基因治療（課堂PPT）

1、.1第第 十十 一一 章章基因治療基因治療Gene Therapy.2 本章，我們討論本章，我們討論4 4個(gè)問(wèn)題。個(gè)問(wèn)題。 1.1.概述概述 2.2.基因治療的原理基因治療的原理 3.3.基因治療中外源基因?qū)爰夹g(shù)基因治療中外源基因?qū)爰夹g(shù) 4.4.基因治療的應(yīng)用研究基因治療的應(yīng)用研究.3 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述.4 人類疾病的發(fā)生，往往涉及到內(nèi)源基因的突變?nèi)祟惣膊〉陌l(fā)生，往往涉及到內(nèi)源基因的突變（如遺傳?。┖屯庠椿虻娜肭郑ㄈ绺腥拘约膊。?。（如遺傳?。┖屯庠椿虻娜肭郑ㄈ绺腥拘约膊。?。機(jī)體對(duì)外來(lái)侵襲抵御體現(xiàn)在以下機(jī)體對(duì)外來(lái)侵襲抵御體現(xiàn)在以下4 4個(gè)層次：個(gè)層次： 1.1.整體水平整體水平，

2、諸如動(dòng)物的打斗撕咬；，諸如動(dòng)物的打斗撕咬； 2.2.細(xì)胞水平細(xì)胞水平，如，如MM對(duì)對(duì)“異已異已”吞噬作用；吞噬作用； 3.3.分子水平分子水平，如抗原抗體反應(yīng)，人可以產(chǎn)生，如抗原抗體反應(yīng)，人可以產(chǎn)生10106 6抗體分子，對(duì)付外來(lái)侵襲；抗體分子，對(duì)付外來(lái)侵襲； 4.4.基因水平基因水平，對(duì)付外源基因入侵，在原核生，對(duì)付外源基因入侵，在原核生物中有一種限制性核酸內(nèi)切酶可將外源基因水解掉。物中有一種限制性核酸內(nèi)切酶可將外源基因水解掉。.5 對(duì)于內(nèi)源基因突變對(duì)于內(nèi)源基因突變: : 至今未找到令人滿意的治療方法。至今未找到令人滿意的治療方法。 基因治療僅僅處于初始階段?；蛑委焹H僅處于初始階段。 全世

3、界接受基因治療者全世界接受基因治療者106106人，受試者人，受試者600600人人.6定義：定義： 廣義地說(shuō)廣義地說(shuō)，基因治療是應(yīng)用基因或基因產(chǎn)物，基因治療是應(yīng)用基因或基因產(chǎn)物，治療疾病的一種方法。治療疾病的一種方法。從狹義地說(shuō)從狹義地說(shuō)，基因治療，基因治療是把外界的正?；蚧蛑委熁颍ㄟ^(guò)載體轉(zhuǎn)是把外界的正?；蚧蛑委熁?，通過(guò)載體轉(zhuǎn)移到人體的靶細(xì)胞，進(jìn)行基因修飾和表達(dá)，改移到人體的靶細(xì)胞，進(jìn)行基因修飾和表達(dá)，改善疾病的一種治療手段。善疾病的一種治療手段。 一、基因治療的概念一、基因治療的概念 基因治療是治療基因突變性疾病的一項(xiàng)根本基因治療是治療基因突變性疾病的一項(xiàng)根本性措施，同時(shí)它為非基

4、因突變性疾病提供了一性措施，同時(shí)它為非基因突變性疾病提供了一個(gè)新的治療手段。個(gè)新的治療手段。.7二、基因治療的策略二、基因治療的策略兩個(gè)基本策略兩個(gè)基本策略: :原位矯正病變基因原位矯正病變基因基因取代或基因干預(yù)基因取代或基因干預(yù).8 象外科移植手術(shù)，切除病變部分，換上正象外科移植手術(shù)，切除病變部分，換上正常健康基因，這在目前還難以做到常健康基因，這在目前還難以做到 ( (一一) )原位矯正病變基因原位矯正病變基因( (糾正異常堿基糾正異常堿基) )圖圖11-1 11-1 鐮形紅細(xì)胞貧血病人的鐮形紅細(xì)胞貧血病人的HbHb為為HbS(HbS(由由 珠蛋白基因點(diǎn)突變引起珠蛋白基因點(diǎn)突變引起) ).

5、9( (二二) )基因取代或基因干預(yù)基因取代或基因干預(yù)基因置換基因置換 (gene replacement)(gene replacement)通過(guò)體內(nèi)基因同源重組通過(guò)體內(nèi)基因同源重組, ,原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因基因增補(bǔ)基因增補(bǔ) (gene augmentation)(gene augmentation)不除去異?；?，向靶細(xì)胞導(dǎo)入外源基因通過(guò)非定點(diǎn)不除去異?；?，向靶細(xì)胞導(dǎo)入外源基因通過(guò)非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物，從而彌補(bǔ)缺陷基因的功能整合，使其表達(dá)產(chǎn)物，從而彌補(bǔ)缺陷基因的功能基因干預(yù)基因干預(yù) (gene interference)(gene interfer

6、ence)在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)。包括反義在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)。包括反義RNARNA、核酶核酶、三鏈三鏈DNADNA及干擾及干擾RNARNA技術(shù)技術(shù).10 三、基因治療中的靶細(xì)胞三、基因治療中的靶細(xì)胞 生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞: : 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)治本治本 困難困難生殖生殖( (學(xué)學(xué)) )生物學(xué)問(wèn)題生物學(xué)問(wèn)題，極其復(fù)雜且不清楚。，極其復(fù)雜且不清楚。 倫理學(xué)問(wèn)題倫理學(xué)問(wèn)題名人精子庫(kù)名人精子庫(kù)”，“美女卵子庫(kù)美女卵子庫(kù)”，總是別人的，總是別人的“種種”，不好辦，即使這個(gè)問(wèn)題解決，恐怕未必，不好辦，即使這個(gè)問(wèn)題解決，恐怕未必然，愛(ài)因斯坦生了個(gè)弱智女，馬克思后代在開出然，愛(ài)因斯坦生

7、了個(gè)弱智女，馬克思后代在開出租車（不是說(shuō)開出租車不好，特此聲明）租車（不是說(shuō)開出租車不好，特此聲明）.11體細(xì)胞體細(xì)胞目前常用體細(xì)胞有：目前常用體細(xì)胞有： 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 骨髓細(xì)胞骨髓細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞 皮膚纖維細(xì)胞皮膚纖維細(xì)胞 肝細(xì)胞肝細(xì)胞 肌細(xì)胞肌細(xì)胞 角化細(xì)胞角化細(xì)胞(keratinoyte)(keratinoyte) 多種腫瘤細(xì)胞多種腫瘤細(xì)胞附附: :選擇靶細(xì)胞依據(jù)選擇靶細(xì)胞依據(jù)疾病累及的主要部位。疾病累及的主要部位。靶細(xì)胞來(lái)源的難易程度。靶細(xì)胞來(lái)源的難易程度。體外培養(yǎng)的成活率和存活時(shí)間。體外培養(yǎng)的成活率和存活時(shí)間。接受正?；虻哪芰?。接受正?；虻哪芰?。新的正常基因能否在靶細(xì)胞

8、能否新的正?；蚰芊裨诎屑?xì)胞能否 正常表達(dá)和持續(xù)時(shí)間。正常表達(dá)和持續(xù)時(shí)間。.12 四、基因治療的途徑四、基因治療的途徑 1.1.間接體內(nèi)療法（間接體內(nèi)療法（ex vivoex vivo） 體外將治療基因體外將治療基因靶細(xì)胞內(nèi)靶細(xì)胞內(nèi), ,再將經(jīng)基因修飾再將經(jīng)基因修飾靶細(xì)胞靶細(xì)胞病人病人, ,使這種外源基因使這種外源基因( (細(xì)胞細(xì)胞) )在體內(nèi)表達(dá)，在體內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到基因治療目的從而達(dá)到基因治療目的.(.(目前多采用這種療法目前多采用這種療法) )。2.2.體內(nèi)法體內(nèi)法(in vivo)(in vivo) 外源基因外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)組織器官直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)組織器官進(jìn)入進(jìn)入相應(yīng)組織器官進(jìn)

9、行表達(dá)相應(yīng)組織器官進(jìn)行表達(dá)從而達(dá)到基因治療目的。從而達(dá)到基因治療目的。.13 基因治療的基因治療的 基本原理基本原理第第 二二 節(jié)節(jié).14基因治療的基本程序基因治療的基本程序( (基本原理或基本步驟基本原理或基本步驟) )：治療性基因的選擇治療性基因的選擇基因載體的基因載體的選擇選擇 病毒載體病毒載體 非病毒載體非病毒載體靶細(xì)胞的選擇靶細(xì)胞的選擇 體細(xì)胞體細(xì)胞 生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞載體與治療基因載體與治療基因重組及篩選鑒定重組及篩選鑒定將重組將重組DNADNA導(dǎo)入靶細(xì)胞導(dǎo)入靶細(xì)胞, ,檢測(cè)目檢測(cè)目的基因和標(biāo)記基因的表達(dá)產(chǎn)物的基因和標(biāo)記基因的表達(dá)產(chǎn)物.15基因治療的基本程序基因治療的基本程序( (基

10、本原理或基本步驟基本原理或基本步驟) )：基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移 間接體內(nèi)療法間接體內(nèi)療法 直接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的篩轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的篩選與鑒定選與鑒定回輸體內(nèi)回輸體內(nèi)利用標(biāo)記基因和目的基因的表達(dá)產(chǎn)物利用標(biāo)記基因和目的基因的表達(dá)產(chǎn)物利用核酸分子雜交利用核酸分子雜交考核療效和安全性考核療效和安全性.16 基因工程基因工程 基因治療基因治療1. 目的基因目的基因 應(yīng)用或研究基因應(yīng)用或研究基因 標(biāo)志基因標(biāo)志基因+治療基因治療基因2. 載載 體體 (原核或真核原核或真核) (真核真核)3. 靶靶 細(xì)細(xì) 胞胞 原、真核原、真核 真真 核核4. DNA體外重組體外重組 5. 重組重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿

11、主細(xì)胞 6. 后處理后處理 基因治療與基因工程的比較基因治療與基因工程的比較.17 第第 三三 節(jié)節(jié)基 因 轉(zhuǎn) 移 技 術(shù)基 因 轉(zhuǎn) 移 技 術(shù).18 生物學(xué)方法生物學(xué)方法 非生物學(xué)方法非生物學(xué)方法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣共沉淀法 腺病毒載體腺病毒載體 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA/脂質(zhì)體法脂質(zhì)體法腺相關(guān)病毒載體腺相關(guān)病毒載體 電擊法電擊法單純皰疹病毒載體單純皰疹病毒載體 受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法 注射法注射法以逆轉(zhuǎn)錄病毒法最為常用，以磷酸鈣法最為便宜（經(jīng)濟(jì)），以注射以逆轉(zhuǎn)錄病毒法最為常用，以磷酸鈣法最為便宜（經(jīng)濟(jì)），以注射法最為簡(jiǎn)捷，最值得研究和推廣應(yīng)用（笑話，也最危險(xiǎn)。）法

12、最為簡(jiǎn)捷，最值得研究和推廣應(yīng)用（笑話，也最危險(xiǎn)。）轉(zhuǎn)移基因方法轉(zhuǎn)移基因方法.19.20 一一. .病毒載體病毒載體轉(zhuǎn)基因的生物學(xué)方法轉(zhuǎn)基因的生物學(xué)方法（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活（命）周期（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活（命）周期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)( (三三) ) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn) ( (四四) ) 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)（五）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備（五）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備（六）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（六）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（七）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的安全性問(wèn)題（七）逆

13、轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的安全性問(wèn)題.21 1.1.吸附吸附病毒衣殼糖蛋白與細(xì)胞膜受體特異性結(jié)合，吸病毒衣殼糖蛋白與細(xì)胞膜受體特異性結(jié)合，吸 附在膜受體上。附在膜受體上。 2.2.入胞入胞病毒核酸進(jìn)入病毒核酸進(jìn)入hosthost細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄，整合到細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄，整合到 host DNA host DNA 中去，轉(zhuǎn)錄、復(fù)制中去，轉(zhuǎn)錄、復(fù)制 3.3.病毒顆粒成熟病毒顆粒成熟病毒核酸和病毒蛋白裝配成成熟病毒核酸和病毒蛋白裝配成成熟 病毒顆粒病毒顆粒 4.4.病毒顆粒的釋放病毒顆粒的釋放釋放的子病毒又可感染其它細(xì)釋放的子病毒又可感染其它細(xì) 胞，每個(gè)細(xì)胞可以釋放胞，每個(gè)細(xì)胞可以釋放10105 5子病毒。

14、子病毒。（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活（命）周期（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活（命）周期.22 圖圖11-2 Rous11-2 Rous肉瘤病毒毒粒結(jié)構(gòu)示意圖肉瘤病毒毒粒結(jié)構(gòu)示意圖.231.1.一般特征一般特征(1)(1)正鏈正鏈RNARNA病毒病毒 即與即與mRNAmRNA極性相同（極性相同（5353），反之為），反之為( (一一) )；(2)5(2)5有有m m7 7GpppGppp帽，帽，33有有polypoly（A A）尾；）尾；(3)(3)病毒進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)本身逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈病毒進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)本身逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNAcDNA分子分子細(xì)胞核并整細(xì)胞核并整合到宿主染色體合到宿主染色體, ,這種整合病毒這種

15、整合病毒DNADNA稱為稱為前病毒前病毒(provirus)(provirus)( (不管是不管是源于源于RNARNA還是還是DNA)(DNA)(并非所有逆轉(zhuǎn)錄病毒都致癌并非所有逆轉(zhuǎn)錄病毒都致癌) )。（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)（二）逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu).24 圖圖11-3 11-3 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的基本結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的基本結(jié)構(gòu) 2 2基因組結(jié)構(gòu)基因組結(jié)構(gòu).25 ( (三三) ) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn) 保留病毒的保留病毒的LTR ,LTR ,去除病毒的結(jié)構(gòu)基因去除病毒的結(jié)構(gòu)基因, ,加加上一個(gè)抗性標(biāo)記基因上一個(gè)抗性標(biāo)記基因 LTRLTRLTRLTRN

16、eoNeoAmpAmpr roriEoriE.26 ( (四四) ) 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)保留病毒的保留病毒的LTR ,LTR ,用目的基因和抗性標(biāo)記基用目的基因和抗性標(biāo)記基因置換了病毒的結(jié)構(gòu)基因因置換了病毒的結(jié)構(gòu)基因 LTRLTRLTRLTRNeoNeoAmpAmpr roriEoriETarget geneTarget gene.27 常用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖常用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖 .28 （五）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備（五）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備 是將缺失了包裝信號(hào)及相關(guān)序列的缺陷型逆是將缺失了包裝信號(hào)及相關(guān)序列的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（輔助病毒）導(dǎo)入哺乳細(xì)胞內(nèi)

17、而制備成轉(zhuǎn)錄病毒（輔助病毒）導(dǎo)入哺乳細(xì)胞內(nèi)而制備成的一種特殊的細(xì)胞系，這種細(xì)胞因攜帶有逆轉(zhuǎn)錄的一種特殊的細(xì)胞系，這種細(xì)胞因攜帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組而大量產(chǎn)生病毒包裝蛋白，而輔助病病毒基因組而大量產(chǎn)生病毒包裝蛋白，而輔助病毒自身缺乏包裝信號(hào)（毒自身缺乏包裝信號(hào)（序列）而不能包裝序列）而不能包裝, ,不不產(chǎn)生病毒顆粒。產(chǎn)生病毒顆粒。1 1包裝細(xì)胞包裝細(xì)胞 (1)(1)包裝細(xì)胞定義包裝細(xì)胞定義.29 為了獲得感染能力為了獲得感染能力, , 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不含病毒的結(jié)構(gòu)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不含病毒的結(jié)構(gòu)基因, ,不能產(chǎn)生不能產(chǎn)生gaggag、polpol、envenv 野生型野生型MO-MLVMO-MLV

18、可供這些蛋白質(zhì)，為什么不用野生型可供這些蛋白質(zhì)，為什么不用野生型M MO O-MLV-MLV？ 包裝后會(huì)產(chǎn)生大量有復(fù)制能力的野生型病毒顆粒，進(jìn)入包裝后會(huì)產(chǎn)生大量有復(fù)制能力的野生型病毒顆粒，進(jìn)入體內(nèi)可能大量復(fù)制，具有插入突變危險(xiǎn)，特別是插入激活癌基因，體內(nèi)可能大量復(fù)制，具有插入突變危險(xiǎn)，特別是插入激活癌基因，滅活抑癌基因危險(xiǎn)，不利于治療用。滅活抑癌基因危險(xiǎn)，不利于治療用。 所以要設(shè)計(jì)一種細(xì)胞所以要設(shè)計(jì)一種細(xì)胞重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能在其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能在其中包裝成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒（確切的說(shuō)，只有一次感染能力），中包裝成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒（確切的說(shuō)，只有一次感染能力），但能從中釋放出來(lái)到靶細(xì)

19、胞，這就是包裝細(xì)胞，不產(chǎn)生復(fù)制能力但能從中釋放出來(lái)到靶細(xì)胞，這就是包裝細(xì)胞，不產(chǎn)生復(fù)制能力的野生型包裝結(jié)構(gòu)。的野生型包裝結(jié)構(gòu)。 (2)(2)為什么要包裝細(xì)胞？為什么要包裝細(xì)胞？.30 (3) (3) 三代包裝細(xì)胞三代包裝細(xì)胞第一代包裝細(xì)胞第一代包裝細(xì)胞22細(xì)胞系細(xì)胞系: :這種細(xì)胞的基因組中整合有僅僅缺失包裝信這種細(xì)胞的基因組中整合有僅僅缺失包裝信號(hào)的號(hào)的MLVMLV前病毒基因組。只要與載體（含）之間有一次前病毒基因組。只要與載體（含）之間有一次重組，就可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒。重組，就可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒。 第第2 2代包裝細(xì)胞代包裝細(xì)胞 PA317PA317細(xì)胞系細(xì)胞系:

20、:含逆轉(zhuǎn)錄病毒含逆轉(zhuǎn)錄病毒PAM3PAM3基因組，缺失基因組，缺失信號(hào)及部信號(hào)及部分分5 5 LTRLTR，3 3 LTRLTR被被SV40SV40的多聚的多聚A A化信號(hào)取代化信號(hào)取代, ,與載體至少要與載體至少要經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)2 2次獨(dú)立的重組才能形成有復(fù)制能力的野生型病毒次獨(dú)立的重組才能形成有復(fù)制能力的野生型病毒 第第3 3代包裝細(xì)胞代包裝細(xì)胞 CRIP: CRIP: 含含2 2種逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組種逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組, ,每種不僅缺失每種不僅缺失信信號(hào)號(hào) , ,且僅含病毒的部分結(jié)構(gòu)基因且僅含病毒的部分結(jié)構(gòu)基因, ,經(jīng)過(guò)多次獨(dú)立重組，經(jīng)過(guò)多次獨(dú)立重組，才能產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒才能產(chǎn)生有復(fù)制能

21、力的野生型病毒 .312 2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備 - - LTRLTRLTRLTRNeoNeoLTRLTRLTRLTRNeoNeoTarget geneTarget geneLTRLTRLTRLTRgaggag polpol envenv形成假病毒形成假病毒, ,出芽釋放到細(xì)胞外出芽釋放到細(xì)胞外逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組逆轉(zhuǎn)錄重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞, ,整合后轉(zhuǎn)錄成整合后轉(zhuǎn)錄成RNARNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNARNA被病毒蛋白包裝被病毒蛋白包裝包裝細(xì)胞已整合包裝細(xì)胞已整合有缺失有缺失的逆轉(zhuǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因錄病毒基因, ,

22、可產(chǎn)可產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白白.32 （六）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（六）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)1 1逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的靶組織細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的靶組織細(xì)胞 靶細(xì)胞的最基本要求靶細(xì)胞的最基本要求: : 細(xì)胞表面具有逆轉(zhuǎn)錄病毒相應(yīng)的受體細(xì)胞表面具有逆轉(zhuǎn)錄病毒相應(yīng)的受體 最常用作基因治療的靶有：最常用作基因治療的靶有： 骨髓干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞，還包肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞，還包括所有的腫瘤細(xì)胞括所有的腫瘤細(xì)胞 .33 2 2基因轉(zhuǎn)移的方法與途徑基因轉(zhuǎn)移的方法與途徑 ex vivo分離培養(yǎng)宿主

23、細(xì)胞分離培養(yǎng)宿主細(xì)胞, ,離體轉(zhuǎn)移基因離體轉(zhuǎn)移基因, ,效率高，效率高，但大多人體組織細(xì)胞原代培養(yǎng)比較困難。但大多人體組織細(xì)胞原代培養(yǎng)比較困難。 in vivo重組逆轉(zhuǎn)病毒載體直接注射的途徑主要有：重組逆轉(zhuǎn)病毒載體直接注射的途徑主要有：采用靜脈注射途徑采用靜脈注射途徑直接將產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)直接將產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞注射到組織或腫瘤中胞注射到組織或腫瘤中直接將表達(dá)載體，直接將表達(dá)載體，.34 3 3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向基因轉(zhuǎn)移重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向基因轉(zhuǎn)移 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒整合位點(diǎn)的靶向性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒整合位點(diǎn)的靶向性 大多數(shù)前病毒的整合作用是隨機(jī)的，對(duì)大多數(shù)前病毒

24、的整合作用是隨機(jī)的，對(duì)DNase IDNase I超敏區(qū)超敏區(qū)域和轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域的整合是具有優(yōu)先整合的傾向性。在腫域和轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域的整合是具有優(yōu)先整合的傾向性。在腫瘤中前病毒優(yōu)先與細(xì)胞原癌基因和染色體脆性位點(diǎn)整合。瘤中前病毒優(yōu)先與細(xì)胞原癌基因和染色體脆性位點(diǎn)整合。 通過(guò)基因轉(zhuǎn)移的方法與途徑限制受感染細(xì)胞通過(guò)基因轉(zhuǎn)移的方法與途徑限制受感染細(xì)胞 ex vivo:ex vivo:被感染的靶細(xì)胞被預(yù)先選擇，細(xì)胞靶向性能夠被感染的靶細(xì)胞被預(yù)先選擇，細(xì)胞靶向性能夠很好地實(shí)現(xiàn)很好地實(shí)現(xiàn) in vivo:in vivo:將重組病毒注射到特定的組織器官或其腔體內(nèi)，將重組病毒注射到特定的組織器官或其腔體內(nèi)，以達(dá)到較

25、好的組織細(xì)胞選擇性基因轉(zhuǎn)移的目的，如進(jìn)行腫以達(dá)到較好的組織細(xì)胞選擇性基因轉(zhuǎn)移的目的，如進(jìn)行腫瘤實(shí)體內(nèi)注射，使重組病毒主要感染腫瘤細(xì)胞。瘤實(shí)體內(nèi)注射，使重組病毒主要感染腫瘤細(xì)胞。.35 病毒感染水平的限制病毒感染水平的限制 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)人類細(xì)胞的某些亞群具有限制性的利用逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)人類細(xì)胞的某些亞群具有限制性的親嗜性。親嗜性。如如HIVHIV和和HTLV-1 HTLV-1 基因轉(zhuǎn)錄水平的限制基因轉(zhuǎn)錄水平的限制 在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中導(dǎo)入具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的序列在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中導(dǎo)入具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的序列利用利用-甲胎蛋白基因的肝組織特定性調(diào)節(jié)成分與甲胎蛋白基因的肝組織特定性調(diào)節(jié)成分與TKT

26、K基基因相連因相連.365LTRNeoAmproriE3LTR插入外源cDNA5LTRNeoAmproriE3LTRcDNASLTRSLTR轉(zhuǎn)錄g pemRNAmRNA病毒蛋白質(zhì)包裝完成假病毒顆包裝，分泌到包裝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。逆轉(zhuǎn)錄感染靶細(xì)胞前病毒前病毒插入外源基因轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)G418篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的基本過(guò)程轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出RNA.37 （七）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的安全性問(wèn)題（七）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的安全性問(wèn)題1 1產(chǎn)生野生型病毒產(chǎn)生野生型病毒 存在有復(fù)制能力的野生型病毒，主要來(lái)源于載體存在有復(fù)制能力的野生型病毒，主要來(lái)源于載體和和不含不含序列的輔助

27、病毒重組成野生型病毒序列的輔助病毒重組成野生型病毒 2 2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入的破壞性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入的破壞性 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的基因在受體細(xì)胞染色體上的基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的基因在受體細(xì)胞染色體上的基因組合是隨機(jī)的。與臨近基因相互作用組合是隨機(jī)的。與臨近基因相互作用, ,可能激活癌基因，可能激活癌基因，滅活抑癌基因或破壞細(xì)胞生長(zhǎng)的必需基因。滅活抑癌基因或破壞細(xì)胞生長(zhǎng)的必需基因。 3 3污染問(wèn)題污染問(wèn)題 .38 由于病毒的感染性和寄生特性，由于病毒的感染性和寄生特性，使現(xiàn)在約使現(xiàn)在約85%85%基因治療臨基因治療臨床項(xiàng)目采用病毒載體。但是病毒載體存在免疫原性高、毒性床項(xiàng)目采用病毒載體。但是

28、病毒載體存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小，靶向特異性差，制備復(fù)雜及費(fèi)用較高大、目的基因容量小，靶向特異性差，制備復(fù)雜及費(fèi)用較高等不足。所以人們愈來(lái)愈重視非病毒法的研究。等不足。所以人們愈來(lái)愈重視非病毒法的研究。 非病毒載體的本質(zhì)是將基因治療中基因看作為藥物，非病毒載體的本質(zhì)是將基因治療中基因看作為藥物，然后從藥劑和藥理學(xué)的角度如何把基因?qū)氚屑?xì)胞或組織、然后從藥劑和藥理學(xué)的角度如何把基因?qū)氚屑?xì)胞或組織、器官并進(jìn)行表達(dá)。器官并進(jìn)行表達(dá)?；蜃鳛樗幬锇l(fā)揮治療作用的關(guān)鍵問(wèn)題是基因作為藥物發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵問(wèn)題是導(dǎo)入的靶向性，表達(dá)的有效性和可調(diào)控性。導(dǎo)入的靶向性，表達(dá)的有效性和可調(diào)控性。二二.

29、 .非病毒載體非病毒載體 轉(zhuǎn)基因的非生物學(xué)方法轉(zhuǎn)基因的非生物學(xué)方法.39非病毒載體優(yōu)缺點(diǎn)非病毒載體優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) 缺缺 點(diǎn)點(diǎn)1.不需包裝細(xì)胞，不需包裝細(xì)胞，制備易、省時(shí)、制備易、省時(shí)、滴度也不受限制，并且可對(duì)質(zhì)粒滴度也不受限制，并且可對(duì)質(zhì)?；蚱渌问胶怂徇M(jìn)行快速分析；或其他形式核酸進(jìn)行快速分析；2.對(duì)基因大小或核酸類型不限；對(duì)基因大小或核酸類型不限；3.免疫原性低，急性毒性小，對(duì)免疫原性低，急性毒性小，對(duì)受試者比較安全；受試者比較安全；4.可具有特異靶向性，可具有特異靶向性，并能轉(zhuǎn)移并能轉(zhuǎn)移至非分裂期細(xì)胞并有效表達(dá)；至非分裂期細(xì)胞并有效表達(dá)；5.制備方便且重復(fù)性好，制備方便且重復(fù)性好，具有完

30、具有完全人工合成和大規(guī)模生產(chǎn)可行性，全人工合成和大規(guī)模生產(chǎn)可行性，因此較簡(jiǎn)單和廉價(jià)。因此較簡(jiǎn)單和廉價(jià)。1.轉(zhuǎn)移效率較病毒載體低。轉(zhuǎn)移效率較病毒載體低。2.基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間短；基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間短；3.許多問(wèn)題仍需求助病毒或病毒許多問(wèn)題仍需求助病毒或病毒成分解決。成分解決。.401.1.方法方法 用一定比例的磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸用一定比例的磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸共溶于氯仿共溶于氯仿制備成雙層磷脂的封閉囊泡制備成雙層磷脂的封閉囊泡超聲波處理超聲波處理將待轉(zhuǎn)移外源基因?qū)⒋D(zhuǎn)移外源基因DNADNA包入包入制備成脂質(zhì)體制備成脂質(zhì)體/ /質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA復(fù)合物復(fù)合物利用其能與細(xì)胞膜融合的特性，可將

31、質(zhì)粒利用其能與細(xì)胞膜融合的特性，可將質(zhì)粒DNADNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。 2.2.優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 脂質(zhì)體作為載體可以攜帶各種脂質(zhì)體作為載體可以攜帶各種DNADNA片段，且片段，且在轉(zhuǎn)移途中保護(hù)基因不被核酸酶降解。在轉(zhuǎn)移途中保護(hù)基因不被核酸酶降解。 3.3.缺點(diǎn)缺點(diǎn) 轉(zhuǎn)移效率低、制備麻煩、商品較貴。轉(zhuǎn)移效率低、制備麻煩、商品較貴。 （一）脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移方法（一）脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移方法.41 1陽(yáng)離子脂質(zhì)體陽(yáng)離子脂質(zhì)體 由帶正電荷的脂類如四胺基去污劑、膽固醇陽(yáng)離子由帶正電荷的脂類如四胺基去污劑、膽固醇陽(yáng)離子衍生物、二?；视秃投喟返闹愌苌锖椭行暂o衍生物、二?；视秃投喟返闹愌苌锖椭行暂o助脂類

32、如二油?；字Ｒ掖及罚ㄖ惾缍王；字Ｒ掖及罚―OPEDOPE）或二油酰）或二油?；字Ｄ憠A（基磷脂酰膽堿（DOPCDOPC） 等摩爾混合組成。等摩爾混合組成。 通過(guò)電荷的相互作用，陽(yáng)性電荷的脂質(zhì)體和帶通過(guò)電荷的相互作用，陽(yáng)性電荷的脂質(zhì)體和帶陰電荷的陰電荷的DNADNA之間可以有效地形成復(fù)合物。由于具之間可以有效地形成復(fù)合物。由于具有多余的正電荷，復(fù)合體可以與細(xì)胞膜帶負(fù)電荷的有多余的正電荷，復(fù)合體可以與細(xì)胞膜帶負(fù)電荷的唾液酸結(jié)合，然后通過(guò)內(nèi)吞作用攝取載體復(fù)合體。唾液酸結(jié)合，然后通過(guò)內(nèi)吞作用攝取載體復(fù)合體。.42 2 2陰離子（陰離子（anionicanionic）脂質(zhì)體）脂質(zhì)體 含有

33、磷脂酰絲氨酸或含含有磷脂酰絲氨酸或含50%50%二棕櫚磷脂酰甘油二棕櫚磷脂酰甘油, ,由于由于磷脂和寡聚核苷酸均帶負(fù)電荷，磷脂和寡聚核苷酸均帶負(fù)電荷，必須在脂質(zhì)體中加必須在脂質(zhì)體中加入鈣離子入鈣離子方可提高包裝效率。由陰離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)方可提高包裝效率。由陰離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)的寡聚核苷酸首先定位細(xì)胞核，也延長(zhǎng)了寡聚核苷的寡聚核苷酸首先定位細(xì)胞核，也延長(zhǎng)了寡聚核苷酸在細(xì)胞內(nèi)的保留時(shí)間。酸在細(xì)胞內(nèi)的保留時(shí)間。 陰離子脂類可以置換陽(yáng)離子脂質(zhì)陰離子脂類可以置換陽(yáng)離子脂質(zhì)/DNA/DNA復(fù)合體的復(fù)合體的DNADNA .43 3 3pHpH敏感型脂質(zhì)體敏感型脂質(zhì)體 可由二油酰膽堿（可由二油酰膽堿（DOPEDOP

34、E）、膽固醇和油酸以）、膽固醇和油酸以4 4：4 4：2 2（摩爾比）組成（摩爾比）組成 DOPEDOPE決定了脂質(zhì)體在中性決定了脂質(zhì)體在中性pHpH條件下的穩(wěn)定性和酸條件下的穩(wěn)定性和酸性條件下與細(xì)胞融合的能力性條件下與細(xì)胞融合的能力 酸性條件下可導(dǎo)致其脂肪酸羧基的質(zhì)子化而引起酸性條件下可導(dǎo)致其脂肪酸羧基的質(zhì)子化而引起六角晶相的形成導(dǎo)致膜融合的發(fā)生六角晶相的形成導(dǎo)致膜融合的發(fā)生 .44 （二）受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（二）受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 1.1.方法方法 利用細(xì)胞表面各種特定受體的配基為利用細(xì)胞表面各種特定受體的配基為“導(dǎo)彈頭導(dǎo)彈頭”與多價(jià)陽(yáng)離子聚合物（或能與其它能強(qiáng)烈吸附與多價(jià)陽(yáng)離子聚

35、合物（或能與其它能強(qiáng)烈吸附DNADNA物質(zhì)相物質(zhì)相連接），構(gòu)成導(dǎo)向性運(yùn)輸載體，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用，將目連接），構(gòu)成導(dǎo)向性運(yùn)輸載體，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用，將目的基因靶向性地移至某種特定細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的方法。的基因靶向性地移至某種特定細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的方法。2.2.特點(diǎn)：特點(diǎn)：受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用具有：受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用具有： 1 1） 細(xì)胞組織器官特異性；細(xì)胞組織器官特異性； 2 2） 轉(zhuǎn)移效率高。轉(zhuǎn)移效率高。3.3.舉例：舉例：此法研究較多的是唾液酸糖蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白。此法研究較多的是唾液酸糖蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白。 如：利用唾液酸糖蛋白（配體）攜帶表達(dá)載體已如：利用唾液酸糖蛋白（配體）攜帶表達(dá)載體已成功地將目的基因

36、轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞內(nèi)，獲得目的基因表達(dá)。成功地將目的基因轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞內(nèi)，獲得目的基因表達(dá)。.45 （三）注射法（三）注射法1 1直接注射直接注射 將裸露將裸露DNADNA直接注入肌肉內(nèi)，外源基因在肌肉中的表達(dá)直接注入肌肉內(nèi)，外源基因在肌肉中的表達(dá)量與注入的外源性基因含量成正比，與溶液體積無(wú)關(guān)。量與注入的外源性基因含量成正比，與溶液體積無(wú)關(guān)。 2 2顯微注射法顯微注射法 采用特別的顯微注射器在顯微鏡下把重組采用特別的顯微注射器在顯微鏡下把重組DNADNA導(dǎo)入靶細(xì)胞導(dǎo)入靶細(xì)胞 顯微注射法顯微注射法: :在顯微鏡下將注射器針頭穿過(guò)細(xì)胞膜后刺入在顯微鏡下將注射器針頭穿過(guò)細(xì)胞膜后刺入細(xì)胞核，將重組細(xì)胞核，將重

37、組DNADNA直接注入受體細(xì)胞核中直接注入受體細(xì)胞核中 穿刺法穿刺法: :在顯微鏡下用顯微注射針穿刺細(xì)胞膜及核膜，在顯微鏡下用顯微注射針穿刺細(xì)胞膜及核膜，將重組將重組DNADNA加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，使細(xì)胞周圍的重組加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，使細(xì)胞周圍的重組DNADNA有有機(jī)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞中機(jī)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞中 .46 （四）電泳沖介導(dǎo)法（電穿孔法）（四）電泳沖介導(dǎo)法（電穿孔法） 是對(duì)受體細(xì)胞加入高壓電脈沖，使細(xì)胞上形是對(duì)受體細(xì)胞加入高壓電脈沖，使細(xì)胞上形成許多瞬間小孔，從而使不同細(xì)胞之間的原生質(zhì)成許多瞬間小孔，從而使不同細(xì)胞之間的原生質(zhì)發(fā)生融合，或使外源發(fā)生融合，或使外源DNADNA通過(guò)細(xì)胞膜上出現(xiàn)瞬間通過(guò)細(xì)胞膜

38、上出現(xiàn)瞬間小孔而進(jìn)入細(xì)胞。小孔而進(jìn)入細(xì)胞。 （五）超聲介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法（五）超聲介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法（六）微粒轟擊法（六）微粒轟擊法( (七七) )磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣共沉淀法.47 三、非病毒載體的優(yōu)化策略三、非病毒載體的優(yōu)化策略 （一）靶向性問(wèn)題（一）靶向性問(wèn)題 利用細(xì)胞表面特異性表達(dá)的受體或蛋白來(lái)解利用細(xì)胞表面特異性表達(dá)的受體或蛋白來(lái)解決靶向性（決靶向性（targetingtargeting）問(wèn)題）問(wèn)題 例如例如: :唾液酸糖蛋白（唾液酸糖蛋白（asialo-glycoproteinasialo-glycoprotein，ASGPASGP）能與肝細(xì)胞上去唾液酸糖蛋白受體特異）能與肝細(xì)胞上去唾液酸

39、糖蛋白受體特異性結(jié)合并介導(dǎo)內(nèi)吞的特點(diǎn)，將性結(jié)合并介導(dǎo)內(nèi)吞的特點(diǎn)，將ASGPASGP與攜帶與攜帶DNADNA的的多聚陽(yáng)離子多肽共價(jià)結(jié)合，證明多聚陽(yáng)離子多肽共價(jià)結(jié)合，證明DNADNA主要進(jìn)入肝主要進(jìn)入肝細(xì)胞并能高效表達(dá)細(xì)胞并能高效表達(dá) 靶向性配體主要有單克隆抗體、病毒胞膜蛋靶向性配體主要有單克隆抗體、病毒胞膜蛋白、生長(zhǎng)因子或激素等白、生長(zhǎng)因子或激素等 配體和配體和DNADNA連接的物質(zhì)主要有多聚賴氨酸、精連接的物質(zhì)主要有多聚賴氨酸、精蛋白和陽(yáng)離子脂質(zhì)體，蛋白和陽(yáng)離子脂質(zhì)體，DNADNA嵌合劑、嵌合劑、DNADNA抗體等抗體等 .48 （二）內(nèi)吞小泡釋放（二）內(nèi)吞小泡釋放（endosome rele

40、asingendosome releasing）問(wèn)題）問(wèn)題促進(jìn)促進(jìn)DNADNA從內(nèi)吞小泡釋放策略：從內(nèi)吞小泡釋放策略： 利用抑制溶酶體的藥物、融合型脂類、利用抑制溶酶體的藥物、融合型脂類、pHpH敏感脂質(zhì)體敏感脂質(zhì)體或有側(cè)鏈的多聚陽(yáng)離子和星狀樹突體等來(lái)破壞內(nèi)吞小泡或有側(cè)鏈的多聚陽(yáng)離子和星狀樹突體等來(lái)破壞內(nèi)吞小泡膜以釋放其中的膜以釋放其中的DNADNA； 通過(guò)耦聯(lián)技術(shù)，利用病毒或病毒蛋白、細(xì)菌蛋白、通過(guò)耦聯(lián)技術(shù)，利用病毒或病毒蛋白、細(xì)菌蛋白、短肽等。短肽等。 .49 （三）轉(zhuǎn)運(yùn)入核問(wèn)題（三）轉(zhuǎn)運(yùn)入核問(wèn)題 SV40 SV40的大的大T T抗原的抗原的PKKKRKVPKKKRKV序列、序列、VP1V

41、P1、肽核酸和、肽核酸和聚乙烯亞胺（聚乙烯亞胺（PEIPEI）可以促進(jìn)）可以促進(jìn)DNADNA的核轉(zhuǎn)運(yùn)。的核轉(zhuǎn)運(yùn)。 （四）基因及其表達(dá)調(diào)控問(wèn)題（四）基因及其表達(dá)調(diào)控問(wèn)題 通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止序列及密通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止序列及密碼子的使用來(lái)提高載體質(zhì)粒上靶基因的表達(dá)和安全性。碼子的使用來(lái)提高載體質(zhì)粒上靶基因的表達(dá)和安全性。入核問(wèn)題也可屬于此范疇。入核問(wèn)題也可屬于此范疇。.50 第第 四四 節(jié)節(jié)反義反義RNARNA、核酶和三鏈、核酶和三鏈DNADNA在 基 因 治 療 中 的 應(yīng) 用在 基 因 治 療 中 的 應(yīng) 用 .51 核酸包括核酸包括DNADNA和和RNARN

42、A，都是遺傳物質(zhì)，所以反，都是遺傳物質(zhì)，所以反義核酸可稱作反義基因，即義核酸可稱作反義基因，即能通過(guò)互補(bǔ)堿基與能通過(guò)互補(bǔ)堿基與DNADNA或或mRNAmRNA互補(bǔ)的核酸分子。互補(bǔ)的核酸分子。 反義反義RNARNA技術(shù)、核酶技術(shù)、三鏈技術(shù)、核酶技術(shù)、三鏈DNADNA技術(shù)，技術(shù)，廣義地說(shuō)，這廣義地說(shuō)，這3 3者可以統(tǒng)稱為反義核酸技術(shù)者可以統(tǒng)稱為反義核酸技術(shù)，3 3者之間有一定聯(lián)系，也有一定的區(qū)別。者之間有一定聯(lián)系，也有一定的區(qū)別。一一. .反義核酸的概念反義核酸的概念.521.1.反義反義RNARNA（antisense RNAantisense RNA）: :與與mRNAmRNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的RN

43、A RNA 。結(jié)合。結(jié)合時(shí)，可阻止時(shí)，可阻止mRNAmRNA翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。2.2.核酶（核酶（ribozymeribozyme）：具有催化功能的：具有催化功能的RNARNA稱為核酶。其與稱為核酶。其與相應(yīng)相應(yīng)mRNAmRNA結(jié)合后能發(fā)揮酶活性，將結(jié)合后能發(fā)揮酶活性，將mRNAmRNA降解。降解。3.3.三鏈三鏈DNA(DNA(反義基因反義基因) )：是人工合成的寡核苷酸：是人工合成的寡核苷酸（oligodexynucleotide,olgoDToligodexynucleotide,olgoDT），其進(jìn)入機(jī)體，以胞吞），其進(jìn)入機(jī)體，以胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞，可直接結(jié)合到方式進(jìn)入細(xì)胞，

44、可直接結(jié)合到DNADNA雙鏈的特定部位，形成三雙鏈的特定部位，形成三聚體，影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄過(guò)程不能啟動(dòng)。聚體，影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄過(guò)程不能啟動(dòng)。二二. .反義核酸用于基因治療的基本原理反義核酸用于基因治療的基本原理.531 1）抗腫瘤：）抗腫瘤：就是應(yīng)用反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平就是應(yīng)用反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些異?；虻谋磉_(dá)，以期阻斷瘤細(xì)胞內(nèi)異阻斷某些異常基因的表達(dá)，以期阻斷瘤細(xì)胞內(nèi)異常信號(hào)的傳導(dǎo)，使瘤細(xì)胞進(jìn)入正常分化軌道或引常信號(hào)的傳導(dǎo)，使瘤細(xì)胞進(jìn)入正常分化軌道或引起細(xì)胞凋亡。起細(xì)胞凋亡。2 2）抗病毒：）抗病毒：用反義用反義DNADNA或反義或反義RNARNA阻斷阻斷DN

45、ADNA復(fù)制，復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而達(dá)到抗病毒目的。轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而達(dá)到抗病毒目的。反義核酸在基因治療中的應(yīng)用反義核酸在基因治療中的應(yīng)用.54反義反義RNARNA的應(yīng)用方法有兩種的應(yīng)用方法有兩種 1 1） 體外合成反義體外合成反義RNARNA直接作用細(xì)胞，細(xì)胞吸收后直接作用細(xì)胞，細(xì)胞吸收后發(fā)揮作用；發(fā)揮作用； 2 2） 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNARNA發(fā)揮發(fā)揮作用。作用。 三三. .反義核酸技術(shù)反義核酸技術(shù)（一）反義（一）反義RNARNA技術(shù)技術(shù)意義意義: :抑制一些有害基因的表達(dá)或失控基因的過(guò)度表達(dá)抑制一些有害基因的表達(dá)或失控基因的過(guò)度表達(dá) .

46、55 解決的首要問(wèn)題解決的首要問(wèn)題 : :1 1專一性轉(zhuǎn)移問(wèn)題專一性轉(zhuǎn)移問(wèn)題 進(jìn)行基因治療時(shí)，反義進(jìn)行基因治療時(shí)，反義RNARNA必須專一性轉(zhuǎn)移到病變細(xì)胞中必須專一性轉(zhuǎn)移到病變細(xì)胞中 2 2反義反義RNARNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問(wèn)題進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問(wèn)題 反義反義RNARNA抗抗RNaseRNase的能力不強(qiáng)的能力不強(qiáng) 受體介導(dǎo)的反義受體介導(dǎo)的反義RNARNA轉(zhuǎn)移技術(shù)是解決上述兩個(gè)問(wèn)題的一條十轉(zhuǎn)移技術(shù)是解決上述兩個(gè)問(wèn)題的一條十分有希望的途徑。分有希望的途徑。.56 受體介導(dǎo)反義受體介導(dǎo)反義RNARNA轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)移技術(shù)針對(duì)上述針對(duì)上述2 2個(gè)問(wèn)題人們?cè)O(shè)計(jì)一種反義個(gè)問(wèn)題人們?cè)O(shè)計(jì)一種反義RNARNA

47、運(yùn)載工具，如：運(yùn)載工具，如： ASGP-PLASGP-PL（脫唾液酸血清類粘蛋白一多聚賴氨酸（脫唾液酸血清類粘蛋白一多聚賴氨酸) )，能將反義能將反義RNARNA運(yùn)至肝細(xì)胞發(fā)揮作用；運(yùn)至肝細(xì)胞發(fā)揮作用； 利用受體介導(dǎo)反義利用受體介導(dǎo)反義RNARNA在抑制在抑制c-mycc-myc和乙肝病毒基和乙肝病毒基因的表達(dá)方面有所研究，基本上克服了上述弱點(diǎn)。因的表達(dá)方面有所研究，基本上克服了上述弱點(diǎn)。.571 1）安全性高：）安全性高：反義反義RNARNA只針對(duì)特異的只針對(duì)特異的mRNAmRNA分子，不改變所調(diào)節(jié)基分子，不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)，并且最終在細(xì)胞內(nèi)降解，不留因的結(jié)構(gòu)，并且最終在細(xì)胞內(nèi)降解，不留

48、“殘?jiān)鼩堅(jiān)薄? 2）設(shè)計(jì)制備方便：）設(shè)計(jì)制備方便：設(shè)計(jì)復(fù)蓋設(shè)計(jì)復(fù)蓋55端的反義端的反義RNARNA可以封帽反應(yīng)可以封帽反應(yīng)（mRNAmRNA不能進(jìn)入核糖體），即可抑制特定基因表達(dá)和功能。制備不能進(jìn)入核糖體），即可抑制特定基因表達(dá)和功能。制備也較簡(jiǎn)單：也較簡(jiǎn)單： 體外轉(zhuǎn)錄得到，體外轉(zhuǎn)錄得到，利用表達(dá)載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到利用表達(dá)載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到3 3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)；）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)；4 4）能直接作用某些）能直接作用某些RNARNA病毒；病毒；5 5）發(fā)展：）發(fā)展：設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)“抗降解抗降解”RNARNA，可以延長(zhǎng)反義，可以延長(zhǎng)反義RNARNA壽命；設(shè)計(jì)壽命；設(shè)計(jì)“反義反義RNA+RNA+核酶

49、核酶”復(fù)合功能體、既有復(fù)合功能體、既有 “封閉封閉”又有又有“切割切割”作作用。用。3.3.應(yīng)用前景：應(yīng)用前景：.581.1.核酶設(shè)計(jì)應(yīng)考慮的因素核酶設(shè)計(jì)應(yīng)考慮的因素 核酶由核酶由“兩端引導(dǎo)序列兩端引導(dǎo)序列+ +中間保守序列中間保守序列”組成，組成， 引導(dǎo)序列取決于靶序列的堿基組成引導(dǎo)序列取決于靶序列的堿基組成, , 中間保守序列：是酶活性的結(jié)構(gòu)域中間保守序列：是酶活性的結(jié)構(gòu)域, ,酶活性中心酶活性中心包括結(jié)合部位和催化中心，包括結(jié)合部位和催化中心， （二）核酶（二）核酶（ribozymeribozyme）技術(shù)）技術(shù) 核酶兩端的引導(dǎo)序列與靶核酶兩端的引導(dǎo)序列與靶RNARNA分子的序列互補(bǔ)，分子

50、的序列互補(bǔ)，起著識(shí)別和結(jié)合底物的作用。起著識(shí)別和結(jié)合底物的作用。 設(shè)計(jì)的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形設(shè)計(jì)的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域成酶活性結(jié)構(gòu)域 .59人工設(shè)計(jì)的核酶人工設(shè)計(jì)的核酶粗線表示合成的核酸分子粗線表示合成的核酸分子細(xì)線表示天然的核酸分子細(xì)線表示天然的核酸分子X(jué) 表示一致性序列表示一致性序列箭頭表示切斷點(diǎn)箭頭表示切斷點(diǎn).60 化學(xué)合成：提供序列順序，由廠家合成、很方便。化學(xué)合成：提供序列順序，由廠家合成、很方便。 體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄: a : a 據(jù)靶序列先合成據(jù)靶序列先合成DNADNA雙鏈；雙鏈； b b 將將dsDNAdsDNA克隆到表達(dá)載體上；克隆

51、到表達(dá)載體上； c c 利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄獲得核酶。利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄獲得核酶。2.2.核酶制備：核酶制備：.61外源導(dǎo)入：借助脂質(zhì)體包裹導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。外源導(dǎo)入：借助脂質(zhì)體包裹導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)源導(dǎo)入：借助逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。內(nèi)源導(dǎo)入：借助逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。 導(dǎo)入細(xì)胞的同時(shí)，分別導(dǎo)入報(bào)告基因與反義表達(dá)導(dǎo)入細(xì)胞的同時(shí)，分別導(dǎo)入報(bào)告基因與反義表達(dá)載體（帶報(bào)告基因）作對(duì)照，用以檢測(cè)載體的表達(dá)能載體（帶報(bào)告基因）作對(duì)照，用以檢測(cè)載體的表達(dá)能力，以區(qū)別抑制作用是核酶還是反義力，以區(qū)別抑制作用是核酶還是反義RNA。3.3.核酶導(dǎo)入細(xì)胞的兩種方法核酶導(dǎo)入細(xì)胞的兩種方法.621.1.意義意義: :（三）反義基

52、因（三）反義基因( (三鏈三鏈DNA)DNA)技術(shù)技術(shù)通過(guò)形成三鏈通過(guò)形成三鏈DNA,DNA,完全抑制特定基因的表達(dá)完全抑制特定基因的表達(dá) 。三鏈。三鏈DNADNA被稱為被稱為“能夠攻擊病毒和癌細(xì)胞而不損害健康組能夠攻擊病毒和癌細(xì)胞而不損害健康組織織”的新型基因藥物。的新型基因藥物。 2.2.作用機(jī)制作用機(jī)制: : 合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脫氧寡核苷酸（合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脫氧寡核苷酸（ODNODN）在一定條件下也可以與雙螺旋在一定條件下也可以與雙螺旋DNADNA分子中的同聚嘌分子中的同聚嘌呤呤同聚嘧啶區(qū)段結(jié)合形成局部的分子間三鏈同聚嘧啶區(qū)段結(jié)合形成局部的分子間三鏈DNA,DNA,可可干擾

53、核蛋白因子或聚合酶與干擾核蛋白因子或聚合酶與DNADNA的這一位點(diǎn)結(jié)合，因此的這一位點(diǎn)結(jié)合，因此三鏈三鏈DNADNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表達(dá)。能夠在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表達(dá)。.63 3 3、技術(shù)關(guān)鍵、技術(shù)關(guān)鍵: :專一性：專一性：針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)高度選擇性的反義基因；針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)高度選擇性的反義基因；穩(wěn)定性：穩(wěn)定性：通過(guò)化學(xué)修飾，使反義基因能抵抗體內(nèi)核酸通過(guò)化學(xué)修飾，使反義基因能抵抗體內(nèi)核酸酶的進(jìn)攻，延長(zhǎng)反義基因的壽命。酶的進(jìn)攻，延長(zhǎng)反義基因的壽命。攝取及分布攝取及分布:直接通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)還直接通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)還通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用入胞通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用入胞 。 ODNO

54、DN的攝取過(guò)程是一個(gè)依賴的攝取過(guò)程是一個(gè)依賴于堿基序列長(zhǎng)度、活性及飽和的內(nèi)循環(huán)過(guò)程。于堿基序列長(zhǎng)度、活性及飽和的內(nèi)循環(huán)過(guò)程。.64 第第 五五 節(jié)節(jié)基因治療的應(yīng)用研究基因治療的應(yīng)用研究 .65 除外傷性疾病外，所有疾病都是遺傳因素（內(nèi)因）與除外傷性疾病外，所有疾病都是遺傳因素（內(nèi)因）與環(huán)境因素（外因）相互作用結(jié)果環(huán)境因素（外因）相互作用結(jié)果。遺傳因素起主要作用疾病如：遺傳因素起主要作用疾病如：血友病、白化病、苯酮尿血友病、白化病、苯酮尿 癥等；癥等；環(huán)境因素起主要作用疾病如：環(huán)境因素起主要作用疾病如：傳染病、營(yíng)養(yǎng)性疾病等；傳染病、營(yíng)養(yǎng)性疾病等；二者都起重要作用疾病如：二者都起重要作用疾病如：糖

55、尿病、高血壓、冠心病、糖尿病、高血壓、冠心病、腫瘤、精神分裂癥等。腫瘤、精神分裂癥等。 目前發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)位虿∧壳鞍l(fā)現(xiàn)：?jiǎn)位虿?0004000多種，多基因病不少于多種，多基因病不少于10001000種，染色體病種，染色體病100100多種，隨著傳染病與營(yíng)養(yǎng)性疾病的多種，隨著傳染病與營(yíng)養(yǎng)性疾病的有效控制和科技經(jīng)濟(jì)文化的進(jìn)一步發(fā)展，遺傳病患病率有有效控制和科技經(jīng)濟(jì)文化的進(jìn)一步發(fā)展，遺傳病患病率有相對(duì)上升趨勢(shì)。相對(duì)上升趨勢(shì)。.66（一）（一）3 3個(gè)考慮因素和個(gè)考慮因素和3 3個(gè)困難：個(gè)困難：1. 31. 3個(gè)考慮因素：個(gè)考慮因素： 1 1）對(duì)該病有關(guān)基因應(yīng)詳盡了解，）對(duì)該病有關(guān)基因應(yīng)詳盡了解，能在實(shí)

56、驗(yàn)中克隆該能在實(shí)驗(yàn)中克隆該基因，并能導(dǎo)入真核細(xì)胞中表達(dá)；基因，并能導(dǎo)入真核細(xì)胞中表達(dá)； 2 2）只需產(chǎn)生較少量原來(lái)缺陷基因表達(dá)產(chǎn)物就能矯正）只需產(chǎn)生較少量原來(lái)缺陷基因表達(dá)產(chǎn)物就能矯正疾??；疾病； 3 3）即使導(dǎo)入基因過(guò)渡表達(dá)，對(duì)機(jī)體也無(wú)不良反應(yīng)。）即使導(dǎo)入基因過(guò)渡表達(dá)，對(duì)機(jī)體也無(wú)不良反應(yīng)。一一. .遺傳病的基因治療遺傳病的基因治療.672.32.3個(gè)困難：個(gè)困難：1 1）導(dǎo)入外源基因調(diào)控問(wèn)題）導(dǎo)入外源基因調(diào)控問(wèn)題 導(dǎo)入外源基因（治療基因）接受體內(nèi)調(diào)控系統(tǒng)的導(dǎo)入外源基因（治療基因）接受體內(nèi)調(diào)控系統(tǒng)的統(tǒng)一調(diào)控，這在目前難以做到，有待進(jìn)一步研究。統(tǒng)一調(diào)控，這在目前難以做到，有待進(jìn)一步研究。2 2）有

57、些遺傳病是某些特殊細(xì)胞損傷造成的，這些）有些遺傳病是某些特殊細(xì)胞損傷造成的，這些細(xì)胞不易取出供體外基因工程操作用細(xì)胞不易取出供體外基因工程操作用3 3）單基因遺傳病，缺陷只局限于某一個(gè)發(fā)病的基因，）單基因遺傳病，缺陷只局限于某一個(gè)發(fā)病的基因，但其造成臨床結(jié)果往往廣泛累及多個(gè)臟器但其造成臨床結(jié)果往往廣泛累及多個(gè)臟器目前只有幾種體細(xì)胞適用體外基因治療目前只有幾種體細(xì)胞適用體外基因治療.681.1.腺苷脫氨酶（腺苷脫氨酶（adenosine deaminse,ADAadenosine deaminse,ADA）催化反應(yīng)）催化反應(yīng) 腺嘌呤脫氧核苷腺嘌呤脫氧核苷 次黃嘌呤苷次黃嘌呤苷次黃嘌呤次黃嘌呤黃嘌

58、黃嘌呤呤尿酸尿酸( (醇式醇式)()(人和猿的終產(chǎn)物人和猿的終產(chǎn)物) )2.ADA2.ADA缺陷生化代謝障礙及其臨床癥狀缺陷生化代謝障礙及其臨床癥狀 ADAADA缺陷缺陷 腺嘌呤核苷酸代謝受阻腺嘌呤核苷酸代謝受阻dATPTdATPT淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞胞DNADNA鏈不斷崩解，同時(shí)激活鏈不斷崩解，同時(shí)激活DNADNA依賴的依賴的ADP-ADP-核糖聚合酶的活核糖聚合酶的活性性, ,降低降低NADNAD水平，使蛋白質(zhì)合成減少細(xì)胞死亡，同時(shí)也影響水平，使蛋白質(zhì)合成減少細(xì)胞死亡，同時(shí)也影響B(tài) B細(xì)胞功能。細(xì)胞功能。 ADAADA缺陷常伴有重癥聯(lián)合免疫缺陷（缺陷常伴有重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCIDSCID）癥狀

59、。）癥狀。ADA（二）腺苷脫氨酶（二）腺苷脫氨酶（ADAADA）缺陷遺傳病的基因治療）缺陷遺傳病的基因治療.69 1 1）單個(gè)核細(xì)胞的分離）單個(gè)核細(xì)胞的分離：使用淋巴細(xì)胞分層液分離：使用淋巴細(xì)胞分層液分離患兒血中單個(gè)核細(xì)胞；患兒血中單個(gè)核細(xì)胞； 2 2）單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)）單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)：以：以“OKT3OKT3抗體抗體+IL+IL2 2”刺激體刺激體外培養(yǎng)外培養(yǎng)T T細(xì)胞增殖，分化；細(xì)胞增殖，分化； 3 3）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染T T細(xì)胞細(xì)胞； 4 4）將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給患兒體內(nèi)。）將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給患兒體內(nèi)。 3.ADA3.ADA基因治療方案：基因治療方案

60、：ADAADA缺陷的基因治療始于缺陷的基因治療始于19901990年年9 9月月1414日，治療對(duì)象是日，治療對(duì)象是1 1個(gè)個(gè)4 4歲的美國(guó)女孩，方案是：歲的美國(guó)女孩，方案是：.70 ADA ADA缺陷基因治療獲得了成功，但每間隔缺陷基因治療獲得了成功，但每間隔3 35 5個(gè)月，個(gè)月，同樣的基因治療操作程序必須同樣重新進(jìn)行。治療麻同樣的基因治療操作程序必須同樣重新進(jìn)行。治療麻煩給病人也增加了痛苦，這是因?yàn)榱馨图?xì)胞壽命只有煩給病人也增加了痛苦，這是因?yàn)榱馨图?xì)胞壽命只有幾個(gè)月時(shí)間。幾個(gè)月時(shí)間。研究者正在考慮是否使用壽命較長(zhǎng)的靶研究者正在考慮是否使用壽命較長(zhǎng)的靶細(xì)胞，當(dāng)然以骨髓干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)和回輸為好