抗氧化活性研究方法

1、整理課件抗氧化活性研究方法以酶標法清除以酶標法清除DPPHDPPH自由基為主自由基為主目錄v一一. .檢測抗氧化活性的原因檢測抗氧化活性的原因v 二二. .自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性v三三. .檢測方法檢測方法v四四.DPPH.DPPH法（原理，一般方法，酶標法）法（原理，一般方法，酶標法）v五五.ABTS.ABTS法法 v六六.TBARS.TBARS法法v七七. .鐵離子還原能力鐵離子還原能力(FRAP)(FRAP)一.檢測抗氧化活性的原因 1.1.天然植物中許多化學物質(zhì)具有抗氧化活性天然植物中許多化學物質(zhì)具有抗氧化活性2.2.抗氧化劑有延緩衰老等功效，越來越受

2、到人們關(guān)注抗氧化劑有延緩衰老等功效，越來越受到人們關(guān)注3.3.據(jù)文獻記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性據(jù)文獻記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性4.4.抗氧化活性測試簡單，快捷，經(jīng)濟抗氧化活性測試簡單，快捷，經(jīng)濟 二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性抗氧化劑抗氧化劑自由基對人體造成的傷害自由基對人體造成的傷害天然植物天然植物三.檢測方法v 目前常用的抗氧化活性檢測方法主要基于以下機理：目前常用的抗氧化活性檢測方法主要基于以下機理：v (1)(1)在特定條件下，樣品對檢測體系中在特定條件下，樣品對檢測體系中脂類物質(zhì)的氧化抑脂類物質(zhì)的氧化抑制能力制能力反映被測物的抗氧化活性；反映被測物的抗氧化活性；（T

3、BARSTBARS法）法）v (2)(2)在特定條件下，樣品對檢測體系中在特定條件下，樣品對檢測體系中自由基的清除能力自由基的清除能力反映被測物的抗氧化活性；反映被測物的抗氧化活性；（DPPHDPPH自由基的清除）自由基的清除）v (3)(3)在特定條件下，測定樣品的在特定條件下，測定樣品的還原能力還原能力反映被測物的抗反映被測物的抗氧化活性。氧化活性。（還原（還原FeFe3+3+） 四.DPPH法 1. 1.原理原理 DPPH(DPPH(二苯代苦味?；杂苫酱辔鄂；杂苫? ) 是一種以氮為中心的是一種以氮為中心的穩(wěn)穩(wěn)定定自由基自由基。 特點：特點：醇溶液呈紫色醇溶液呈紫色，波長為波長

4、為517nm517nm下具有最大吸收。下具有最大吸收。 具有單一電子，故能接受一個電子或氫離子，具有單一電子，故能接受一個電子或氫離子，有自由基有自由基清除劑存在時，清除劑存在時，DPPHDPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降在最大光吸收波長處的吸光值下降, ,吸光度水平的降低吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，從而以評價試驗樣品的抗氧化能表明抗氧化性的增加，從而以評價試驗樣品的抗氧化能力。力。此抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧此抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化性越強?；栽綇?。實驗步驟 2. 2.實驗步驟實驗步

5、驟 （1 1）酶標法檢測）酶標法檢測酶標儀酶標儀v 取取9696孔細胞培養(yǎng)板，各孔分別加入孔細胞培養(yǎng)板，各孔分別加入150150molLmolL- 1- 1的的DPPHDPPH溶液溶液180L180L, ,各濃度梯度各濃度梯度樣品樣品溶液溶液2 20 0LL, ,終濃度分別為終濃度分別為3 3. .9 9 5 50000molLmolL- 1- 1，反應總體積，反應總體積200L200L, ,以溶劑作對照。加以溶劑作對照。加樣后樣后，振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置。分別分別在在1010 120min120min時間范圍內(nèi)時間范圍內(nèi)于于517nm51

6、7nm處測定各孔吸光度值處測定各孔吸光度值。觀觀察察樣品樣品抗抗DPDPP PH H的時效量效變化過程，確定實驗的穩(wěn)定性和的時效量效變化過程，確定實驗的穩(wěn)定性和最佳實驗反應時間。最佳實驗反應時間。v 計算公式為計算公式為: :清除率清除率( ()=A)=A( (溶劑溶劑) )- A- A( (樣品樣品) )/A/A（溶劑溶劑）x x100100 VitEVitE清除清除DPPHDPPH自由基抗氧化量效曲線自由基抗氧化量效曲線1 10 0- -120m120mi in n內(nèi)內(nèi), ,隨著隨著作作用時間的延長用時間的延長VitEVitE抗抗DPPHDPPH作用作用增增強強，但在但在3 3. .9 9

7、- - 3131. .2molL2molL- 1- 1范范圍內(nèi)，各時間點的圍內(nèi)，各時間點的藥效變化不藥效變化不明明顯顯，6262. .5 5- -500molL500molL- -1 1濃度范圍，隨著濃濃度范圍，隨著濃度增加度增加，各時間點各時間點的藥物作用曲線逐的藥物作用曲線逐漸分離漸分離，并在，并在500500molLmolL- -1 1，各各時間點量效趨于平時間點量效趨于平穩(wěn)。從穩(wěn)。從圖圖中可以看中可以看出，在這些時間點出，在這些時間點中，中，30min30min的量效曲的量效曲線基本呈斜線上升。線基本呈斜線上升。30min30minVitEVitE清除清除DPPHDPPH自由基抗氧化量

8、效曲線自由基抗氧化量效曲線 反應時間反應時間t t為為30min30min的量效曲線的量效曲線（相關(guān)系數(shù)）（相關(guān)系數(shù)）實驗步驟 （2 2）一般方法）一般方法紫外分光光度計法紫外分光光度計法 將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL0.1mL樣品加入樣品加入3.5 3.5 mL DPPHmL DPPH甲醇溶液甲醇溶液(0.06 mmol/L)(0.06 mmol/L)，混合，混合30min30min后測定后測定515 515 nmnm處吸光度。每份樣品平行操作處吸光度。每份樣品平行操作3 3次。次。 計算公式為計算公式為: :清除率清除率( ()=A)=A( (

9、溶劑溶劑) )- A- A( (樣品樣品) )/A/A（溶劑溶劑）x x100100酶標法優(yōu)勢 3. 3.酶標法優(yōu)勢酶標法優(yōu)勢 抗氧化微孔板實驗方法的優(yōu)勢：抗氧化微孔板實驗方法的優(yōu)勢：耗材量少，試劑量以微耗材量少，試劑量以微升計；升計；試劑種類少，部分試劑配制可交互使用；試劑種類少，部分試劑配制可交互使用；方法方法簡便，耗時短；簡便，耗時短；可重復性強，可以廣泛應用于藥物篩選，可重復性強，可以廣泛應用于藥物篩選，特別是高通量藥物篩選研究。特別是高通量藥物篩選研究。五.ABTS法 1. 1.原理原理 以水溶性的以水溶性的ABTSABTS+ +自由基引發(fā)劑為顯色劑。自由基引發(fā)劑為顯色劑。 特點：特

10、點：ABTSABTS與過硫酸鉀反應生成穩(wěn)定的藍與過硫酸鉀反應生成穩(wěn)定的藍/ /綠色陽離子自綠色陽離子自由基由基ABTSABTS+ +，最大吸光波長為最大吸光波長為734nm734nm。 向向ABTSABTS+ +其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與則該物質(zhì)會與ABTS+ABTS+發(fā)生反應而使反應體系發(fā)生反應而使反應體系褪色褪色，然后在，然后在ABTSABTS+ +這種自由基的這種自由基的734nm734nm吸光波長下檢測吸光度的變化來吸光波長下檢測吸光度的變化來反映物質(zhì)的抗氧化能力。反映物質(zhì)的抗氧化能力。實驗步驟 2. 2.實

11、驗步驟實驗步驟v 將樣品用甲醇配制成一系列濃度將樣品用甲醇配制成一系列濃度, ,取取0 0. .15mL15mL樣品加入樣品加入2 2. .85mLABTS85mLABTS自由基工作液自由基工作液，混合，放置混合，放置10min10min后后, ,在在734nm734nm處測定吸光度處測定吸光度。每份樣品平行操作每份樣品平行操作3 3次次。v 計算公式為計算公式為：清除率清除率( ()=A)=A( (溶劑溶劑) )- A- A( (樣品樣品) ) /A /A（溶劑溶劑） 100100 v A A（溶劑）（溶劑）為為2 2. .85 mLABTS85 mLABTS溶液與溶液與0 0. .15mL

12、15mL甲醇混合后的吸度甲醇混合后的吸度，A A（樣品）（樣品）為為2 2. .85mLABTS85mLABTS溶液與溶液與0 0. .15mL15mL樣品混合后的吸光度。樣品混合后的吸光度。 ABTS法優(yōu)缺點 3. 3.優(yōu)缺點優(yōu)缺點 簡便，快速，簡便，快速，適合于大量樣品的檢測適合于大量樣品的檢測。 ABTSABTS在與氫原子供體的反應中在與氫原子供體的反應中選擇性差選擇性差是此法的一個不足，是此法的一個不足，它它可與任何羥基化的芳香族化合物反應可與任何羥基化的芳香族化合物反應，這與它們的實際，這與它們的實際抗氧化能力關(guān)，因此抗氧化能力關(guān)，因此,T,TEACEAC值也包括對抗氧化不起作用的值

13、也包括對抗氧化不起作用的羥基。羥基。六.TBARS法 簡介簡介 脂質(zhì)體系中氧化反應抑制或中止的判斷主要通過測量被氧脂質(zhì)體系中氧化反應抑制或中止的判斷主要通過測量被氧化物的濃度，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成?；锏臐舛?，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成。因此，反應物因此，反應物( (不飽和脂肪酸，自由基等不飽和脂肪酸，自由基等) )的消失，的消失，氧化產(chǎn)物的定量氧化產(chǎn)物的定量可能可能是判斷氧化階段的最合適方法。通過直接或者間接檢測氧是判斷氧化階段的最合適方法。通過直接或者間接檢測氧的消失和自由基的電子自旋光譜，適用于氧化過程的初始的消失和自由基的電子自旋光譜，適用于氧化過程的初始階段。通常采用階段。通常采用TBARSTBARS法來評價脂質(zhì)的過氧化法來評價脂質(zhì)的過氧化. .七.鐵離子還原能力(FRAP) 原理原理 FRAPFRAP的原理是基于氧化還原反應的比色法的原理是基于氧化還原反應的比色法。在酸性條件下，在酸性條件下，F(xiàn)eFe3+3+一一TPTATPTA(Fe(Fe3+3+三吡