促反應速度的影響3、溫度、PH、激活劑和抑制劑對酶促反應 速度的影響。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述二、同工酶的概念與特征二、同工酶的概念與特征1、概念、概念 指催

4、化相同的化學反應，但酶蛋白的分指催化相同的化學反應，但酶蛋白的分子結構、理化性質乃至免疫學性質不同的一子結構、理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶。組酶。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述二、同工酶的概念與特征二、同工酶的概念與特征2、特征、特征（1） 同工酶是由不同基因編碼的多肽，或同工酶是由不同基因編碼的多肽，或由同一基因轉錄生成的不同的由同一基因轉錄生成的不同的mRNA所翻所翻譯的不同多肽鏈組成的蛋白質。譯的不同多肽鏈組成的蛋白質。（2）同工酶存在同一種屬或同一個體的不同）同工酶存在同一種屬或同一個體的不同組織或同一細胞的不同亞細胞結構中，它組織或同一細胞的不同亞細胞結構中，它使不同組織、器官和不同

5、的亞細胞結構具使不同組織、器官和不同的亞細胞結構具有不同的代謝特征。有不同的代謝特征。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述二、同工酶的概念與特征二、同工酶的概念與特征3、臨床常用的同工酶、臨床常用的同工酶第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述二、同工酶的概念與特征二、同工酶的概念與特征3、臨床常見的同工酶、臨床常見的同工酶（1）LDH： 該酶是四聚體酶，由兩種亞基類型即骨骼肌型（M）和心肌型（H）。 種類：LDH1，LDH2，LDH3,LDH4，LDH5。主要分布于心肌，紅細胞，骨骼肌和肝臟中。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述二、同工酶的概念與特征二、同工酶的概念與特征3、臨床常見的同工酶、臨床常見的同工酶（2）CK肌酸激酶

6、該酶是二聚體酶，有兩種亞基類型即骨骼肌型該酶是二聚體酶，有兩種亞基類型即骨骼肌型（M）和腦型（）和腦型（B）。）。 該酶有三種：該酶有三種：CK1 腦中腦中 CK2 心肌心肌 CK3 骨骼肌骨骼肌 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述二、同工酶的概念與特征二、同工酶的概念與特征3、人體重要的同工酶、人體重要的同工酶（2）CK肌酸激酶 CK 肌酸肌酸 + ATP 磷酸肌酸磷酸肌酸 + ADP 血清中血清中CK2的活性測定有助于心肌梗死的早的活性測定有助于心肌梗死的早期診斷。期診斷。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（一）定義：（一）定義： 酶學分析中作為試劑用于測定化合物濃酶學分析中作為試劑用于測

7、定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱為度或酶活性濃度的酶稱為 工具酶工具酶。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（二）工具酶參與的指示反應（二）工具酶參與的指示反應1、利用特異性較高的氧化酶產(chǎn)生過氧化氫，、利用特異性較高的氧化酶產(chǎn)生過氧化氫，再通過加氧化發(fā)色劑進行比色的方法再通過加氧化發(fā)色劑進行比色的方法第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（二）工具酶參與的指示反應（二）工具酶參與的指示反應例： 多胺氧化酶多胺氧化酶多胺多胺 氨基酸氨基酸 + H2O2 +NH3+ H2O2 和和4-AAP（氨基安替比林）顯色反應。（氨基安替比林）顯色反應。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶

8、（二）工具酶參與的指示反應（二）工具酶參與的指示反應2、NAD（P）H在在340nm具有特征性光具有特征性光吸收，吸收， NAD（P）+在在340nm處不具處不具有特征性光吸收，利用氧化有特征性光吸收，利用氧化-還原酶反還原酶反應使其連接到應使其連接到NAD（P） + / NAD（P）H正正/逆反應中，通過該兩種物質量的逆反應中，通過該兩種物質量的變化間接反應待測酶的活性。變化間接反應待測酶的活性。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（二）工具酶參與的指示反應（二）工具酶參與的指示反應例例 ：己糖激酶法測定血清中葡萄糖濃度己糖激酶法測定血清中葡萄糖濃度 己糖激酶己糖激酶 葡萄糖葡萄糖

9、+ ATP 6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 + ADP 6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸葡萄糖脫氫酶 6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸 NADP+ NADPH + H+ 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（三）（三） 酶循環(huán)法酶循環(huán)法1、定義：、定義： 采用兩類工具酶進行循環(huán)催化反應，使被采用兩類工具酶進行循環(huán)催化反應，使被測物放大擴增，從而提高檢測靈敏度。測物放大擴增，從而提高檢測靈敏度。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（三）（三） 酶循環(huán)法酶循環(huán)法2、實例：酶循環(huán)法測定總膽汁酸、實例：酶循環(huán)法測定總膽汁酸第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（三）（三）

10、 酶循環(huán)法酶循環(huán)法2、實例：酶循環(huán)法測定總膽汁酸、實例：酶循環(huán)法測定總膽汁酸 解釋解釋：硫代：硫代-NADH在在405nm處有強值，膽汁酸的處有強值，膽汁酸的濃度與此處吸光值的變化成正比。濃度與此處吸光值的變化成正比。 A/min（樣品）（樣品）總膽汁酸濃度總膽汁酸濃度= A/min（標準品）（標準品） 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（三）（三） 酶循環(huán)法酶循環(huán)法3、優(yōu)勢：、優(yōu)勢：（1）特異性好）特異性好（2）反應溫和，無污染。）反應溫和，無污染。（3）靈敏度高）靈敏度高第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術（四）代謝物濃度的酶法測定技術 1、

11、終點法（、終點法（end-point assay） （1） 定義：在代謝物酶促反應中，隨著定義：在代謝物酶促反應中，隨著時間的延長，待測物濃度逐漸減少而產(chǎn)物時間的延長，待測物濃度逐漸減少而產(chǎn)物逐漸增多，一定時間后反應趨于平衡，測逐漸增多，一定時間后反應趨于平衡，測定反應達到平衡后待測物（底物）或產(chǎn)物定反應達到平衡后待測物（底物）或產(chǎn)物的變化總量。的變化總量。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術（四）代謝物濃度的酶法測定技術1、終點法（、終點法（end-point assay）（2）終點法測定的基本條件：）終點法測定的基本條件： 待測物濃度待測物濃度S應遠遠

12、小于其米氏常數(shù)應遠遠小于其米氏常數(shù)Km，此時任何時刻的反應速率此時任何時刻的反應速率 V=VmaxS/Km 反應配方中所用的酶量反應配方中所用的酶量(V)應足夠大，而應足夠大，而Km應小，應小，以保證有較快的反應速度完成測定。以保證有較快的反應速度完成測定。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術（四）代謝物濃度的酶法測定技術 1、終點法（、終點法（end-point assay） （3）種類）種類 直接法：直接法： 待測物和產(chǎn)物在理化性質上有可直接待測物和產(chǎn)物在理化性質上有可直接進行檢測的差異，可以直接測定待測物或進行檢測的差異，可以直接測定待測物或產(chǎn)物本身

13、信號的改變來進行定量分析。產(chǎn)物本身信號的改變來進行定量分析。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術（四）代謝物濃度的酶法測定技術 1、終點法（、終點法（end-point assay） （3）種類）種類 酶偶聯(lián)法：酶偶聯(lián)法： 如果酶促反應的底物或產(chǎn)物無可直如果酶促反應的底物或產(chǎn)物無可直接檢測的成分，則可將反應某一產(chǎn)物偶聯(lián)接檢測的成分，則可將反應某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個酶促反應中而達到的檢測目的。到另一個酶促反應中而達到的檢測目的。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述酶偶聯(lián)法：酶偶聯(lián)法： EX Ei A B CEx：為輔助酶：為輔助酶Ei ：為指示酶：為指示酶C：被檢測的物質

14、：被檢測的物質第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述酶偶聯(lián)法（實際例子）：酶偶聯(lián)法（實際例子）： 血漿葡萄糖測定的氧化酶法（血漿葡萄糖測定的氧化酶法（GOD） 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖葡萄糖+水水 + 氧氧 葡萄糖酸葡萄糖酸 + H2O2 過氧化物酶過氧化物酶 4-氨基安替比林氨基安替比林+酚酚+H2O2 紅色醌類化合物紅色醌類化合物+水水+氧氧 色原性氧受體色原性氧受體第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術（四）代謝物濃度的酶法測定技術1、終點法（、終點法（end-point assay）（4）終點法實驗設計的考慮因素）終點法實驗設計的考慮因素工具酶的特異性 高特

15、異性Km大小合適：在保證測定線性的前提下，Km值要盡量小。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術（四）代謝物濃度的酶法測定技術1、終點法（、終點法（end-point assay）（4）終點法實驗設計的考慮因素）終點法實驗設計的考慮因素酶的用量：酶的用量足夠大，保證反應在較短的時間內完成。工具酶中的雜酶應低于允許限制。反應平衡點：保證反應朝正反應方向進行附加劑：反應中添加的附加劑不抑制酶的活性，不影響試劑穩(wěn)定性，不與底物或反應液中的物質發(fā)生作用。第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術（四）代謝物濃度的酶法測定技術2、動力學

16、法（定時法）：、動力學法（定時法）： （1）定義：根據(jù)固定時間內底物消耗量和產(chǎn)物生）定義：根據(jù)固定時間內底物消耗量和產(chǎn)物生成量計算酶的活性。成量計算酶的活性。 （2）原理：當酶促反應為一級反應時，反應速度）原理：當酶促反應為一級反應時，反應速度V=KS。此時測定酶促反應的初速度，根據(jù)。此時測定酶促反應的初速度，根據(jù)標準濃度法即可求得待測物的濃度。標準濃度法即可求得待測物的濃度。 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述三、工具酶三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術（四）代謝物濃度的酶法測定技術2、動力學法（定時法）：、動力學法（定時法）：（3）條件：實際操作中在底物濃度消耗小于）條件：實際操作中在底物濃度

17、消耗小于5%時即可采用該方法。時即可采用該方法。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術通過本節(jié)的學習掌握如下知識：通過本節(jié)的學習掌握如下知識：1、血清酶活性濃度測定技術有哪些？、血清酶活性濃度測定技術有哪些？2、酶活性濃度定量系數(shù)、酶活性濃度定量系數(shù)K值的計算與實驗室的應用。值的計算與實驗室的應用。3、臨床酶學測定的標準化要求和臨床意義。、臨床酶學測定的標準化要求和臨床意義。4、酶活性濃度單位？目前通用的酶單位的表示方、酶活性濃度單位？目前通用的酶單位的表示方法有哪些？法有哪些？5、酶質量免疫化學測定法的原理和優(yōu)缺點、酶質量免疫化學測定法的原理和優(yōu)缺點6、同工酶分析方法及原理、同工酶分析方法及

18、原理第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術 定時法定時法 酶活性測定酶活性測定 連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法酶學測定方法酶學測定方法 酶質量測定：免疫酶法酶質量測定：免疫酶法第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術一、酶活性測定一、酶活性測定（一）定時法測定酶活性（動力學法）（一）定時法測定酶活性（動力學法）1、定義、定義 在足量底物系統(tǒng)中，加入一定量的酶在足量底物系統(tǒng)中，加入一定量的酶試劑，反應一定時間后，加入試劑，反應一定時間后，加入終止試劑終終止試劑終止反應止反應，然后測定該段時間內底物消耗量，然后測定該段時間內底物消耗量或產(chǎn)物的生成量計算酶的活性。或產(chǎn)物的生成量計算酶的活性。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶

19、測定技術酶測定技術一、酶活性測定一、酶活性測定（一）定時法測定酶活性（動力學法）（一）定時法測定酶活性（動力學法）2、定時法計算酶活性、定時法計算酶活性 假設某一樣品的酶活性為假設某一樣品的酶活性為X（U/L），?。?，取樣品樣品Vs（ml）與底物緩沖液）與底物緩沖液Vr（ml）孵育，）孵育，經(jīng)反應后，加入終止液經(jīng)反應后，加入終止液Ve（ml），檢測到產(chǎn)），檢測到產(chǎn)物凈吸光度增加為物凈吸光度增加為A，該產(chǎn)物的摩爾消光系，該產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)數(shù)，比色杯光徑為，比色杯光徑為b b（cmcm）。）。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術一、酶活性測定一、酶活性測定（一）定時法測定酶活性（動力學法）（一

20、）定時法測定酶活性（動力學法）2、定時法計算酶活性、定時法計算酶活性定時法中可能引起的誤差定時法中可能引起的誤差3、消除誤差方法：、消除誤差方法：做預實驗找出酶促反應速率恒定做預實驗找出酶促反應速率恒定 的時期，確定線性時間，然后在該的時期，確定線性時間，然后在該 段時間內測定。段時間內測定。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（二）、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性（終點法）（二）、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性（終點法） 1、定義：、定義： 連續(xù)監(jiān)測法是將酶和底物在特定的條連續(xù)監(jiān)測法是將酶和底物在特定的條件下孵育，件下孵育，每隔一定時間（每隔一定時間（2-60s）連續(xù)）連續(xù)測測定酶促反應過程中某一底物或產(chǎn)物的

21、特征定酶促反應過程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號的變化，從而計算出每分鐘的信號變信號的變化，從而計算出每分鐘的信號變化速率。化速率。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術3、分類、分類（1）、直接法）、直接法 直接通過測定反應體系中底物或產(chǎn)物直接通過測定反應體系中底物或產(chǎn)物理化特性的變化，從而計算出酶活性濃度。理化特性的變化，從而計算出酶活性濃度。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（2）、間接法）、間接法 酶偶聯(lián)反應酶偶聯(lián)反應 Ex Ei A B C Ex Ea Ei A B C D Ex：待測酶：待測酶 Ea： 輔助酶輔助酶 Ei：指示酶：指示酶第第 二

22、二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術采用酶偶聯(lián)法測定酶活性前提：采用酶偶聯(lián)法測定酶活性前提： 延滯期越短越好第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術采用酶偶聯(lián)法測定酶活性前提：采用酶偶聯(lián)法測定酶活性前提：指示酶量的選擇標準 Vx/（Km）x=Vi/（Km）iVx：測定酶的測定上限（Km）x（Km）i是測定酶和指示酶的Km值。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術采用酶偶聯(lián)法測定酶活性前提：采用酶偶聯(lián)法測定酶活性前提：指示酶量的選擇標準 米-曼氏方程 Vx = Vi =Vx 1+ ViPP + （Km）i（Km）iP第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術采用酶偶聯(lián)法測定酶活性前提：采用酶偶聯(lián)法測定酶活性

23、前提：指示酶量的選擇標準 第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（三）干擾因素（三）干擾因素1、其他酶和物質的干擾2、酶的污染3、非酶反應4、分析容器的污染5、沉淀形成第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（四）血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化（四）血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化1、方法的選擇、方法的選擇2、儀器和設備、儀器和設備3、試劑、試劑4、自動生化分析儀參數(shù)的設置、自動生化分析儀參數(shù)的設置第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（五）分析前因素對酶活性測定的干擾（五）分析前因素對酶活性測定的干擾1、溶血2、抗凝劑3、標本的儲存溫度第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（六）酶活性濃度的單位（六

24、）酶活性濃度的單位1、酶活性單位、酶活性單位（1） 慣用單位慣用單位（2）國際單位）國際單位 定義定義：在特定的條件下，一分鐘內使底物轉變1mol的酶量為一個國際單位，以IU表示。1IU=1mol/min第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（六）酶活性濃度的單位（六）酶活性濃度的單位（3）Katal單位：單位： 定義定義：在規(guī)定條件下，每秒內催化轉化：在規(guī)定條件下，每秒內催化轉化 1mol底物的酶量。底物的酶量。1Katal=1mol/s Katal是我國法定的酶活性單位，常用單位是我國法定的酶活性單位，常用單位一般為一般為Katal或或nKatal。 1Katal=60106UIU =1m

25、ol/min=16.67nmol/s=16.67nKatal第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（六）酶活性濃度的單位（六）酶活性濃度的單位2、酶活性濃度單位、酶活性濃度單位 （臨床上，酶活性濃度以每單位體積所含的酶活性單位（臨床上，酶活性濃度以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示）數(shù)表示）（1）表示方法：目前我國各級臨床中表示酶濃度的方法是）表示方法：目前我國各級臨床中表示酶濃度的方法是U/L。 1U/L=16.67nKatal/L 第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（六）酶活性濃度的單位（六）酶活性濃度的單位2、酶活性濃度單位的計算、酶活性濃度單位的計算 U/L= AV106minVL說

26、明：說明： V：反應體系體積（：反應體系體積（ml） ：摩爾吸光系數(shù)（：摩爾吸光系數(shù)（cmcm2 2/mol/mol） v v：樣品量（：樣品量（mlml） L L：比色杯光徑（：比色杯光徑（cm)cm) A：吸光度變化：吸光度變化 106：將：將mol換算成換算成mol摩爾吸光系數(shù)的定義為：在特定的條件下，一定波長的光，光徑為1.00cm時，通過所含吸光物質的濃度為1.00mol/L的吸光度第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（六）酶活性濃度的單位（六）酶活性濃度的單位3、參考區(qū)間和正常上限的倍數(shù)應用、參考區(qū)間和正常上限的倍數(shù)應用（1）參考區(qū)間）參考區(qū)間第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技

27、術（六）酶活性濃度的單位（六）酶活性濃度的單位3、參考區(qū)間和正常上限的倍數(shù)應用、參考區(qū)間和正常上限的倍數(shù)應用（2）正常上限倍數(shù)的應用）正常上限倍數(shù)的應用正常上限（正常上限（upper limits of normal,ULN）第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（七）系數(shù)（七）系數(shù)K值的計算與應用值的計算與應用1、K：酶活性：酶活性 濃度定量系數(shù)，主要用于臨床酶濃度定量系數(shù)，主要用于臨床酶活性測定的計算與校準?；钚詼y定的計算與校準。 U/L= K K=例：例：NADH的的為為6.226.22103cm/mol，血清量，血清量50m，底物，底物溶液為溶液為1ml。比色杯光徑為。比色杯光徑為1c

28、m，則，則K=1.05106/（6.221030.051）=3376AminV106VL第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（七）系數(shù)（七）系數(shù)K值的計算與應用值的計算與應用2、K的意義與設置的意義與設置 K的設置應該考慮測定酶的參考范圍上限的設置應該考慮測定酶的參考范圍上限及測定的時間兩個方面。及測定的時間兩個方面。 過高：測定的線性范圍寬，但是重復性差過高：測定的線性范圍寬，但是重復性差 過低：線性范圍窄，但是精密度好過低：線性范圍窄，但是精密度好第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（八）（八） 臨床酶學測定的標準化臨床酶學測定的標準化1、標準化途徑（1）使用推薦方法和參考方法（2）使

29、用公認的酶校準物或酶參考物第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術（八）（八） 臨床酶學測定的標準化臨床酶學測定的標準化2、酶活性濃度測定的參考系統(tǒng)（1）建立原級參考方法（2）制備原級參考物（3）建立參考實驗室網(wǎng)絡第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術二二 、酶質量測定、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理1、放射免疫測定（、放射免疫測定（RIA） 將放射性核素標記的酶分子與相應的抗體作用產(chǎn)生沉淀，再將沉淀分離進行定量測定。例：例：用RIA檢測尿中五項蛋白： 2 -MG、IgG、Alb、THP、 1 -MG 診斷早起腎病。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術二二 、酶質量測定、酶質量測定

30、（一）免疫化學法測定酶質量的原理2、其它方法： （1）免疫抑制法）免疫抑制法 常用于同工酶的測定。例如：CK-M抗體檢測CK-MB的活性。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術二二 、酶質量測定、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理2、其它方法：（2）化學發(fā)光免疫測定（）化學發(fā)光免疫測定（CLIA） 將高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與免疫 法相結合的一項技術。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術二二 、酶質量測定、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理2、其它方法：（3）酶免疫測定（EIA） 將酶催化作用的高效性與抗原抗體反應的特異性結合的一種微量分析技術。酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA

31、）酶免疫組化技術第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術二二 、酶質量測定、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理2、其它方法：（4）熒光免疫測定（）熒光免疫測定（FEIA） 是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤技術相結合的測定方法。 標記物：熒光素第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術二二 、酶質量測定、酶質量測定（二）酶質量免疫化學測定法的優(yōu)點（二）酶質量免疫化學測定法的優(yōu)點1、靈敏度高、靈敏度高2、特異性高、特異性高3、能用于測定一些無活性的酶蛋白、能用于測定一些無活性的酶蛋白4、應用于同工酶的測定、應用于同工酶的測定第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術二二 、酶質量測定、酶質

32、量測定（三）免疫化學測定法的局限性（三）免疫化學測定法的局限性1、制備足夠量的提純酶做為抗原或制備具有免疫化學性質的抗血清比較困難。2、測定繁瑣3、測定成本高第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術三、同工酶的檢測三、同工酶的檢測第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術三、同工酶的檢測三、同工酶的檢測（一）電泳法（一）電泳法1、常用方法：醋酸纖維薄膜電泳（、常用方法：醋酸纖維薄膜電泳（CAE）、）、瓊脂糖凝膠電泳（瓊脂糖凝膠電泳（AGE），聚丙烯酰胺凝膠），聚丙烯酰胺凝膠電泳（電泳（PAGE）等。）等。第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術三、同工酶的檢測三、同工酶的檢測2、例：LD瓊脂糖電泳（1

33、）電泳（2）染色（3）洗脫背景色（4）掃描區(qū)帶（或將區(qū)帶切下比色測定）電泳結果是從正極向負極順序：LD1，LD2，LD3，LD4，LD5第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術三、同工酶的檢測三、同工酶的檢測第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術三、同工酶的檢測三、同工酶的檢測3、巨分子酶對電泳分析同工酶的影響（1）酶與免疫球蛋白形成復合物（2）酶與其它蛋白形成復合物（3）酶亞基與酶分子之間形成的聚合物第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術第第 二二 節(jié)節(jié) 酶測定技術酶測定技術三、同工酶的檢測三、同工酶的檢測（二）層析法（二）層析法（三）免疫分析法（三）免疫分析法（四）同工酶的其它分析方法（四）

34、同工酶的其它分析方法第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用 一、血清酶一、血清酶（一）、血清酶的來源與去路（一）、血清酶的來源與去路1、血清酶的種類、血清酶的種類分類依據(jù)：酶的來源以及在血漿中發(fā)揮催化分類依據(jù)：酶的來源以及在血漿中發(fā)揮催化 功能的情況。功能的情況。（1）血漿特異酶：在血漿中發(fā)揮特定的催化）血漿特異酶：在血漿中發(fā)揮特定的催化 作用的酶（作用的酶（血漿固有酶血漿固有酶） 來源：肝臟來源：肝臟第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用（一）、血清酶的來源與去路（一）、血清酶的來源與去路1、血清酶的種類、血清酶的種類分

35、類依據(jù)：酶的來源以及在血漿中發(fā)揮催化功能的分類依據(jù)：酶的來源以及在血漿中發(fā)揮催化功能的 情況。情況。（2）非血漿特異性酶：在血漿中很少發(fā)揮作用。）非血漿特異性酶：在血漿中很少發(fā)揮作用。 外分泌酶：來源于消化腺或其它外分泌腺外分泌酶：來源于消化腺或其它外分泌腺 的酶。的酶。 細胞酶：存在于各組織細胞中進行代謝的酶類。細胞酶：存在于各組織細胞中進行代謝的酶類。第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用（一）、血清酶的來源與去路（一）、血清酶的來源與去路2、血清酶的去路、血清酶的去路 血清酶的血清酶的半衰期半衰期是指酶失活至原來活性一是指酶失活至原來活性一半時所需要的

36、時間。一般以半衰期代表酶從半時所需要的時間。一般以半衰期代表酶從血液中清除的快慢。血液中清除的快慢。第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用（二）血清酶的生理差異（二）血清酶的生理差異1、性別、性別 CK，ALP及及-GT等有性別差異，男性等有性別差異，男性略高于女性。略高于女性。2、年齡、年齡 新生兒略高于成人新生兒略高于成人 實例：實例：ALP 15歲增至成人的歲增至成人的23倍倍 1015歲可達成人的歲可達成人的35倍倍 20歲降至成人水平歲降至成人水平第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用（二）血清酶的生理差異（二）

37、血清酶的生理差異3、進食、進食 在高脂、高糖飲食后血清中在高脂、高糖飲食后血清中ALP活性增高。活性增高。 酗酒可使血清酗酒可使血清-GT升高升高第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用（二）血清酶的生理差異（二）血清酶的生理差異4、運動、運動 激烈的肌肉運動可使血清中多種酶如CK、 LD、AST 、ALD 和ALT等活性升高，其升 高的幅度與運動量、運動時間、運動頻率 及骨骼肌所含的酶量有關。第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用（二）血清酶的生理差異（二）血清酶的生理差異5、妊娠 妊娠期，胎盤組織可分泌一些酶進入母體血液

38、，比如：ALP,LD,LAP,ALT等，引起血清中這些酶升高。6、其它 血清中有些酶有種族差異。 第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用（三）血清酶的臨床應用第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用二、尿液酶二、尿液酶 目前了解較多的尿液酶：AMS、 N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）白細胞酯酶 溶菌酶（LZM）、丙氨酸氨基肽酶（APP）-葡萄糖苷酸酶（GRS）、亮氨酸氨基肽酶（LAP） LD、 ALP、 -GT 第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用1、AMS-尿液淀粉酶（1）來源：

39、唾液腺或胰腺（2）種類：S型（唾液腺型）和P型（胰腺型）（3）用途：急性胰腺炎和急性腮腺炎（4）干擾因素 a、診斷胰腺炎的時候，應排除腎病和巨淀粉酶血癥. b、尿液淀粉酶的活性影響因素：酸尿、草酸鹽、檸檬酸鹽 可抑制該酶活性；磺胺類藥物、止痛藥可使該酶活性增高。 c、急性闌尾炎、腸梗阻、胰腺癌等可使AMS升高。 第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用二、尿液酶二、尿液酶（二）NAG：N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶1、來源：腎近曲小管上皮細胞2、用途 （1）各種腎實質早期損傷的敏感標志物 （2）糖尿病性腎病早期發(fā)現(xiàn)和病程監(jiān)測的重要項 目 （3）反映腎病綜合癥、腎

40、小球腎炎、高血壓腎病 和視網(wǎng)膜病的發(fā)展。 （4）用于藥物治療時毒性反應，腎重金屬毒害、 腎移植排異監(jiān)測等。第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用三、漿膜腔積液酶 漿膜腔：人體的胸腔、腹腔和心包腔、關 節(jié)腔的統(tǒng)稱。 漿膜腔積液：病理狀態(tài)下漿膜腔內大量的 液體潴留。第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用三、漿膜腔積液酶（一）腹水：腹腔內的過多積液（一）腹水：腹腔內的過多積液1、腹水中的主要酶：LD 和ADA等2、臨床意義（1）結核性滲出液：ADA升高 （2）惡性腹水：ADA偏低 （3）胰腺炎或胰腺創(chuàng)傷：AMS增高 第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用三、漿膜腔積液酶三、漿膜腔積液酶（二）胸腔積液（二）胸腔積液1、分類（1）漏出液：代償性心力衰竭 （2）滲出液：肺炎、惡性腫瘤或肺栓塞2、臨床意義：（1）LD200U/L為漏出液, LD200U/L為 滲出液 （2）ADA該酶用于結核性胸腔積液的診斷。 （3）AMS：急性胰腺炎、胰腺創(chuàng)傷 （4）癌癥檢測：胸腔積ACE25U/L，胸腔 積液ACE/血清中ACE的比值1第第 三三 節(jié)節(jié) 常用酶及同工酶測定的常用酶及同工酶測定的臨床應用臨床應用三、漿膜腔積液酶三、漿膜腔積液酶（三