酶工程1-10章題及答案解析

1、 第一章 緒論試題精選一、名詞解釋1、酶 2、酶工程 3、核酸類酶4、蛋白類酶 5、酶的生產(chǎn) 6、酶的改性7、酶的應用 8、酶的專一性 9、酶的轉換數(shù)二、填空題1、根據(jù)分子中起催化作用的主要組分的不同，酶可以分為_蛋白類酶_和 核酸類酶_兩大類。2、核酸類酶分子中起催化作用的主要組分是_核糖核酸，蛋白類酶分子中起催化作用的主要組分是_蛋白質_。3、進行分子內催化作用的核酸類酶可以分為_自我剪切酶_，_自我剪接酶_。4、酶活力是_酶量_的量度指標，酶的比活力是_酶純度_的量度指標，酶的轉換數(shù)的主要組分是_酶催化效率_的度量指標。5、非競爭性抑制的特點是最大反應速度Vm_減小_，米氏常數(shù)Km_不變

2、_。三、選擇題1、酶工程是（C）的技術過程。A、利用酶的催化作用將底物轉化為產(chǎn)物 B、通過發(fā)酵生產(chǎn)和分離純化獲得所需酶 C、酶的生產(chǎn)與應用 D、酶在工業(yè)上大規(guī)模應用2、核酸類酶是（D）。A、催化RNA進行水解反應的一類酶 B、催化RNA進行剪接反應的一類酶C、由RNA組成的一類酶 D、分子中起催化作用的主要組分為RNA的一類酶3、RNA剪切酶是（B）。A、催化其他RNA分子進行反應的酶 B、催化其他RNA分子進行剪切反應的R酶C、催化本身RNA分子進行剪切反應的R酶 D、催化本身RNA分子進行剪接反應的R酶4、酶的改性是指通過各種方法（A）的技術過程。A、改進酶的催化特性 B、改變酶的催化特性

3、 C、提高酶的催化效率 D、提高酶的穩(wěn)定性5、酶的轉換數(shù)是指（C）。A、酶催化底物轉化成產(chǎn)物的數(shù)量B、每個酶分子催化底物轉化為產(chǎn)物的分子數(shù)C、每個酶分子每分鐘催化底物轉化為產(chǎn)物的分子數(shù)D、每摩爾酶催化底物轉化為產(chǎn)物的摩爾數(shù)四、判斷題（V）1、相同的酶在不同的pH條件下進行測定時，酶活力不同。（V）2、競爭性抑制的特點是最大反應速度Vm不變，米氏常數(shù)Km 增大。（X）3、催化兩個化合物縮成一個化合物的酶稱為合成酶。（X ）4、RNA剪切酶是催化RNA分子進行剪切反應的核酸類酶。（V）5、水解酶在水溶液中不能催化其逆反應。五、簡答題1、何謂酶工程，其主要內容有哪些？答：酶的生產(chǎn)與應用的技術過程稱為

4、酶工程。 酶的生產(chǎn)是指通過各種方法獲得人們所需的酶的技術過程，主要包括微生物發(fā)酵產(chǎn)酶，動植物培養(yǎng)產(chǎn)酶和酶的提取與分離純化等。 酶的應用是在人工控制條件的反應器中，通過酶的催化作用獲得人們所需的物質或者除去不良物質的技術過程。主要包括酶反應器的選擇與設計以及酶在各個領域的應用等。 在酶的生產(chǎn)與應用過程中，人們發(fā)現(xiàn)酶具有穩(wěn)定較性差、催化效率不夠高、游離酶通常只能使用一次等弱點，為此研究、開發(fā)了各種酶的改性技術，以促進酶的優(yōu)質生產(chǎn)和高效應用。 酶的改性是通過各種方法改進酶的催化特性的技術過程，主要包括酶分子修飾、酶固定化、酶非水相催化、酶定向進化等。 酶工程的主要內容包括：微生物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶，動植物

5、細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶，酶的提取與分離純化，酶分子修飾，酶、細胞、原生質體固定化、酶定向進化、酶反應器和酶的應用等。2、 試述酶活力測定的基本步驟。答：酶活力測定通常包括兩個階段。首先在一定條件下，酶與底物反應一段時間，然后再測定反應液中底物或產(chǎn)物的變化量。一般經(jīng)過如下幾個步驟： （1）根據(jù)酶催化的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物溶液。所使用的底物必須均勻一致，達到酶催化反應所要求的純度。在測定酶活力時，所使用的底物溶液一般要求新鮮配制，有些反應所需的底物溶液也可預先配制后置于冰箱保存?zhèn)溆谩?（2）根據(jù)酶的動力學性質，確定酶催化反應的溫度、pH、底物濃度、激活劑濃度等反應條件。溫度可以選擇

6、在室溫（25）、體溫(37)、酶反應最適溫度或其他選用的溫度；pH應是酶催化反應的最適pH；底物濃度應大于5Km等。反應條件一旦確定，在整個反應過程中應盡量保持恒定不變。故此，反應應該在恒溫槽中進行，pH的保持恒定是采用一定濃度和一定的pH緩沖溶液。有些酶催化反應，要求一定濃度的激活劑等條件，應適量添加。 （3）在一定的條件下，將一定量的酶液和底物溶液混合均勻，適時記下反應開始的時間。 （4）反應到一定的時間，取出適量的反應液，運用各種生化檢測技術，測定產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。3、 簡述影響酶催化作用的主要因素。答：酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多

7、因素的影響。 （1）底物濃度：在底物濃度較低的情況下，酶催化反應速度與底物濃度成正比，反應速度隨著底物濃度的增加而加快。當?shù)孜餄舛冗_到一定的數(shù)值時，反應速度的上升不再與底物濃度成正比，而是逐步趨向平衡。 （2）酶濃度：在底物濃度足夠高的條件下，酶催化反應速度與酶濃度成正比。 （3）溫度的影響：每一種酶的催化反應都有其適宜的溫度范圍和最適溫度。在適宜溫度范圍內，酶才能進行催化反應；在最高溫度條件下，酶的催化反應速度達到最大。 （4）pH的影響：酶的催化作用與反應液的pH有很大關系。每一種酶都有各自的適宜pH范圍和最適pH。只有在適宜pH范圍內，酶才能顯示其催化活性在最適pH條件下，酶催化反應速度

8、達到最大。 （5）抑制劑的影響：在抑制劑的條件下，酶的催化活性降低甚至喪失，從而影響酶的催化功能。抑制劑有可逆性抑制劑和不可逆性抑制劑之分。不可逆性抑制劑與酶分子結合后，抑制劑難以除去，酶活性難以恢復。可逆性抑制劑與酶的結合是可逆的，只要將抑制劑除去，酶活性即可恢復。 （6）激活劑的影響：在激活劑的影響下，酶的催化活性提高或者由無性得酶原生成有催化活性的酶。4、 舉例說明酶催化的絕對專一性和相對一性。答：一種酶只能催化一種底物進行一種反應，這種高度的專一性稱為絕對專一性。當酶作用的底物含有不對稱碳原子時，酶只能作用于異構體的一種。這種絕對專一性稱為立體異構專一性。例如，天冬氨酸氨裂合酶【EC4

9、.3.1.1】，僅作用于L-天冬氨酸，經(jīng)過脫氨基作用生成延胡索酸（反丁烯二酸）及其逆反應都一概不起作用。 一種酶能夠催化結構相似的底物進行某種相同類型的反應，這種專一性稱為相對專一性。相對專一性可分為鍵專一性和基團專一性。 鍵專一性的酶能夠作用于具有相同化學鍵的一類底物。如，酯酶可催化所有含酯鍵的酯類物質水解生成醇和酸。 基團專一性的酶則要求底物含有某一相同的基團。如，胰蛋白酶【EC3.4.31.4】選擇性地水解含有賴氨酰-或精氨酰-羰基肽鍵的物質，不管是氨酰、酯或多肽、蛋白質都能被該酶水解。六、綜合分析題,試述木瓜蛋白酶的生產(chǎn)方法。答：木瓜蛋白酶可以采用提取分離法、基因工程酶發(fā)酵法、植物細胞

10、培養(yǎng)法等多種方法進行生產(chǎn)。（1）提取分離法：從木瓜的果皮中獲得木瓜乳汁，通過各種分離純化技術獲得木瓜蛋白酶。（2）發(fā)酵法：通過DNA重組技術將木瓜蛋白酶的基因克隆到大腸桿菌等微生物中，獲得基因工程菌，再通過基因工程菌發(fā)酵獲得木瓜蛋白酶。（3）植物細胞培養(yǎng)法：通過愈傷組織誘導獲得木瓜細胞，再通過植物細胞培養(yǎng)獲得木瓜蛋白酶 第二章 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶名詞解釋1、酶的發(fā)酵生產(chǎn) 2、轉錄 3、翻譯 4、酶的誘導5、酶的反饋阻遏 6、分解代謝物阻遏 7、發(fā)酵動力學二、填空題1、轉錄是以DNA 為模板，以核苷三磷酸    為底物，在_依賴DNA的RNA聚合酶&

11、#160; 的作用下生成RNA    的過程。2、微生物產(chǎn)酶方式可以分為同步合成型，延續(xù)合成型 ,中期合成型，滯后合成型    四種。3、生長因素是細胞生長繁殖    所必需的微量有機化合物   。4、莫諾德常數(shù)Ks是指生長速率達到最大比生長速率一半   時的限制性基質濃度    。5、發(fā)酵動力學是研究發(fā)酵過程中細胞生長速率，產(chǎn)物生成速率  

12、60;，基質消耗速率及其影響因素的學科。三、選擇題1、可以通過添加（ C ）使分解代謝物阻遏作用解除。A、誘導物 B、激活劑 C、cAMP D、ATP2、在酶發(fā)酵過程中添加表面活性劑可以（D ）。A、誘導酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成C、提高酶活力 D、提高細胞透過性3、有些酶在細胞進入平衡期以后還可以繼續(xù)合成較長的一段時間，這是由于（ A）。A、該酶所對應的mRNA穩(wěn)定性好 B、該酶所對應的DNA穩(wěn)定性好C、細胞自溶后使酶分泌出來 D、培養(yǎng)基中還有充足的營養(yǎng)成分4、莫諾德常數(shù)是指（B ）A、反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度。B、比生長速率達到最大比生長速率一半時的限制性基質濃度。

13、C、產(chǎn)酶速率達到最大產(chǎn)酶速率一半時的限制性基質濃度。D、細胞生長速率達到最大細胞生長速率一半時的限制性基質濃度。四、判斷題（ X）1、固定化細胞在一定的空間范圍內生長繁殖，由于細胞密度增大，使生化反應加速，所以能夠提高酶活力。（ V）2、某些酶的催化反應產(chǎn)物可以誘導該酶的生物合成。（ V）3、在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的酶合成方式是延續(xù)合成型。（X）4、氨酰-tRNA合成酶具有識別mRNA和tRNA的功能。（ X）5、固定化原生質體與固定化細胞一樣可以進行生長繁殖和新陳代謝。五、簡答題 1、為什么屬于滯后合成型的酶要在細胞生長一段時間甚至進入平衡期以后才開始合成？答

14、：屬于滯后合成型的酶，之所以要在細胞生長一段時間甚至進入平衡期后才開始合成，主要有兩個原因：一是由于酶的生物合成受到培養(yǎng)基中阻遏作用，只有隨著細胞的生長，阻遏物幾乎被細胞用完而解除阻遏以后，酶才開始大量合成；二是由于該類型酶對所對應的mRNA穩(wěn)定性好，可以在細胞生長進入平衡期后的相當長的一段時間內，繼續(xù)進行酶的生物合成。簡述微生物發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的主要組分及其作用。答：培養(yǎng)基的主要組成包括：碳源、氮源、無機鹽和生長因子等。碳源是指能夠為細胞提供碳素化合物的營養(yǎng)物質。在一般情況下，碳源也是為細胞提供能量的能源。碳是構成細胞的主要元素之一，也是所有酶的重要組成元素。所以碳源是酶的生物合成法生產(chǎn)中必不

15、可少的營養(yǎng)物質。氮源是指能向細胞提供氮元素的營養(yǎng)物質。氮元素是各種細胞中蛋白質。核酸等組分的重要組成元素之一，也是各種酶分子的組成元素。氮源是細胞生長、繁殖和酶的生產(chǎn)的必不可少的營養(yǎng)物質。無機鹽的主要作用是提供細胞生命活動所必不可缺的各種無機元素，并對細胞內外的PH、氧化還原電位和滲透壓起調節(jié)作用。生長素是指細胞生長繁殖所必需的微量有機化合物。主要包括各種氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等。氨基酸是蛋白質的組分；嘌呤和嘧啶是核酸和某些輔助酶或輔基的組分；維生素主要是起輔酶作用。簡述微生物發(fā)酵產(chǎn)酶過程中工藝條件的限制性。答：微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的過程中，必須根據(jù)需要和變化情況，適時進行PH、溫度、溶解氧等發(fā)

16、酵工藝條件的控制。（1）PH的調節(jié)控制：培養(yǎng)基的PH與細胞的生長繁殖以及發(fā)酵產(chǎn)酶關系密切，不同的細胞，其生長繁殖的最適PH有所不同，細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適PH與生長最適PH也往往有所不同，所以必須根據(jù)不同的細胞特性和發(fā)酵的不同階段進行PH的控制。有些細胞可以同時生產(chǎn)若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的PH，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。隨著細胞的生長繁殖和新陳代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)基的PH往往會發(fā)生變化。所以在發(fā)酵過程中，必須根據(jù)變化的情況對培養(yǎng)基的PH進行適當?shù)目刂坪驼{節(jié)。調節(jié)PH的方法可以通過改變培養(yǎng)基的組分或其比例；也可以使用緩沖液來穩(wěn)定PH；或者在必要時通過流加適宜的酸、堿溶液的方法

17、，調節(jié)培養(yǎng)基的PH，以滿足細胞生長和產(chǎn)酶的要求。（2）溫度的調節(jié)控制：細胞的生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶需要一定的溫度條件，不同的細胞有各自不同的最適生長溫度。有些細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細胞生長的最適溫度有所不同，而且往往低于最適生長溫度。要在不同的發(fā)酵階段控制不同的溫度。即在細胞生長階段控制在細胞生長的最適溫度范圍，而在產(chǎn)酶階段，控制在產(chǎn)酶最適溫度。在細胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，由于細胞的新陳代謝作用，會不斷放出熱量，使培養(yǎng)基的溫度升高，同時，由于熱量的不斷擴散，會使培養(yǎng)基的溫度不斷降低。兩者綜合結果，決定了培養(yǎng)基的溫度。由于在細胞生長和產(chǎn)酶的不同階段，細胞新陳代謝放出的熱量有較大的差別，散失的熱量又

18、受到環(huán)境溫度等因素的影響，使培養(yǎng)基的溫度發(fā)生明顯的變化。為此必須經(jīng)常及時地對溫度進行調節(jié)控制，使培養(yǎng)基的溫度維持在適宜的范圍內。溫度的調節(jié)一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。為了及時地進行溫度的調節(jié)控制，在發(fā)酵罐或者其他的生物反應器中，均應設計有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等，并且隨時備有冷水和熱水以滿足溫度調控的需要。（3）溶解氧的調節(jié)控制：細胞的生長繁殖和酶的生物合成過程需要大量的能量，為零獲得足夠多的能量，細胞必須獲得充足的氧氣，使從培養(yǎng)基中獲得的能源物質經(jīng)過有氧降解而生成大量的ATP。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞一般只能吸收和利用溶解氧，由于氧是難溶于是的氣體，在通常情況

19、下，培養(yǎng)基中的溶解的氧并不多，在細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中原有的溶解氧很快就會被細胞利用完，為了滿足細胞的生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的需要，在發(fā)酵過程中必須不斷供給氧，使培養(yǎng)基中的溶解氧保持在一定的水平。溶解氧的調節(jié)控制，就是要根據(jù)細胞對溶解氧的需要量，連續(xù)不斷地進行補充，使培養(yǎng)基中的溶解氧的量保持恒定。溶解氧的供給，一般是將無菌空氣通入發(fā)酵容器，再在一定的條件下，使空氣中的氧溶解到培養(yǎng)液中，以供細胞生命活動之需。培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速率，溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間，氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質等有密切關系。一般來說，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長。

20、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響。隨著發(fā)酵過程的進行，細胞耗氧速率發(fā)生改變時，必須相應地對溶氧速率進行調節(jié)。調節(jié)溶解氧的方法主要有調節(jié)通氣量，調節(jié)氧的分壓，調節(jié)氣液接觸時間，調節(jié)接觸面積，改變培養(yǎng)液的性質等，可以根據(jù)不同菌種，不同產(chǎn)物、不同的生物反應器、不同的工藝條件下的不同情況選擇使用。以便根據(jù)發(fā)酵過程耗氧速率的變化而及時有效地調節(jié)溶氧速率。 4、固定化細胞發(fā)酵產(chǎn)酶有哪些特點？答：固定化細胞發(fā)酵產(chǎn)酶與游離細胞發(fā)酵產(chǎn)酶相比，具有下列顯著特點：1）提高酶產(chǎn)率：細胞經(jīng)過固定化后，在一定的空間范圍內生長繁殖，細胞密度增大，因而使細胞反

21、應加速，從而提高酶產(chǎn)率。例如，固定化枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶，在分批發(fā)酵時，其體積產(chǎn)酶率達到游離細胞的122%，在連續(xù)發(fā)酵時，產(chǎn)酶率更高。再如，轉基因大腸桿菌細胞生產(chǎn)酰胺酶，經(jīng)過固定化后的細胞比沒有選擇壓力時游離細胞的產(chǎn)酶率提高1020倍。2）可以反復使用或連續(xù)使用較長時間：固定化細胞固定在載體上，不容易脫落流失，所以固定化細胞可以進行半連續(xù)發(fā)酵，反復使用多次；也可以在高稀釋的條件下連續(xù)發(fā)酵較長時間。例如,固定化細胞進行酒精、乳酸等厭氧發(fā)酵，可以連續(xù)使用半年或者更長的時間；固定化細胞發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶等，也可以連續(xù)地使用30d以上。3）基因工程菌的質粒穩(wěn)定，不易丟失：基因工程菌經(jīng)過固定化后，由于有載體的

22、保護作用，質粒的結構穩(wěn)定性和分裂穩(wěn)定性都顯著提高。4）發(fā)酵穩(wěn)定性好：細胞經(jīng)過固定化后，由于受到載體的保護作用，使細胞對溫度、PH的適應范圍增寬；對蛋白酶和酶抑制劑等的耐受能力增強，所以能夠比較穩(wěn)定地進行發(fā)酵生產(chǎn)。這一特點使固定化細胞發(fā)酵的操作控制變得相對容易，并有利于發(fā)酵生產(chǎn)的自動化。5）縮短發(fā)酵周期，提高設備利用率：固定化細胞，如果經(jīng)過預培養(yǎng)，轉入發(fā)酵培養(yǎng)基以后，很快就可以發(fā)酵產(chǎn)酶，而且能夠較長時間維持產(chǎn)酶特性，所以可以縮短發(fā)酵周期，提高設備利用率。若不經(jīng)預培養(yǎng)，第一批發(fā)酵時，周期與游離細胞基本相同，但是第二批以后，其發(fā)酵周期將明顯縮短。例如，固定化黑曲霉細胞半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶，第一批發(fā)酵

23、時，周期為120h，與游離細胞發(fā)酵周期相同，但是從第二批發(fā)酵開始，發(fā)酵周期縮短至60h。若采用連續(xù)發(fā)酵，則可以在高稀釋的條件下連續(xù)穩(wěn)定地產(chǎn)酶，這就更加提高設備利用率。6）產(chǎn)品容易分離純化：固定化細胞不溶于水，發(fā)酵完成后，容易與發(fā)酵液分離，而且發(fā)酵液中所含的游離細胞很少，這就有利于產(chǎn)品的分離純化，從而提高產(chǎn)品的純度和質量。7）適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)：由于固定化細胞與載體結合在一起，所以固定化細胞一般只是用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。5、固定化微生物原生質體發(fā)酵產(chǎn)酶有哪些特點？答：（1）變胞內產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物：固定化原生質體由于解除了細胞壁的擴散障礙，可以使原本存在于細胞質中的胞內酶不斷分泌到細

24、胞外。變革了胞內酶的生產(chǎn)工藝。例如，筆者等人采用固定化黑曲霉原生質體生產(chǎn)葡萄糖氧化酶，使細胞內葡萄糖氧化酶的90%以上分泌到細胞外。（2）提高酶產(chǎn)率：由于出去了細胞壁，增加了細胞的通透性，有利于氧氣和其他營養(yǎng)物質的傳遞與吸收，也有利于胞內物質的分泌，可以顯著提高酶產(chǎn)率。例如，筆者等人的研究表明，固定化枯草桿菌原生質體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶，使原來存在于細胞間質中的堿性磷酸酶全部分泌到發(fā)酵液中，產(chǎn)酶率提高30%。（3）穩(wěn)定性好：固定化原生質體由于有載體的保護作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可以反復使用或者連續(xù)使用較長時間，利于連續(xù)生產(chǎn)。（4）易于分離純化：固定化原生質體易于和發(fā)酵液分開，有利

25、于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品質量。6、試述酵發(fā)酵動力學的主要內容。答：發(fā)酵動力學的主要內容包括細胞生長動力學，產(chǎn)物生成動力學和基質消耗動力學。細胞生長動力學主要研究發(fā)酵過程中細胞生長速率以及各種因素對細胞生長速率的影響規(guī)律；產(chǎn)物生成動力學主要研究發(fā)酵過程中產(chǎn)物生成速率以及各種因素對產(chǎn)物生成速率的影響規(guī)律；基質消耗動力學主要研究發(fā)酵過程中基質消耗速率以及各種因素對基質消耗速率的影響規(guī)律。六、綜合分析題1、在酵發(fā)酵生產(chǎn)過程中，為了提高酶的產(chǎn)率，可以采取哪些措施？答：在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，要使酶的產(chǎn)率提高，必須采取一系列的措施，主要的有：（1）使用優(yōu)良的產(chǎn)酶細胞：通過篩選、誘變、原生質體融合、基因重組

26、、定向進化等手段，獲得生長快、產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好的產(chǎn)酶細胞。（2）使用優(yōu)良的發(fā)酵生產(chǎn)設備：通過精心設計或者選擇使用高產(chǎn)、低耗的發(fā)酵罐等發(fā)酵生產(chǎn)設備。（3）采用先進的分離純化技術和設備：采用操作簡便、收得率高的分離化技術設備，以達到高產(chǎn)豐收的效果。（4）控制好工藝條件：在發(fā)酵過程中，要根據(jù)菌種特性，確定培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件，進行工藝優(yōu)化，并根據(jù)需要和變化的情況及時加以調節(jié)控制。（5）此外還可以采取某些行之有效地措施，諸如添加誘導物、控制阻遏物濃度、添加表面活性劑 等。2、從如下實驗方法和結果分析酶生物合成的調節(jié)作用。實驗方法：將大腸桿菌細胞接種于營養(yǎng)湯肉培養(yǎng)中，于37振蕩培養(yǎng)，當OD550達到0.

27、3左右時，將培養(yǎng)液分裝到4個小三角瓶中，每瓶17mL培養(yǎng)液。于4個三個瓶中分別添加（A）3mL無菌水；（B）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）和2mL無菌水；（C）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）、1mL葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mL無菌水；（D）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）、1mL葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mLcAMP鈉鹽溶液（0.1nmol/L）。然后在相同的條件下于于37振蕩培養(yǎng)2h，分別取樣測定B-半乳糖腺酶的活力。 實驗結果：（A）瓶和（C）瓶樣品的B-半乳糖腺酶活力為0，（B）瓶和（D）瓶樣品的B-半乳糖腺酶活力達到1000U/mL左右。答：從實驗方法和結果

28、可以進行下列分析，并得出如下結論：（1）（A）號瓶為對照，只加入無菌水，結果沒有半乳糖苷酶產(chǎn)生，表明半乳糖苷酶不是組成酶，而是誘導酶。（2）（B）號瓶加入半乳糖，結果在2h內半乳糖苷酶大量合成，表明乳糖是半乳糖苷酶的誘導劑。（3）（C）號瓶與（B）號瓶相比，在含有乳糖的基礎上增加了葡萄糖，結果也沒有半乳糖苷酶產(chǎn)生，表明半乳糖苷酶的合成受到葡萄糖的阻遏作用，由于葡萄糖是一種容易利用的碳源，其對半乳糖苷酶的阻遏作用屬于分解代謝物阻遏作用。（4）（D）號瓶與（C）號瓶相比，增加了cAMP結果半乳糖苷酶又大量合成，表明cAMP可以使分解代謝物阻遏作用解除。 第三章 動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、名詞解釋1、動

29、物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶2、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶3、端粒酶4、抗體酶5、半抗原6、超氧化物歧化酶7、纖維酶原激活劑二、填空題1、植物細胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)色素、香精、藥物、酶    、等次級代謝產(chǎn)物。2、動物細胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)疫苗、激素、單克隆抗體、多肽因子、酶等功能性蛋白質    。3、抗體酶的主要獲得方法有修飾法、半抗原誘導法  、酶蛋白抗原誘導法。4、植物細胞和微生物細胞的特性差異主要有細胞體積大，生長倍增時間長，營養(yǎng)要求較簡單，大多數(shù)需要光照，對剪切力敏感 等顯著特點。5、動物細胞培養(yǎng)方法主要有懸浮培

30、養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)、固定化細胞培養(yǎng) 。三、選擇題1、半抗原（ B ）A、可以誘導抗體生成，但不能與抗體特異結合B、可以與抗體特異結合，但不能誘導抗體生成C、可以誘導抗體產(chǎn)生，也可以與抗原特異結合D、不能與抗體特異結合，也不能與抗體特異結合2、端粒酶是（ CA、催化端粒水解的酶B、存在于端粒中的酶C、催化端粒生成和延長的酶D、催化RNA生成和延長的酶3、抗體酶是（B）A、具有催化活性的抗體分子B、具有催化活性的RNA分子C、催化抗體水解的酶D、催化抗體生成的酶4、纖溶酶原激活劑是（D）A催化纖溶酶水解反應的酶 B催化纖維蛋白水解反應酶 C催化纖維蛋白原水解反應酶 D催化纖溶酶原水解反應的酶四

31、、簡答題與計算題1、什么是端粒酶？簡述其催化過程。答：端粒酶（Telomerase）是催化端粒合成和延長的酶。端粒酶的催化過程主要包括下列3個步驟：（1）結合：端粒酶分子的RNA重復序列與DNA端粒末端按照互補原則結合。（2）延伸：以端粒酶分子的RNA為模板，通過反轉錄作用，使DNA分子上的端粒延伸。（3）移位：端粒酶移動到延伸后的端粒末端。重復上述過程，反復進行，使端粒不斷延。2、何謂抗體酶？試述獲得抗體酶的主要方法。抗體酶（abzyme）又稱為催化性抗體（catalytic antibody）,是一類具有生物催化功能的抗體分子。 抗體酶的制備方法主要有誘導法，修飾法等。 修飾法是對抗體進行

32、分子修飾，在抗體與抗原的結合部位引進催化基因，而成為抗體酶的方法。誘導法是利用特定的抗原誘導抗體酶合成的方法，根據(jù)所采用的抗原不同，誘導法有半抗原誘導法和酶蛋白抗原誘導法。 半抗原誘導法是以預先設計的過渡態(tài)類似物作為半抗原，與載體蛋白（如牛血清蛋白等）偶聯(lián)制成抗原，然后免疫動物，再經(jīng)過單克隆抗體制備技術制備、分離、篩選得到所需的抗體酶。 酶蛋白抗原誘導抗體酶的生成是以某種外源酶蛋白作為抗原誘導抗體酶產(chǎn)生的方法。首先選定一種酶蛋白作為抗原免疫動物，在酶蛋白抗原的誘導下，動物體內產(chǎn)生與酶分子特異結合的抗體，再將獲得的酶抗體免疫動物，并采用單克隆抗體技術制備得到與酶抗體特異結合的抗抗體。那么，抗抗體

33、結合部位的構象與用作抗原的酶分子的結合中心的構象相同，對抗抗體進行篩選，就有可能獲得具有催化活性的抗體酶。3、 植物細胞培養(yǎng)有何特點？答：植物細胞培養(yǎng)具有如下顯著特點：（1）提高產(chǎn)率：使用優(yōu)良的植物細胞進行培養(yǎng)生產(chǎn)天然產(chǎn)物，可以明顯提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)率，例如，日本三井石油化學工業(yè)公司于1983年在世界上首次成功地采用紫草細胞培養(yǎng)23天。細胞中紫草寧的含量達到細胞干重的14%，比紫草根中紫草寧的含量高10倍，植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧的比產(chǎn)率達到5.7mg/d*g細胞，比種植紫草寧比產(chǎn)率（0.0068mg/d*g植物）高830倍。（2）縮短周期：植物細胞聲場的倍增時間一般為1260h，一般生產(chǎn)周期15

34、30d，這比起微生物來時相當長的時間，但是與完整植物的生長周期比較，卻是大大地縮短生產(chǎn)周期。一般植物從發(fā)芽、生長到收獲，短則幾個月，長則數(shù)年甚至更長時間。例如，木瓜的生長周期一般為8個月，紫草為5年，野山參則更長。（3）易于管理，減輕勞動強度：植物細胞培養(yǎng)在人工控制條件的生物反應器中進行生產(chǎn)，不受地理環(huán)境和氣候條件等的影響，易于操作管理，大大減輕勞動強度，改善勞動條件。（4）提高產(chǎn)品質量：植物細胞培養(yǎng)的主要產(chǎn)物的產(chǎn)率較高，雜質較少，在嚴格控制條件的生物反應器中生產(chǎn)，可以減少環(huán)境中的有害物質的污染和微生物、昆蟲等的侵蝕，產(chǎn)物易于分離純化，從而使產(chǎn)品質量提高。（5）植物細胞對剪切力敏感 。（6）植

35、物細胞培養(yǎng)需要一定的光照。4、舉例說明植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝流程。答：植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程一般包括愈傷組織的誘導，細胞懸浮培養(yǎng)和酶的分離純化三個階級，現(xiàn)以大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD）為例，說明其工藝過程。（1）愈傷組織的誘導：選取結實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，在4冰箱中放置3周，以打破休眠。去除外皮，先用70%乙醇消毒20秒，再用0.1%氯化汞消毒10min，成0.5cm3左右的小塊，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L 6-BA的半固體MS培養(yǎng)基中，25、600lux12h/d光照的條件下培養(yǎng)18d,誘導得到愈傷組織，每18d繼代一次。 （2）細胞懸浮培養(yǎng)：將上述

36、在半固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d的愈傷組織，在無菌條件下轉入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L 6-BA的液體MS培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，25、600lux、12h/d的光照條件下振蕩培養(yǎng)1012d，使愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞。然后再無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細胞團或單細胞轉入含有3mg/L2，4-D和1.2mg/L 6-BA的液體MS培養(yǎng)基中，25、600lux、2h/d光照的條件下培養(yǎng)18d。 （3）酶的分離純化：細胞培養(yǎng)完成后，收集細胞，經(jīng)過細胞破碎，用pH7.8的磷酸緩沖液提取、有機溶劑沉淀等，分離得到超氧化物歧化酶。5、 試述植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝條件及其控制。答：在植

37、物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝條件及其控制主要包括培養(yǎng)基，溫度，pH，溶解氧，光照等。 （1）培養(yǎng)基：植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基與微生物培養(yǎng)基有較大的差別，其主要不同點在于：植物細胞的生長和代謝需要大量的無機鹽，除了P、S、N、K、Na、Ca、Mg等大量元素以外，還需要Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等微量元素；植物細胞需要多種維生素和植物生長激素，如硫胺素、吡哆素、煙酸、肌醇、生長素、分裂素等；植物細胞要求的氮源一般為無機氮源，即植物細胞可以同化硝酸鹽和銨鹽；植物細胞一般以蔗糖為碳源。 （2）溫度：植物細胞培養(yǎng)的溫度一般控制在室溫范圍（25左右）。溫度高些，對植物細胞的生長有利，溫度低些，則對次級代謝物

38、的積累有利，但是通常不能低于20，也不要高于35。有些植物細胞的最適生長溫度和最適產(chǎn)酶溫度有所不同，要在不同的階段控制不同的溫度。 （3）pH：植物細胞的pH一般控制在微酸性范圍，即pH 56。培養(yǎng)基配置時，pH一般控制在5.55.8范圍，在植物細胞培養(yǎng)過程中，一般pH變化不大。 （4）溶解氧：植物細胞的生長和產(chǎn)酶需要吸收一定得溶解氧。溶解氧一般通過通風和攪拌來供給。適當?shù)耐L、攪拌還可以使植物細胞不至于凝集成較大的細胞團，以使細胞分散，分布均勻，有利于細胞的生長和新陳代謝。然而，由于植物細胞代謝較慢，需氧量不多，過量的氧反而會帶來不良影響。假山植物細胞體積大、較脆弱、對剪切力敏感，所以通風和

39、攪拌不能太強烈，以免破壞細胞。這在植物細胞反應器的設計和實際操作中，都要予以充分注意。 （5）光照：光照對植物細胞培養(yǎng)有重要影響，大多數(shù)植物細胞的生長以及次級代謝物的生長要求一定波長的光的照射，并對光照強度和光照時間有一定的要求，而有些植物次級代謝物的生物合成卻受到光的抑制。例如，歐芹細胞在黑暗的條件下可以生長，但是只有在光照的條件下，才能形成類黃酮化合物；植物細胞中萘醌的生物合成受到光的抑制等。筆者等人的研究表明，光質對于玫瑰茄細胞培養(yǎng)生產(chǎn)花青素有顯著影響，其中藍光（波長420530nm）可以顯著促進花青素的生物合成。因此在植物細胞培養(yǎng)過程中，應當根據(jù)植物細胞的特性以及目標次級代謝物的種類不

40、同，進行光照的調節(jié)控制。尤其是在植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)過程中，如何滿足植物細胞對光照的要求，是反應器設計和實際操作中要認真考慮并有待研究解決的問題。 （6）前體的添加：前體是指出于目的代謝物代謝途徑上游的物質。為了提高植物細胞培養(yǎng)生長次級代謝物的產(chǎn)量，在培養(yǎng)過程中添加目的代謝物的前體是一種有效的措施。例如，在辣椒細胞培養(yǎng)生產(chǎn)辣椒胺的過程中，添加苯丙氨酸作為前體，可以全部轉變?yōu)槔苯钒?，添加香草酸和異癸酸作為前體，亦可以顯著提高辣椒胺的產(chǎn)量。 （7）刺激劑的應用：刺激劑可以促進植物細胞中的物質代謝朝著某些次級代謝物生成的方向進行，從而強化次級代謝物的生物合成，提高某些次級代謝物的產(chǎn)率。所以在植物細胞

41、培養(yǎng)中添加適當?shù)拇碳┘纯梢燥@著提高某些次級代謝物的產(chǎn)量。常用的刺激劑有微生物細胞壁碎片和果膠酶、纖維素酶等微生物胞外酶。例如，Rolfs等人用霉菌細胞壁碎片為刺激劑，使花生細胞中L-苯丙氨酸氨基裂合酶的含量增加4倍，同時使二丙乙烯合酶的量提高20倍；Funk等人采用酵母葡聚糖（酵母細胞壁的主要成分）作為刺激劑，可使細胞積累小蘗堿的量提高4倍；筆者等人在鼠尾草細胞懸浮培養(yǎng)中，添加0.5U/mL的果膠酶作為刺激劑，可使細胞中迷迭香酸的產(chǎn)量提高62%。6、 試述動物細胞培養(yǎng)的特點。答：（1）動物細胞培養(yǎng)主要用于各種功能蛋白質的生產(chǎn)，如疫苗、激素、酶、單克隆抗體、多肽生長因子等。 （2）動物細胞的生

42、長較慢，細胞倍增時間15100h。 （3）為了防止微生物污染，在培養(yǎng)過程中，需要添加抗生素。加進的抗生素藥能夠防治細菌的污染，又不影響動物細胞的生長?，F(xiàn)在一般采用青霉素（50100U/mL）和鏈霉素（50100 U/mL）聯(lián)合作用。也可以添加一定濃度的兩性霉素（fungizone）、制霉菌素（mycostatin）等。此外，為了防治支原體的污染，可以采用卡那霉素、金霉素、泰樂菌素等進行處理。 （4）動物細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感，所以在培養(yǎng)過程中，必須嚴格控制溫度、pH、滲透壓、通風攪拌等條件，以免破壞細胞。 （5）大多數(shù)動物細胞具有錨地依賴性，適宜采用貼壁培養(yǎng)；有部分細胞，例如來

43、自血液、淋巴組織的細胞、腫瘤細胞和雜交瘤細胞等，可以采用懸浮培養(yǎng)。 （6）、動物細胞培養(yǎng)基成分較復雜，一般要添加血清或其它用品，產(chǎn)物的分離純化過程較繁雜，成本較高，適用于高價值藥物的生產(chǎn)。原代細胞繼代培養(yǎng)50代后，即會退化死亡，需要重新分離細胞。7、 動物細胞培養(yǎng)過程中要注意控制哪些工藝條件？答：在動物細胞培養(yǎng)中，要掌握好培養(yǎng)基，溫度，pH，滲透壓，溶解氧等各種工藝條件并根據(jù)具體情況進行適當?shù)目刂啤?（1）、培養(yǎng)基動物細胞培養(yǎng)基的組分較為復雜，包括氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖、激素、生長因子等。動物細胞培養(yǎng)液的組分復雜，有些組分的含量很低。所以應首先配制各類母液，如100倍濃度氨基酸母液，1

44、000倍濃度維生素母液，100濃度葡萄糖母液（溶解于平衡鹽溶液）等；在使用前，分別吸取一定體積的母液，混勻得到混合母液，膜過濾除菌后，冷凍備用；使用時，取一定體積的混合母液，用無菌的平衡鹽溶液稀釋至所需濃度。（2）、溫度的控制 溫度對動物細胞的生長和代謝有密切關系。一般控制在36.5，允許溫度波動范圍在0.25之內。 溫度的高低也會影響培養(yǎng)基的pH，因為在溫度降低時，可以增加CO2的溶解度，而使Ph降低。（3）、pH的控制 培養(yǎng)基的pH對動物細胞的生長和新陳代謝有顯著影響。一般控制在pH7.07.6的微堿性范圍內，通常動物細胞在pH7.4的條件下生長最好。 在動物細胞培養(yǎng)基過程中，隨著新陳代謝

45、的進行，培養(yǎng)液的pH將發(fā)生變化。從而影響動物細胞的正常生長和代謝。為此，在培養(yǎng)過程中需要對培養(yǎng)基的pH進行檢測和調節(jié)。 培養(yǎng)基中pH的調節(jié)，通常采用CO2和NaHCO3溶液。增加CO2的濃度，可使培養(yǎng)液的pH降低；添加碳酸氫鈉溶液，可使pH升高。然后，通過改變CO2的濃度的方法來調節(jié)pH，會對培養(yǎng)液中的溶解氧產(chǎn)生影響。所以在pH控制系統(tǒng)的設計和操作過程中，應當同時考慮溶解氧控制。在細胞密度高時，由于產(chǎn)生的CO2和乳酸等物質的量增加，pH的變化較大，需要時可以采用流加酸液或局部pH的較大波動和滲透壓的增加，會對細胞生長帶來不利的影響。 為了避免培養(yǎng)過程中pH的快速變化，維持pH的穩(wěn)定，通常在培養(yǎng)

46、液中加入緩沖系統(tǒng)。例如，CO2和NaHCO3系統(tǒng)，檸檬酸與檸檬酸鹽系統(tǒng)等。此外，另一個被廣泛采用的緩沖系統(tǒng)是羥乙基呱嗪乙磺酸（HEPES）。HEPES的添加濃度一般為25mmol/L，則可能對某些細胞產(chǎn)生毒害作用。檢測動物細胞培養(yǎng)液中pH的變化，常用的指示劑為酚紅?？梢愿鶕?jù)酚紅顏色的變化確定pH。藍紅色為pH7.6，紅色為pH7.4，橙色為pH7.0，黃色為pH6.5。(4）滲透壓的控制動物細胞培養(yǎng)液中滲透壓應當與細胞內的滲透壓出于等滲狀態(tài)。一般控制在700850kPa范圍內。在配制培養(yǎng)液或者改變培養(yǎng)基成分時，要特別注意。（5）溶解氧的控制 溶解氧的供給對動物細胞培養(yǎng)至關重要。供氧不足時，細胞

47、生長受到抑制，氧氣過量時，也會對細胞產(chǎn)生毒害。8、 舉例說明動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝流程。答：現(xiàn)以人黑色素瘤細胞培養(yǎng)產(chǎn)生組織纖維酶原活化劑為例。說明動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程及其控制。 人黑色素瘤細胞培養(yǎng)采用Eagle培養(yǎng)基其工藝過程如下： （1）、將人黑色素瘤的種質細胞用胰蛋白酶消化處理，分散，用pH7.4的磷酸緩沖液洗滌，計數(shù)，稀釋成細胞懸浮液； （2）、在消毒好的反應器中裝進一定量的培養(yǎng)液，將上述細胞懸浮液接種至反應器中，接種濃度為（13）*1000個細胞mL，于37的CO2培養(yǎng)箱中，通入含5% CO2的無菌空氣，培養(yǎng)至長成單層致密細胞； （3）、傾去培養(yǎng)液，用pH7.4的磷酸緩沖液洗滌細

48、胞23次； （4）、換入一定量的無血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)； （5）、每隔34d，取出培養(yǎng)液進行tPA的分離純化； （6）、然后再向反應器中加入新鮮的無血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得大量tPA； （7）、從上述獲得的培養(yǎng)液中采用親和層析等技術進行分離純化，獲得組織纖溶酶原活化劑。第四章 酶的提取與分離純化8、電泳9、萃取10、雙水相萃取11、超臨界萃取12、過濾13、膜分離技術14、結晶一、名詞解釋1、細胞破碎2、酶的提取3、沉淀分離4、層析分離5、凝膠層析6、親和層析7、離心分離二、填空題1、細胞破碎的主要方法有機械破碎，物理破碎，-化學破碎法，酶促破碎法  。2、酶

49、的提取方法主要有鹽溶液提取，酸溶液提取，堿溶液提取，有機溶劑提取    。3、結晶的方法主要有鹽析結晶法    ，有機溶劑結晶法，透析平衡結晶法，等電點結晶法。4、離心方法主要有差速離心，密度低度離心，等密梯度離心  。5、加壓膜分離可以分為微濾，超濾  ，反滲透。6、常用的萃取方法有有機溶劑萃取，雙水相萃取，超臨界萃取，反膠束萃取。7、按照凝膠的組成系統(tǒng)不同，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分為連續(xù)凝膠電泳，不連續(xù)凝膠電泳，濃度梯度凝膠電泳，SDS凝膠電泳  。8、在CO2超臨界萃取中，目標產(chǎn)物的分離方

50、法主要有等壓分離，等溫分離，吸附分離。三、選擇題1、酶的提取是（D ）的技術過程。A、從含酶物料中分離獲得所需酶B、從含酶溶液中分離獲得所需酶C、使胞內酶從含酶物料中充分溶解到溶劑或者溶液中D、使酶從含酶物料中充分溶解到溶劑或者溶液中2、在凝膠層析的洗脫過程中，（A ）A、分子質量最大的分子最先流出B、分子質量最小的分子最先流出C、蛋白質分子最先流出D、鹽分子最先流出3、超臨界流體能夠用于物質分離的主要原因在于（C ）A、超臨界流體的密度接近于液體B、超臨界流體的黏度接近于液體C、在超臨界流體中不同物質的溶解度不同D、超臨界流體的擴散系數(shù)接近于氣體，是通常液體的近百倍4、在等電點聚集電泳系統(tǒng)中

51、，形成pH梯度的主要原因是（B ）A、系統(tǒng)中有pH梯度支持介質B、系統(tǒng)中有兩性電解質載體C、系統(tǒng)中有不同等電點的蛋白質D、系統(tǒng)中陽極槽裝酸液，陰極槽裝堿液四、簡答題1、簡述酶沉淀分離的主要方法及其原理。答：沉淀分離的方法主要有鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法、復合沉淀法、選擇性變性沉淀法等。 （1）、鹽析沉淀法：鹽析沉淀法簡稱鹽析法，是利用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽。使酶或雜質從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質分離的過程。 蛋白質在水中的溶解度收到溶液中鹽濃度的影響。在鹽濃度達到到一定濃度后，蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而降低，結果使

52、蛋白質沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。在某一濃度的鹽濃度中，不同蛋白質的溶解度各不相同，由此可達到彼此分離的目的。 鹽之所以會改變蛋白質的溶解度，是由于鹽在溶液中離解為正離子和負離子。由于反離子作用，使蛋白質分子表面的電荷改變，同時由于離子的存在改變了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改變。 （2）、等電點沉淀法：利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質有 不同的等電點這一特性，通過調節(jié)溶液的pH，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離的方法稱為等電點沉淀法。 在溶液的pH等于溶液中某兩性電解質的等電點時，該兩性電解質分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀

53、下來。 （3）、有機溶劑沉淀法：利用酶與其他雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離的方法稱為有機溶劑沉淀法。 有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶劑的介電常數(shù)降低。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與誰互相作用，使溶質分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。 （4）、復合沉淀法：在酶液中加入某些物質，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質分離的方法稱為復合沉淀法。 復合沉淀法可以與酶分子形成復合物，復合物的溶解度降低，從而使

54、沉淀析出， （5）、選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質變性沉淀，而不影響所需的酶，這種分離方法稱為選擇性變性沉淀。 選擇性變性沉淀法是選擇某個適宜的條件某些雜質而沉淀析出，而又對酶沒有明顯影響，所以可以達到分離的目的。2、 何謂膜分離技術？在酶的生產(chǎn)中有何應用？答：借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質顆?；蚍肿舆M行分離的技術稱為膜分離技術。 在酶的生產(chǎn)中，可以利用微濾技術除去粗酶液中的微生物細胞，利用超濾技術除去相對分子質量不同的蛋白質等雜質，進行酶的分離純化，同時還達到酶液濃縮的目的，特別適用于液體酶制劑的生產(chǎn)。3、 簡述雙水相萃取的概念

55、與特點。答：雙水相萃取是利用溶質在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達到分離的萃取技術。 雙水相萃取由于兩相都是水溶液，可以避免酶的變性失活，但是雙水相系統(tǒng)中水的含量高，分離后的酶濃度低，需經(jīng)過濃縮等以提高濃度，雙水相系統(tǒng)中含有高分子聚合物或鹽類，在分離后需要進一步進行分離純化，以除去高分子聚合物和鹽類等雜質。4、 簡述超臨界萃取的概念與特點。答：超臨界萃取又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質與雜質在超臨界流體中的溶解度不同而達到分離的一種萃取技術， 超臨界萃取以超臨界流體作為萃取劑，超臨界流體的物理特性和傳質特性通產(chǎn)介于液體和氣體之間，適于作為萃取溶劑；超臨界流體的密度比氣體密度大得多，接

56、近于液體密度，因此其溶解能力與液體相似；接近氣體的黏度，有利于物質的擴散，其擴散系數(shù)接近于氣體，是通常液體的近百倍，因此超臨界流體具有很高的萃取速度；超臨界流體對物質的溶解度能力隨著溫度和壓力的變化而變化，萃取后易于分離；不同的物質在超臨界流體中的溶解度不同，溶解度大的物質溶解在超臨界流體中，與不溶解解或溶解度小的雜質分離，然后通過升高溫度、降低壓力或者通過吸附劑的作用，從含有目標物質的超臨界流體中得到所需的物質。 目前在超臨界萃取中最常用的超臨界流體是CO2。 CO2超臨界點的溫度為31.1,超臨界壓力為7.3MPa，超臨界密度為0.47g/mL。特別適用于生物活性物質的提取分離。5、 試述

57、凝膠層析的原理與操作要點。答：凝膠層析是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達到物質分離的一種層析技術。 （1）、凝膠層析的基本原理：凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，各組分在層析柱內同時進行兩種不同的運動，一種是隨著溶液流動而進行垂直向下的移動，另一種是無定向的分子擴散運動（布朗運動）。大分子物質由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內外，這就使小分子物質向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。在凝膠層析中，相對分子質量也并不是唯一的分離依據(jù)，有些物質的相對分子質量相同，但由于分子的形狀不同，再加上各種物質與凝膠之間存在著非特異性的吸附