微流控芯片PPT課件

1、微流控芯片微流控芯片實(shí)驗(yàn)室微流控芯片實(shí)驗(yàn)室 把各種把各種基本操作單元基本操作單元( (細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解, , 樣樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測品制備、反應(yīng)、分離、檢測等等) 集成到一塊幾平集成到一塊幾平方厘米的芯片上方厘米的芯片上; 由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng); 取代常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的各種功能。取代常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的各種功能。 微流控芯片實(shí)驗(yàn)室的基本特征和最大優(yōu)勢是多種微流控芯片實(shí)驗(yàn)室的基本特征和最大優(yōu)勢是多種單元技術(shù)在微小平臺(tái)上的靈活組合和規(guī)模集成。單元技術(shù)在微小平臺(tái)上的靈活組合和規(guī)模集成。微流控芯片實(shí)驗(yàn)室微流

2、控芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip) 又稱微全分析系統(tǒng)(micro total analytical system, TAS)或微流控芯片(microfluidic chips)，原型是20世紀(jì)90年代初開展的芯片毛細(xì)管電泳，是21世紀(jì)最為重要的前沿技術(shù)之一 采用微電子工業(yè)和半導(dǎo)體制造業(yè)中的一些精細(xì)加工工藝，在硅片、玻片和塑料等表面經(jīng)過必要的化學(xué)處理后，加工出微細(xì)（微米尺寸）結(jié)構(gòu)，制作成一塊幾平方厘米的芯片，化學(xué)或者生物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)過程可微縮到該芯片上進(jìn)行，用于生物樣品分離、反應(yīng)、分析，是一種新型的生物芯片。 樣品用量極微少，分析速度很快，得到的信息量可以比常規(guī)實(shí)驗(yàn)室多幾個(gè)數(shù)量級(jí)，它不僅可

3、用于分析，生化反應(yīng)，而且還可用于細(xì)胞培養(yǎng)，在臨床診斷，藥物篩選和生命科學(xué)的其他領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。微流控分析芯片實(shí)驗(yàn)室的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)微流控分析芯片實(shí)驗(yàn)室的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 芯片實(shí)驗(yàn)室由進(jìn)樣系統(tǒng)、樣品過濾和抽提機(jī)械、流體系統(tǒng)、閥系統(tǒng)、電泳等分離系統(tǒng)以及檢測系統(tǒng)等部分組成，大體可分為三個(gè)部分：不同功能的微流控芯片、芯片微流體運(yùn)行控制裝置及信號(hào)采集的控制與檢測裝置。提高分辨率提高分辨率-梯度洗脫技術(shù)梯度洗脫技術(shù)1.0% MCwithout EtBr0.3 % MCwith EtBrdetectionBufferSampleSample wasteAnalysisSeparation of x174-Hae Dig

4、est 1-3 1-3 min/ 12 samplesmin/ 12 samplesMulti-channel microchip electrophoresis1-3 1-3 minminMicrochip electrophoresisdetectionHigh voltagebuffersamplecapillary10-30 10-30 minminCapillary electrophoresisseparationbuffer1-31-3 Gel electrophoresis Connector made for PCR application, the complete PCR

5、 is done in the chip and connector: 微流控芯片與微陣列芯片有顯著的不同，它主要依托分析化學(xué)和生物學(xué)，芯片的構(gòu)造為微管道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過微管道中的流體控制來實(shí)現(xiàn)分離和分析的目的，一張芯片可重復(fù)使用數(shù)十至數(shù)千次；而微陣列芯片主要依托生物學(xué)，通過生物分子之間的雜交實(shí)現(xiàn)檢測的目的，一張芯片一般只使用一次。微流控芯片的制作微流控芯片的制作 加工技術(shù)起源于微電子工業(yè)微機(jī)電加工技術(shù)，即集成電路芯片制作的光刻和蝕刻技術(shù)，微管道寬度和深度為微米級(jí)，比集成電路芯片的大，但加工精度要求則相對(duì)較低。 基片材料應(yīng)具有良好的電絕緣性、散熱性、光學(xué)性能和可修飾性，可產(chǎn)生電滲流，能固載生物大

6、分子，對(duì)檢測信號(hào)干擾小或無干擾；與芯片實(shí)驗(yàn)室的工作介質(zhì)之間要有良好的化學(xué)和生物相容性，不發(fā)生反應(yīng)?；牧蠌墓杵l(fā)展到玻璃，石英，有機(jī)聚合物等。 微米尺寸結(jié)構(gòu)，要求在制備過程中必須對(duì)環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格認(rèn)真的控制，包括空氣濕度，空氣溫度，空氣及制備過程中所使用的各種介質(zhì)中的顆粒密度，要求在潔凈室中完成。微流控芯片的基本加工 光刻和蝕刻技術(shù)，用光膠、掩膜、和紫外光進(jìn)行微制造，由薄膜沉積，光刻和蝕刻三個(gè)工序組成。 光刻前首先要在基片表面覆蓋一層薄膜，薄膜的厚度為數(shù)埃到幾十微米，稱為薄膜沉積。然后在薄膜表面用甩膠機(jī)均勻地覆蓋上一層光膠，將掩膜上微流控芯片設(shè)計(jì)圖案通過曝光成像的原理轉(zhuǎn)移到光膠層的工藝過程稱為光

7、刻。 光刻的質(zhì)量則取決于光抗蝕劑（有正負(fù)之分）和光刻掩膜版的質(zhì)量。掩膜的基本功能是基片受到光束照射（如紫外光）時(shí)，在圖形區(qū)和非圖形區(qū)產(chǎn)生不同的光吸收和透過能力。微流控芯片制備 熱壓法： 將聚合物載體調(diào)至與模具相對(duì)應(yīng)的位置后，移入加熱裝置中，溫度升高是聚合物發(fā)生玻璃化，隨之在兩者之間施壓，降溫，撤壓，脫模操作，微通道結(jié)構(gòu)便呈現(xiàn)在載體上，接著進(jìn)行蓋片與載體的封接 蝕刻是在光刻過的基片上可通過濕刻（wet etching）和干刻（dry etching）等方法將阻擋層上的平面二維圖形加工成具有一定深度的立體結(jié)構(gòu)。選用適當(dāng)?shù)奈g刻劑，使它對(duì)光膠、薄膜和基片材料的腐蝕速度不同，可以在薄膜或基片上產(chǎn)生所需的

8、微結(jié)構(gòu)。 復(fù)雜的微結(jié)構(gòu)可通過多次重復(fù)薄膜沉積光刻蝕刻這三個(gè)工序來完成。 微流控基片通過預(yù)處理，涂膠，前烘，曝光，顯影及堅(jiān)膜，去膠等步驟后，材料上呈現(xiàn)所需要的圖形，即通道網(wǎng)絡(luò)。蓋板與微流控芯片基片的封接 基片和蓋板封接后形成封閉的小池，可用來儲(chǔ)存試劑或安裝電極。試劑必須要通過芯片上的小孔才能進(jìn)入通道網(wǎng)絡(luò)，所以通過微加工技術(shù)所制得的具有不同結(jié)構(gòu)和功能單元的微流控芯片基片，在與蓋板封接之前必須在微通道末端打一小孔，組裝成微流控成品才能使用。小孔可鉆在基片上，也可鉆在蓋板上。 玻璃芯片的打孔方法包括金剛石打孔法，超聲波打孔法，和激光打孔法。打孔后一定要將芯片制作和打孔過程中所殘留的小顆粒、有機(jī)物和金屬

9、物等清除干凈，包括化學(xué)清洗，提高芯片表面平整度，以保證封接過程順利進(jìn)行。微流體的控制與驅(qū)動(dòng)微流體的控制與驅(qū)動(dòng) 微流控芯片是通過微細(xì)加工技術(shù)將微管道，微泵，微閥，微儲(chǔ)液器，微電極，微檢測元件和連接器等功能元件像集成電路一樣，使它們集成在芯片材料（基片）上的微全分析系統(tǒng)。面積一般約為幾平方厘米。微流體的可控性是微流控芯片區(qū)別與點(diǎn)陣式芯片的最本質(zhì)特征，也是其被稱為“主動(dòng)式”芯片的原因。 微流體控制是微流控芯片實(shí)驗(yàn)室的操作核心，涉及的進(jìn)樣，混合，反應(yīng)，分離等過程無一不是在可控流體的運(yùn)動(dòng)中完成，閥則是流體控制的核心部分?；镜奈⒘骺丶夹g(shù)有驅(qū)動(dòng)（微泵）控制，微閥控制，芯片微通道構(gòu)型控制，通道表面性質(zhì)控制等

10、，微流體的控制與驅(qū)動(dòng)以電滲控制和微閥操作控制技術(shù)為主，微系統(tǒng)的層流效應(yīng)與分子擴(kuò)散效應(yīng)也起著十分重要的作用。 電滲控制是指在電場作用下，微通道中的液體沿通道內(nèi)壁作定向移動(dòng)的現(xiàn)象。影響電滲流的因素包括通道表面的組成，緩沖液性質(zhì)，外加電場強(qiáng)度，溫度等，通過對(duì)這些影響因素的調(diào)節(jié)，改變通道內(nèi)壁表面的電荷性質(zhì)和密度，調(diào)節(jié)微通道網(wǎng)絡(luò)中不同節(jié)點(diǎn)的電壓值，就可控制電滲流即微流體的遷移速度和運(yùn)行方向，完成較為復(fù)雜的混和，反應(yīng)和分離等操作。 Baker等報(bào)道利用聚合高分子電解質(zhì)涂層，進(jìn)行聚苯乙烯和丙烯酸為基質(zhì)的微芯片通道內(nèi)表面的涂層改性，從而控制微系統(tǒng)中液流的流動(dòng)方向，甚至可以在一個(gè)通道內(nèi)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)流向相反的液流的同

11、時(shí)操作。 凡是能控制微通道閉合和開啟狀態(tài)的部件，并具有低泄漏，低功耗，響應(yīng)快，線性操作等性能，均能作為微流控芯片中的微閥。 微反應(yīng)器是一種單元反應(yīng)界面為微米級(jí)的微型化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)，隨著微反應(yīng)器線性尺度的減小，對(duì)化學(xué)反應(yīng)非常重要的濃度，壓力，密度，溫度等梯度很快得到增加，從而使混合和反應(yīng)時(shí)間縮短到毫秒級(jí)以下。 生物樣品分析如DNA雜交，酶反應(yīng)，蛋白折疊等均涉及到樣品的快速均勻混合，反應(yīng)物的混合程度直接影響著反應(yīng)的速率和產(chǎn)物的得率；微通道中通道較短，體積較小，反應(yīng)時(shí)間很短，反應(yīng)相對(duì)難以完成，所以快速均勻混合顯得尤其重要，因此微混合器也就成為微流控集成設(shè)計(jì)的重要組成部分。進(jìn)樣及樣品前處理進(jìn)樣及樣品前處

12、理 微流控芯片分析系統(tǒng)的尺寸微小，內(nèi)部進(jìn)行的是體積在皮升至納升級(jí)的操作，與其聯(lián)系的外部分析對(duì)象或樣品儲(chǔ)存系統(tǒng)則通常是體積在微升、毫升以上。這種微觀系統(tǒng)和宏觀系統(tǒng)的銜接決定了微流控芯片系統(tǒng)樣品引入的特殊性。 液態(tài)樣品進(jìn)樣方式取決于其樣品源的內(nèi)置與外置。一般都采用樣品源內(nèi)置的方法，即芯片上有一個(gè)儲(chǔ)液池來容納樣品源，因其與微通道直接相連，進(jìn)樣時(shí)只需要對(duì)樣品施加壓力或電動(dòng)力即可，進(jìn)樣相對(duì)簡單；而外置的樣品源則需要導(dǎo)管，并要求導(dǎo)管與芯片接口嵌合極佳，一般較難實(shí)現(xiàn)。固態(tài)樣品需進(jìn)行流體化后才能進(jìn)樣。細(xì)胞樣品通常采用低壓驅(qū)動(dòng)以防止細(xì)胞破裂。信號(hào)采集的控制與檢測信號(hào)采集的控制與檢測 光學(xué)檢測法：激光誘導(dǎo)熒光，化

13、學(xué)發(fā)光和紫外吸收等光學(xué)檢測器至今仍是主流檢測手段。 激光誘導(dǎo)熒光是目前最靈敏的檢測方法之一。微流控的主要研究對(duì)象核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等可以通過熒光標(biāo)記進(jìn)行檢測，因此，激光誘導(dǎo)熒光監(jiān)測器是一種應(yīng)用最早，并且至今仍沿用的光學(xué)檢測器。 其他檢測方法還有電化學(xué)的檢測，質(zhì)譜檢測，光譜檢測以及一些基于生物反應(yīng)器的檢測。操作程序簡述操作程序簡述 不同功能的微流控芯片的制作 樣品處理 利用不同的方法如微過濾或雙向電泳分離細(xì)胞、DNA等樣品； 生物化學(xué)反應(yīng) 依照微流控芯片的功能類型，在控制溫度的微量反應(yīng)池中進(jìn)行PCR擴(kuò)增DNA、酶反應(yīng)或免疫反應(yīng)； 結(jié)果檢測 經(jīng)芯片雜交后，檢測激光激發(fā)的熒光信號(hào)或酶的顯色反應(yīng)。芯

14、片實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用和發(fā)展 核酸的擴(kuò)增，分離及測序仍是微流控芯片應(yīng)用的主要領(lǐng)域。最早的關(guān)于核酸的應(yīng)用是在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)DNA酶解和限制性片斷電泳，后來又發(fā)展了集成細(xì)胞或細(xì)菌裂解，PCR擴(kuò)增和電泳分離的微流控芯片檢測。在PCR技術(shù)上，PCR體系的反應(yīng)體積也從微升級(jí)降到納升級(jí)，極大地縮短了反應(yīng)時(shí)間； 1998年，美國Nanogen公司的Cheng等人在Nature的Biotechnology雜志上發(fā)表了關(guān)于芯片實(shí)驗(yàn)室的論文。他們通過芯片組合將樣品制備，生化反應(yīng)和結(jié)果檢測三個(gè)部分的工作依次完成，這是世界上第一個(gè)嚴(yán)格意義上的微型全分析系統(tǒng)操作。 通過該系統(tǒng)將大腸桿菌從人的血細(xì)胞和大腸桿菌混合液中分離出來，富

15、集后在芯片上進(jìn)行裂解細(xì)菌，釋放出核酸物質(zhì)，再進(jìn)行雜交檢測。 原始樣品進(jìn)入陣列后，微電極上施加特定頻率的交流電信號(hào)，所需的大腸桿菌細(xì)胞受到正向介電電泳力，被吸附在微電極周圍區(qū)域，而人的血細(xì)胞受到負(fù)向介電電泳力被推離微電極區(qū)域，即懸浮在溶液中。在流動(dòng)相的清洗作用下便可除去人的血細(xì)胞，留下所需的大腸桿菌細(xì)胞。然后，在微電極上施加高壓脈沖電信號(hào)，使得吸附在微電極周圍區(qū)域的大腸桿菌細(xì)胞破裂，釋放質(zhì)粒DNA，基因組DNA和RNA等核酸物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)從原始樣品到核酸的樣品制備過程。生化反應(yīng)和結(jié)果檢測也在微電極陣列上完成。單個(gè)微電極上可以固定不同的探針，通過微電極的選通或是關(guān)閉，以捕獲和檢測相對(duì)應(yīng)的核酸物質(zhì)。

16、 用于RNA病毒的檢測芯片：溫控單元和溫度傳感部件均置于反應(yīng)室中，由鉑金制成，不同的溫控分別完成逆轉(zhuǎn)錄和PCR；而控制單元?jiǎng)t由微閥和微泵組成，以控制流體運(yùn)輸。利用該裝置成功檢測了II型登革熱病毒和腸道病毒EV71。 RT-PCR芯片實(shí)驗(yàn)室示意圖。 摘自Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 18 e156 微流控芯片對(duì)單個(gè)細(xì)胞及胞內(nèi)的微量物質(zhì)的分析與檢測：在同一芯片上集成細(xì)胞培養(yǎng)、運(yùn)輸、清洗、破碎、樣品純化和電泳分離等操作單元。 構(gòu)建不同尺度且相對(duì)封閉的二維或三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，避免外界的污染。芯片材料多采用聚二甲基硅氧烷PDMS，具有良好的生物相容性，

17、對(duì)氣體也有一定的通透性，有利于細(xì)胞培養(yǎng)中氧氣和二氧化碳的交換。培養(yǎng)多采用灌流式，將細(xì)胞懸液注入微培養(yǎng)室，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液連續(xù)灌入培養(yǎng)室，即時(shí)更新營養(yǎng)物質(zhì)。利用微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要最大限度地降低流體剪切力對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響。 利用微流控芯片能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的分選，細(xì)胞裂解，從而對(duì)細(xì)胞分化增殖狀態(tài)，細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞膜功能，離子通道，細(xì)胞間相互作用等多方面進(jìn)行研究。研究藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞研究藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞膜功能的變化：利凋亡相關(guān)的細(xì)胞膜功能的變化：利用芯片通道內(nèi)的層流混合和分流，用芯片通道內(nèi)的層流混合和分流，結(jié)合芯片濃度梯度生成器，將藥物結(jié)合芯片濃度梯度生

18、成器，將藥物濃度生成、細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞刺激，濃度生成、細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞刺激，細(xì)胞標(biāo)記及細(xì)胞響應(yīng)的檢測過程集細(xì)胞標(biāo)記及細(xì)胞響應(yīng)的檢測過程集中到芯片上，對(duì)不同濃度的阿霉素中到芯片上，對(duì)不同濃度的阿霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡過程進(jìn)的凋亡過程進(jìn)行監(jiān)測。行監(jiān)測。首先將首先將HepG2細(xì)胞導(dǎo)入芯片上的培細(xì)胞導(dǎo)入芯片上的培養(yǎng)單元，細(xì)胞貼壁后，加入藥物溶養(yǎng)單元，細(xì)胞貼壁后，加入藥物溶液作用一定時(shí)間，再加入熒光標(biāo)記液作用一定時(shí)間，再加入熒光標(biāo)記試劑進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，然后加入沖洗試劑進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，然后加入沖洗液進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后洗滌，最后置于液進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記后洗滌，最后置于顯微鏡下檢測。顯微鏡下檢測。細(xì)胞凋亡檢測集成化微流控芯片示意圖。各試劑的入口和芯片結(jié)構(gòu)單元如圖所示。 摘自Electrophoresis 28:1146-1153,2007 微流控芯片在小分子領(lǐng)域的應(yīng)用尚處于起步階段，在毛細(xì)管電泳上分離小分子，小離子，和拆分手性分子的經(jīng)驗(yàn)正被迅速移植到芯片上，其中代謝產(chǎn)物的分析是研究的重點(diǎn)。復(fù)雜的代謝過程可在芯片上模擬，代謝產(chǎn)物可是模擬的終端出口。下游則是將復(fù)雜的代謝產(chǎn)物的在同一塊芯片上樣品進(jìn)行處理以及分離和檢測。芯片實(shí)驗(yàn)室可以應(yīng)用于疾病診斷、藥物合成與篩選、食品分析、環(huán)境監(jiān)測，毒品檢測等眾多領(lǐng)域。 組合