細(xì)胞融合與單克隆抗體

1、融合細(xì)胞的特性和應(yīng)用融合細(xì)胞的特性和應(yīng)用n融合細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的遺傳信息，具有雙親融合細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的遺傳信息，具有雙親細(xì)胞的生物特性。細(xì)胞的生物特性。n新品種的培育新品種的培育、單克隆抗體制備單克隆抗體制備、研究細(xì)胞間、研究細(xì)胞間遺傳信息傳遞。遺傳信息傳遞。蔬菜水果雜交新品種蔬菜水果雜交新品種雜交水稻之父雜交水稻之父動(dòng)物雜交動(dòng)物雜交斑馬驢斑馬驢獅虎獸獅虎獸野牛和黃牛雜交野牛和黃牛雜交細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合的方法n病毒融合：病毒融合：副粘病毒最有效，副流感病毒、仙臺(tái)病毒等nPEG融合：融合：PEG導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層不穩(wěn)定，降低細(xì)胞膜極性，促進(jìn)細(xì)胞膜融合。n電融合法：電融合法：細(xì)胞膜出現(xiàn)微孔，通

2、透性升高，繼發(fā)細(xì)胞融合。神經(jīng)氨酸酶n細(xì)胞融合是雜交瘤抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。二、鼠源性單克隆抗體制備n歷史： Kohler and Milstein “Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”, Nature,1975. n骨髓瘤細(xì)胞 + 小鼠脾細(xì)胞（經(jīng)羊紅細(xì)胞免疫）nNobel Prize in 1984 持續(xù)分泌抗羊紅細(xì)胞抗體的雜交瘤細(xì)胞Ab的產(chǎn)生和單克隆抗體：的產(chǎn)生和單克隆抗體：n多克隆抗體n單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb）：針對(duì)一種抗原決定簇的抗

3、體。Burnet選擇學(xué)說(shuō)：n一個(gè)淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞）只接受一個(gè)抗原決定簇刺激，刺激后擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞克隆只產(chǎn)生均一的同質(zhì)抗體，即單克隆抗體。n體外要獲得某種抗原的體外要獲得某種抗原的單克隆抗體，需要有體單克隆抗體，需要有體外持續(xù)分泌抗體的單一外持續(xù)分泌抗體的單一B淋巴細(xì)胞克隆。淋巴細(xì)胞克隆。如何獲得體外持續(xù)分泌抗體的細(xì)胞如何獲得體外持續(xù)分泌抗體的細(xì)胞n細(xì)胞融合細(xì)胞融合和和融合細(xì)胞的篩選融合細(xì)胞的篩選是雜交瘤制備抗體的技術(shù)基礎(chǔ)。是雜交瘤制備抗體的技術(shù)基礎(chǔ)。能分泌抗體，不能長(zhǎng)期在體外培養(yǎng)能分泌抗體，不能長(zhǎng)期在體外培養(yǎng)survive雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的篩選HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基n細(xì)胞細(xì)胞DNA合成有

4、兩條途徑：合成有兩條途徑： 主要途徑：糖、氨基酸合成核苷酸，葉酸作為葉酸作為重要的輔酶參與。重要的輔酶參與。 另一另一輔助途徑輔助途徑是在是在H、T存在的情況下，經(jīng)次存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧）和胸腺嘧啶核苷激酶（啶核苷激酶（TK）的作用合成）的作用合成DNA。nHAT培養(yǎng)基： 次黃嘌呤次黃嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基蝶呤氨基蝶呤（aminopterin，A）:葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA。 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）融合后五種細(xì)胞的命運(yùn)：nB，瘤細(xì)胞（HGPRT缺陷），B-B，瘤

5、-瘤（HGPRT缺陷）， 瘤-BnB，B-B細(xì)胞細(xì)胞能分泌抗體，含有HGPRT，能在HAT培養(yǎng)基短期存活，但不能長(zhǎng)期體外存活。n瘤細(xì)胞，瘤瘤細(xì)胞，瘤-瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期存活，但不含有HGPRT，不能在HAT培養(yǎng)基存活，不能分泌抗體。n只有瘤瘤-B融合細(xì)胞融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，在HAT培養(yǎng)基存活，且能在體外長(zhǎng)期存活，能分泌抗體。雜交瘤技術(shù)制備McAb的原理n克隆選擇學(xué)說(shuō)n將抗原免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在體外進(jìn)行細(xì)胞融合n用HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞的原理以及各種細(xì)胞的命運(yùn)McAb制備主要流程制備主要流程克隆化克隆化抗體特異性篩選抗體特異性篩選擴(kuò)大培養(yǎng)制備大量擴(kuò)大培養(yǎng)制備大量M

6、cAb動(dòng)物免疫動(dòng)物免疫細(xì)胞融合細(xì)胞融合McAb制備主要步驟制備主要步驟n動(dòng)物免疫n細(xì)胞融合和篩選n抗體特異性篩選n克隆化n擴(kuò)大培養(yǎng)動(dòng)物免疫：獲得產(chǎn)生高效價(jià)特異性抗動(dòng)物免疫：獲得產(chǎn)生高效價(jià)特異性抗體的體的B細(xì)胞細(xì)胞n抗原：可溶性抗原（蛋白質(zhì)、核酸、多肽、多糖）、顆粒性抗原（細(xì)胞、細(xì)菌、真菌）。n可溶性抗原+佐劑n動(dòng)物： 6周齡的雌性Balb/c小鼠n免疫途徑：腹腔注射、靜脈注射、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。免疫途徑：腹腔注射、靜脈注射、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。 腹腔內(nèi)注射尤其適合于顆粒性抗原；對(duì)于可溶性抗原來(lái)講，初次免疫一般選用弗氏佐劑和抗原的混合乳化物進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫在首次免疫后1014天，一般

7、是靜脈或腹腔內(nèi)注射，融合前還要進(jìn)行抗原沖擊。脾內(nèi)免疫法可獲得更滿意的免疫效果，此法免疫周期短、抗原用量少 。n免疫劑量：免疫劑量：初次免疫1020g，可達(dá)50g，一般不超過(guò)200g。舉例：舉例：n動(dòng)物免疫：將純化的Cys C蛋白（0.5 mg/ml）從-86冰箱取出，冰上融解，抗原乳化采用三通管雙注射器互推法。n免疫方案：免疫方案： 0天首次免疫，天首次免疫，100 g Cys C/只（0.2 ml）+ 等體積弗氏完全佐劑，背部、大腿肌肉皮內(nèi)多點(diǎn)注射； 14天天，100 g Cys C /只（0.2 ml）+ 等體積弗氏不完全佐劑，大腿肌肉皮內(nèi)多點(diǎn)注射； 21天，天，100 g Cys C /

8、只（0.2 ml），于小鼠腹腔注射；第25天天眼眶取血，分離血清，用ELISA試測(cè)定效價(jià)； 28天，天，選擇效價(jià)達(dá)到要求（1：32000）的小鼠進(jìn)行尾靜脈注射50 g Cys C /只（0.05 ml），加強(qiáng)免疫。 細(xì)胞融合細(xì)胞融合主要細(xì)胞系和培養(yǎng)基主要細(xì)胞系和培養(yǎng)基n骨髓瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞：SP2/0，NS-1，均自Balb/c小鼠。 最好每隔36月將細(xì)胞置于含8-AG（8-雜氮鳥(niǎo)嘌呤）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一次，已去除HGPRT+的細(xì)胞。n培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：高糖DMEM，RPMI-1640n血清： 10%胎牛血清用于親代細(xì)胞培養(yǎng)，融合、篩選、克隆用20%胎牛血清； 不同商家、不同批次血清對(duì)細(xì)胞支持作

9、用明顯不同，應(yīng)篩選出能促進(jìn)克隆細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的優(yōu)質(zhì)血清，購(gòu)置足夠數(shù)量分裝保存。細(xì)胞融合細(xì)胞融合融合前的準(zhǔn)備（融合前的準(zhǔn)備（1）nPEG的配制的配制：PEG1000、1500、4000均可用于融合，濃度為40%50%。n50聚乙二醇（PEG，MW4000）配制： 稱取2 g PEG4000，放入青霉素小瓶?jī)?nèi)，蓋上橡皮塞，插上9號(hào)針頭排氣，沸水浴中30 min，使PEG融化并除菌；待其冷卻至5060時(shí)，加入37預(yù)溫的1640（1.7 ml）和DMSO（0.3 ml）混合液，充分混勻，封口膠封緊瓶塞，4C 保存，用前可置37C 加溫助溶。nNorwood提出，含15%（V/V）DMSO的50% PEG

10、4000，DMSO可增加膜的通透性，使細(xì)胞膜的滲透壓更易于與環(huán)境趨于平衡，從而提高融合頻率。細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（2）n制備飼養(yǎng)細(xì)胞（制備飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell）：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，能分泌生長(zhǎng)因子促使單個(gè)細(xì)胞容易生長(zhǎng)，還能清除死亡破碎細(xì)胞及微生物。n于細(xì)胞融合前一天，取SPF 級(jí)健康Balb/c 小鼠，處死，用75%酒精浸泡10 min，消毒小鼠體表。n將其移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，以仰臥位固定在解剖板上，用無(wú)菌注射器吸取10 ml1640液注射入腹腔，用酒精棉球輕揉腹部23 min；用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)腹部皮膚，暴露腹膜，吸出腹腔液，放入10 ml離心管，1 000 rpm，離心1

11、0 min，棄上清；n用5 ml HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)1105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 l，置于37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。n一般一只小鼠可獲得51068106個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞，用于3塊96孔板融合細(xì)胞培養(yǎng)。 細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（3）n骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備： 細(xì)胞融合前兩周復(fù)蘇小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，以終濃度為20 g/mL 8-AZ完全培養(yǎng)液培養(yǎng)兩周，篩選HGPRT缺陷型細(xì)胞。n融合前48 h將SP2/0 細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，于融合前用新鮮培養(yǎng)液換液一次，融合當(dāng)天收集細(xì)胞懸液，離心棄

12、上清，用1640液洗滌一次，重懸于培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。 細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（4）n免疫鼠脾細(xì)胞懸液的制備：免疫鼠脾細(xì)胞懸液的制備：n處死一只免疫好的Balb/C小鼠，小鼠用75%酒精浸泡10 min；n無(wú)菌操作取出脾臟，放入盛有10 ml不完全培養(yǎng)基的玻璃皿中，洗滌，小心剝?nèi)ブ車(chē)慕Y(jié)締組織和脂肪組織。然后換一新玻璃皿，加入1640液30 ml，將脾臟置于200目不銹鋼網(wǎng)中，用注射器的內(nèi)芯研磨，期間用不完全培養(yǎng)基沖洗數(shù)次，使脾細(xì)胞穿過(guò)網(wǎng)孔進(jìn)入溶液中；n將脾細(xì)胞移至10 ml玻璃離心管中，1 000 rpm，去上清，用不完全培養(yǎng)基10 ml洗滌細(xì)胞3次，離心收集脾細(xì)胞；將脾細(xì)胞

13、用10 ml不完全培養(yǎng)基重懸混勻，計(jì)數(shù)，置室溫待用。 細(xì)胞融合細(xì)胞融合n融合前將50% PEG置于37培養(yǎng)箱中預(yù)溫；n吸取SP2/0細(xì)胞懸液和脾細(xì)胞懸液至一個(gè)50ml離心管中，使脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 = 10 1，充分混勻，1 000 rpm離心10 min，棄上清；n吸取0.7 ml 50%PEG，離管底約2 cm處沿管壁加入PEG，1min左右加完，靜置90s；逐滴加入37預(yù)溫的不完全培養(yǎng)基1ml，再吸取不完全培養(yǎng)基10 ml，緩慢加入，最后加入20ml不完全培養(yǎng)基；n800 rpm，離心8 min，棄去上清，加入HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕吹打，混勻；將融合細(xì)胞接種至已鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)

14、胞培養(yǎng)板，每孔100 l；n每塊培養(yǎng)板留35孔接種SP2/0細(xì)胞，作為HAT選擇的陰性對(duì)照，置37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)制提高融合率的技術(shù)措施提高融合率的技術(shù)措施n飼養(yǎng)細(xì)胞的加入有助于促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。nPEG濃度要準(zhǔn)確：PEG在5060時(shí)仍為液體狀態(tài)，含DMSO的1640液要保溫50，兩種液體混合時(shí)一定要充分混勻；n當(dāng)脾細(xì)胞和瘤融合時(shí)，末次離心后應(yīng)盡量吸出上清，可避免對(duì)PEG的稀釋作用；n由于PEG能引起蛋白質(zhì)的沉淀，故脾細(xì)胞、瘤細(xì)胞需經(jīng)不含小牛血清的1640液的洗滌。nPEG作用瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合后，加入無(wú)血清1640液時(shí)要控制好速度，否

15、則當(dāng)滲入的液體太快，細(xì)胞可能脹破；融合后離心速度不要太高，一般為800 rpm，5 min。n細(xì)胞融合時(shí)，脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞的比例一般為510 1，每孔接種的細(xì)胞大約為11052105，接種過(guò)多，容易在單孔內(nèi)形成多個(gè)克隆集落，不利于克隆化操作。雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的篩選：nHAT培養(yǎng)基n融合后每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并于第5天每孔半量換液HAT培養(yǎng)基100 l。雜交瘤細(xì)胞融合情況觀察雜交瘤細(xì)胞融合情況觀察4d10d9d7d5d抗體特異性篩選：抗體特異性篩選：n融合后10天14天，細(xì)胞克隆長(zhǎng)至孔底的1/31/2時(shí)，即可采用間接ELISA法檢測(cè)各細(xì)胞培養(yǎng)孔上清液，篩選分泌目的抗體

16、的陽(yáng)性克隆。n挑出融合板陽(yáng)性孔細(xì)胞，加入8-10 ml HT培養(yǎng)基培養(yǎng)基，混勻鋪板4-6縱行，待亞克隆生長(zhǎng)5-7天，克隆長(zhǎng)大約1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以上/孔，再用 ELISA方法檢測(cè)。n再次篩選出陽(yáng)性克隆后，立即采用有限稀釋法將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)。 篩選分泌特異Ab的雜交瘤細(xì)胞新方法：nelectro-FACS-fusionn單獨(dú)篩選分泌某種抗體（如IgM型）的雜交瘤細(xì)胞n磁性顆粒篩選n免疫滲濾法克隆化：克隆化：n有限稀釋法：逐步稀釋使平均每孔只有一個(gè)細(xì)胞。有限稀釋法：逐步稀釋使平均每孔只有一個(gè)細(xì)胞。n收集陽(yáng)性克隆細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取用4.6 ml培養(yǎng)液懸浮230個(gè)雜交瘤細(xì)胞（此時(shí)平均0.1 ml

17、溶液中含5個(gè)細(xì)胞），接種于預(yù)先已加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，共接種3排，每孔0.1 ml；n余下1.0 ml，再加入4 ml培養(yǎng)液，共5ml（此時(shí)平均0.1 ml溶液中含1個(gè)細(xì)胞），再接種3排；n最后剩余1.4 ml，再補(bǔ)加培養(yǎng)液1.4ml（此時(shí)平均0.1ml溶液中含0.5個(gè)細(xì)胞），接種最后的24孔。n置37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天左右，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行ELISA檢測(cè)。n將分泌作用最強(qiáng)的陽(yáng)性克隆再次克隆化，直至細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)100%，轉(zhuǎn)移到24孔板、6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞凍存。 克隆化的注意事項(xiàng)：n克隆化應(yīng)及早進(jìn)行，以免無(wú)關(guān)克隆生長(zhǎng)抑制陽(yáng)性克隆的抗體分泌。n雜

18、交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，抗體分泌特性易丟失，多次克隆得到穩(wěn)定的細(xì)胞株。n定期進(jìn)行凍存后復(fù)蘇和克隆，監(jiān)測(cè)細(xì)胞株的抗體分泌特性。雜交瘤細(xì)胞及其單抗鑒定雜交瘤細(xì)胞及其單抗鑒定 n染色體分析：染色體分析： 小鼠B細(xì)胞40條，SP2/0 68條， 雜交瘤細(xì)胞為90-100條。單克隆抗體亞類(lèi)的鑒定單克隆抗體亞類(lèi)的鑒定 IgG1、IgG2a、 IgG2b、IgG3、IgM、IgAn包被酶標(biāo)板：用包被液將抗原稀釋為10g/ml，每孔加100l抗原液，共加12孔，于4過(guò)夜，洗滌3遍，拍干。n封閉：每孔加1%牛血清白蛋白液200 l，37孵育45 min，洗滌3遍，拍干。n每孔加入100 l新鮮的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫

19、靜置2 h，洗滌3次。n用抗體稀釋液以1 1000稀釋IgG1、IgG2a、 IgG2b、IgG3、IgM、IgA，每孔加入100 l稀釋的抗體，每種抗體作復(fù)孔，室溫靜置30 min，洗滌3次。n每孔加入100 l 1 1000稀釋的酶標(biāo)兔抗羊IgG抗體，室溫靜置15 min，洗滌3次。n每孔加入100 l底物顯色液，室溫避光反應(yīng)1015 min。n每孔加入100 l終止液，觀察結(jié)果，確定Ig亞類(lèi)。 Western blotting鑒定單克隆抗體與相鑒定單克隆抗體與相應(yīng)抗原的特異性反應(yīng)應(yīng)抗原的特異性反應(yīng) n取重組的Cys C蛋白行12% SDS-PAGE電泳。n電泳結(jié)束后，取下凝膠，置于轉(zhuǎn)印緩

20、沖液中平衡2060 min，22 V恒壓電轉(zhuǎn)移1h。n轉(zhuǎn)移后的PVDF膜在麗春紅S中染色5 min，再用蒸餾水脫去紅色。n將轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫封閉過(guò)夜。n棄去封閉液，用1TBST漂洗膜3次，每次1015 min。n加入以1 10稀釋的雜交瘤培養(yǎng)上清，37孵育4 h。n1TBST漂洗膜3次，每次1015 min。n加入已稀釋1 5000的HRP-羊抗小鼠IgG，37孵育2 h。n1TBST洗滌3次，每次1015 min.n加入DAB顯色液，輕搖至顯色，蒸餾水漂洗終止反應(yīng)，觀察分析結(jié)果。 單克隆抗體純度鑒定nSDS-PAGE電泳單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備體內(nèi)誘生體內(nèi)誘生腹水法腹水法 n采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備單克隆抗體：采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備單克隆抗體：n在接種雜交瘤細(xì)胞前12周，選取910周齡的雌性Balb/C小鼠，腹腔注射0.5 ml石蠟油。n將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞1000 rpm離心棄上清，用1640液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度2106/ml，小鼠腹腔注射0.5 ml。n接種雜交瘤細(xì)胞后12周，小鼠腹部明顯增大。用5ml注射器抽取腹水。n抽取的腹水經(jīng)3 000 rpm，離心15 min，收集上清，分裝保存86。n腹水抗體效價(jià)測(cè)定。 體內(nèi)誘生法的優(yōu)缺點(diǎn)體內(nèi)誘生法的