流式細胞儀檢測細胞周期操作步驟

1、流式細胞儀檢測細胞周期操作步驟取對數生長期的A549細胞，按1X106cells/mL以1mL接種于100mmg養(yǎng)皿內24h后，進行所需的處理（比如加藥，照射）特定時間后終止培養(yǎng)，進行下一步的實驗收集原培養(yǎng)液，洗后的PBSffi消化后的細胞，將三者混勻放入15ml離心管中1000rpm離心5min（短時低速離心）棄上清，用1.5ml預冷PBS1000rpm離心5min后去除PBSffi細胞懸液內的細胞碎片加入1.5ml預冷PBS,在渦旋狀態(tài)下加入3.5ml無水乙醇，混勻后，于4c固定30min,或-20C長期保存。1000r/min,離心5min將乙醇吸除，力口PBS青洗混勻1000r/min

2、,5min再離心一遍，將殘留在細胞上的乙醇除去吸除離心管內PBS力口入200ulPBS和2ul的RNAB(0.25mg/ml)(37C下孵育30min)加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室溫下避光染色30min將離心管內的細胞過濾（300um尼龍網膜）至含有PBS的EP管中（PI具有很強的粘附性，容易使細胞聚團），標記EP管提前一天網上預約開機（先開儀器后開軟件）流式細胞儀的結構一般分為5部分：流動室及液流驅動系統(tǒng)；激光光源及光束成形系統(tǒng)；光學系統(tǒng)；信號檢測、存貯、顯示、分析系統(tǒng)；細胞分選系統(tǒng)。檢測前先渦旋使細胞混勻懸浮呈單個細胞，然后插入流式細胞儀上流動室內充滿鞘液，細胞排成單列由噴嘴

3、中心噴出，形成細胞液柱液柱與激光束相交，細胞上的熒光染料被激發(fā)產生熒光（488nm激發(fā)光源）熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析（熒光染料和細胞DN粉子特異性結合，可以檢測出細胞周期各時相細胞比例）在用第三方軟件分析之前，將流式結果按如下所示導出rxportrri.o科”叱Sup/*hHPreviewMhILwClrl+Pds'lij$ooi*lQHGju精r&0結果分析Modfit軟件分析|MlfcfijrvaiirlIFlowjo軟件分析癡0中kIB,LIHLIW1圖片拷貝：直接Ctrl+CEiLvEAriInkKsOrn|HITIttH11Ili*t”；J201306

4、20a-tics丁丁2n20130620a-2.fcs1W»U2013062Da-3fCs43566I；2013062DM.tCST2441U2013062Ua-Efc&tM72U20130620a-6fcs34700II20i3062)a-7it531317U即1和惻a闋Its30454d2013Q6ZDa-9.Tcs31552；20130620a-w.res35351U2Q13062Da-11.ftS33093；2013062Da-12.fc&2769U2013062Da-I3.fc&34&BJU201306208-14ItsI1&31tE

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7、增殖群時，可將DNA含量分布組方圖分為三部分，即G0/1、S、G2IMG0/1和G2M細胞峰的DNA分布均為正態(tài)分布，S期可以認為是一個加寬的正態(tài)分布檢測結果刻錄光盤保存關機（先關軟件后關儀器，關機前需清洗）正常細胞DNA量：2n-4n凋亡細胞：核內DN幽裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丟失，胞內DN蛤量減少。PI染色后，熒光強度減小而形成一個DN蛤量小于2n的分布區(qū)（亞G1峰）。1、縱坐標CellNumber：即計數的有效細胞數；2、橫坐標DNAContent:即DN蛤量；3、G1、G2、S三期在圖中已經標示；4、右側數字含義：DipG1-53.84%at55.56，即G1期DN

8、A含量平均值為55.56;53.84%即G1期細胞數占總數的53.84%;DipG2-5.64%at107.72,即G2期DN蛤量平士勻值為107.72,5.64%PG2期細胞數占總數的5.64%;AnnexinV-EGFP/PI雙染法檢測細胞凋亡基本原理：磷脂酰絲氨酸（PS）能與連接素V（AnnexinV）發(fā)生特異結合；PI是核酸熒光染料，不能透過正常細胞膜，只能進入已經破損的細胞膜，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，熒光強度與PI結合量呈良好的線性關系。正常細胞：膜完整，PS不外翻一一PI-/AnnexinV-凋亡早期：膜完整，PS翻轉PI-/AnnexinV+凋亡晚期：PS外翻，膜通透，性

9、增加一一PI+/AnnexinV+壞死細胞：膜嚴重破損，PS不外翻PI+/AnnexinV+幾乎不存在膜結構PI+/AnnexinV-實驗步驟：取對數生長期的細胞，按1X106cells/mL以1mL接種于培養(yǎng)皿內24h后，進行所需的處理（比如加入藥物）特定時間后終止培養(yǎng)，進行下一步的實驗細胞用0.25%夷酶37c消化5min（胰酶消化時間不易過長，以防引起假陽性）加入PBS制成細胞懸液（移液槍吹打6-8次）倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)（單個分離懸浮）將細胞懸液移入15ml離心管中2000rpm離心5min,PBS吸除用PBS清洗細胞2次（2000rpm,離心5min收集細胞）用400ul1xBindingBuffer懸浮細胞（濃度大約為1x106cells/ml）在細胞懸液中加入5ulAnnexinV-EGFP,輕輕混勻后于2-8C避光條件下孵育15min加入10ulPI后輕輕混勻，于2-8C避光條件下孵育5min在1h內用流式細胞儀檢測流式細胞儀激發(fā)光波長采用Ex.=488nm雙波長激發(fā)，Em.=510nm檢測EGF限光(FL1channel)和575nm的發(fā)射波長檢測PI。細胞應可分成三個亞群：活細胞僅有很低的熒光強度，凋亡細胞有較強的綠色熒光，壞