小鼠糖尿病模型建立的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、北方民族大學(xué)小鼠糖尿病模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案發(fā)育生物學(xué)課程設(shè)計(jì)姓名：徐飛學(xué)號：20103465生物技術(shù)102班小鼠糖尿病模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案徐飛（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物技術(shù)，20103465）【摘要】 糖尿病是一種常見的具有遺傳傾向的葡萄糖代謝和內(nèi)分泌障礙,是由于絕對性或相對性胰島素分泌不足引起的,近半個世紀(jì)來,糖尿病患病率和死亡率有明顯上升趨勢,在我國已成為繼心血管疾病、腫瘤之后列第三位的常見病、多發(fā)病和慢性非傳染性疾病?！娟P(guān)鍵詞】 糖尿病；動物模型；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)【Abstract】 Diabetes mellitus is a common genetic glucose metaboli

2、c and endocrinal disturbance caused by insulindeficiency absolutely or relatively. In the last half century, diabetes has the increasing rates of morbidity and mortality, and has become the third common, frequently occurring and chronic noninfectious disease after cardiovascular disease and cancer.【

3、key words】 Diabetes; Models, animal; Experimental design引言糖尿病(diabetesmellitus,DM)屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇,是以多飲、多食、多尿、身體消瘦,或尿濁、尿有甜味為特征的疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,糖尿病是一種由多種病因引起的慢性代謝性疾病,是由于體內(nèi)胰島素缺乏,或拮抗胰島素的激素增高,或胰島素在靶細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)揮正常生理作用而引起葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂的綜合征。為探清糖尿病病因,建立理想的DM動物模型是十分必要的,動物模型也可以篩選降糖藥物,可以為中醫(yī)藥治療糖尿病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。動物疾病模型主要用于實(shí)驗(yàn)生理學(xué)、實(shí)驗(yàn)病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)

4、治療學(xué)（包括新藥篩選）研究。人類疾病的發(fā)展十分復(fù)雜，以人本身作為實(shí)驗(yàn)對象來深入探討疾病發(fā)生機(jī)制，推動醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展來之緩慢，臨床積累的經(jīng)驗(yàn)不僅在時間和空間上都存在局限性，而且許多實(shí)驗(yàn)在道義上和方法上也受到限制。而借助于動物模型的間接研究，可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準(zhǔn)確地觀察模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并與人類疾病進(jìn)行比較研究，有助于更方便，更有效地認(rèn)識人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，研究防治措施。 糖尿病模型的建立方法很多,如手術(shù)法、藥物法、自發(fā)性DM、轉(zhuǎn)基因動物法等。國外多采用自發(fā)傾向的糖尿病近交系純種動物制作糖尿病模型,如BB(BioBreeding)鼠,DB(Dia-bete

5、s)鼠和NOD(Non-ObesityDiabetes)鼠。國內(nèi)多用傳統(tǒng)的藥物法誘導(dǎo)急性糖尿病模型,誘導(dǎo)的化學(xué)藥物主要為鏈脲佐菌素(Streptozotoein,STZ)和四氧嘧啶(AUoxan,ALX)1。鏈脈佐菌素用藥量小,建模方法簡便,藥物毒性小,但價格昂貴,限制了其使用;2四氧嘧啶比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,但建立的模型不穩(wěn)定,藥物毒性大,試驗(yàn)動物死亡率高,其劑量與給藥次數(shù)及給藥途徑可能對動物模型的誘導(dǎo)有一定影響3,另外動物體重、個體差異及外界環(huán)境條件對建模亦有較大影響。一·實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本試驗(yàn)通過比較四氧嘧啶與鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型的效果,探討了建模的影響因素,以便誘導(dǎo)出穩(wěn)定的、理想的

6、及價廉的糖尿病動物模型。二· 實(shí)驗(yàn)原理 目前,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為, STZ/四氧嘧啶加膳食誘導(dǎo)造成的模型相對較為可靠、穩(wěn)定,造模成本比遺傳性動物模型低廉,4四氧嘧啶(alloxan):四氧嘧啶產(chǎn)生超氧自由基而破壞B細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素合成減少,胰島素缺乏。其作用可能與干擾鋅的代謝有關(guān)。5不同種屬動物對四氧嘧啶的敏感性差異很大, 給藥劑量依動物及給藥途徑不同而異,大鼠 150-200 mg/kg( 腹腔注射) , 40-60 mg/kg( 靜脈注射) ; 小鼠 200 mg/kg( 腹腔注射) , 85-100 mg/kg( 靜脈注射) 。四氧嘧啶藥物價廉, 血糖反應(yīng)敏感, 模型穩(wěn)定, 可用于

7、人類 T1DM的有關(guān)研究, 使用時需知四氧嘧啶對動物肝腎有一定毒性作用。6 鏈脲佐菌素(STZ)是一種抗菌及抗腫瘤藥物,可以對某些種屬的動物(狗、兔、猴、大鼠、小鼠等)胰島B細(xì)胞選擇性破壞,而產(chǎn)生糖尿病。STZ導(dǎo)致糖尿病是由于B細(xì)胞通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)攝入后減少NAD+的細(xì)胞水平。從而導(dǎo)致B細(xì)胞壞死。外源性胰島素抑制GLUT2和B細(xì)胞內(nèi)胰島素的表達(dá),可以阻止STZ的致糖尿病效果7。其對內(nèi)臟毒性相對較小,成活率較高,是目前國內(nèi)外使用較多的一種制備糖尿病動物模型的方法。一般認(rèn)為,大劑量11(40-90 mg/kg)的STZ腹腔或靜脈可直接破壞胰島B細(xì)胞,多次小劑量12(15 mg/k

8、g)注射STZ可能是通過免疫機(jī)制使B細(xì)胞不斷破壞而致糖尿病,與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的B細(xì)胞不斷破壞有關(guān)9。STZ糖尿病與人型糖尿病有許多相似之處,且模型穩(wěn)定,因此,是研究型糖尿病較好模型。謝明智等8以小劑量STZ(2530 mg/kg)給雌性大鼠靜脈注射,造成胰島細(xì)胞輕度損傷產(chǎn)生糖耐量異常后加喂高熱量食物可引起動物肥胖而制得型糖尿病動物模型。三·材料與方法3.1供試動物及飼養(yǎng)條件雄性昆明小白鼠,試驗(yàn)用清潔級、60日齡、體重22-28g,購于醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動物中心。試驗(yàn)動物喂養(yǎng)于試驗(yàn)動物的標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房。飼喂自配的小鼠料,室內(nèi)通風(fēng)良好,相對濕度為40%-70%,室溫18-22,保持充足的光照。試

9、驗(yàn)前適應(yīng)性預(yù)飼養(yǎng)1周。3.2試劑與儀器四氧嘧啶,Sigma公司生產(chǎn),259/瓶;鏈脲佐菌素,Sigma公司生產(chǎn),500mg/瓶;日本京都I血糖儀,日本ARKRAYInc公司生產(chǎn);電子分析天平,美國METTLERTOLEDO公司生產(chǎn)。3.3藥物的配制3.3.1 ALX溶液的配制 試驗(yàn)組1:稱取ALX150mg,加人質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水(Physiologi-calSaltSolution,PSS)18mL充分溶解,過濾消毒;試驗(yàn)組2:分次稱取ALX90,60mg,各加人質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水18ml充分溶解,過濾消毒。3.3.2 sTZ溶液的配制鏈脲佐菌素120mg,加人0.1 mol/L

10、檸檬酸及檸檬酸鈉緩沖液18mL,在冰浴的條件下充分溶解,過濾消毒,調(diào)節(jié)酸堿度使pH值為4.2。ALX溶液及STZ溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配。3.4動物的分組白鼠購回后,置于18-20,明暗交替環(huán)境, 適應(yīng)性預(yù)飼養(yǎng)1周;建模前將小白鼠禁食(不禁水) 12h,稱量空腹體重、斷尾取血測定血糖濃度。選取血糖濃度為3.55.5 mmol/L的小白鼠140只,按照建模條件的不同,隨機(jī)分為4組:1組為ALX 1次給藥組;2組為ALX 2次給藥組;3組為STZ 1次給藥組;4組為對照組(表1)。3.5糖尿病動物模型的建立每組按照表1中的劑量腹腔注射(ip)給藥,1組、3組和4組分別1次性腹腔注射給藥ALX 200mg/

11、kg, STZ 80mg/kg和生理鹽水173mg/kg。2組ALX 2次給藥,第1次腹腔注射給藥120Mg/kg,間隔24h后再次腹腔注射給藥80mg/kg。由于藥物在成模前引起的動物低血糖時相,有可能對小白鼠造成應(yīng)激性損害,為了觀察小白鼠在低血糖時相,補(bǔ)充葡萄糖對小白鼠應(yīng)激性損害的緩解作用.在腹腔注射給藥后4-5h,分別給1,2,3組中50%的小白鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%葡萄糖灌胃,其余50%的小白鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水灌胃,劑量為0.5ml/只;4組用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水灌胃,劑量為0.5ML/只。3.6指標(biāo)及其檢測注射藥物72h后在小白鼠尾端斷尾取血,用血糖儀檢測小白鼠的禁食12h

12、的血糖濃度,當(dāng)血糖濃度11.1 mmol/L時判為建模成功,并稱量體重。3.7數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS 11.5軟件分析。四·結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果分析：不同給藥處理對建模小白最的影晌對小白鼠進(jìn)行不同給藥處理后可觀察到,與4組相比,多數(shù)小白鼠在2448h后出現(xiàn)多飲、多食、多尿,血糖濃度升高,皮毛松散,體重下降,且隨血糖濃度高低而波動部分小白鼠因高滲性脫水或低血糖昏迷而死亡,其中1組于給藥后第2、3天死亡6只;2組于給藥后第4天死亡3只;3組給藥后第4天死亡2只;4組均存活。小白鼠的血糖濃度及體重在給藥前后的變化見表2。由表2可以看

13、出,建模后小白鼠的血糖濃度均較建模前及對照組明顯升高,體重均較建模前及對照組降低。兩種藥物對糖尿病小白鼠的血糖濃度均有顯著影響(p<0.05);四氧嘧啶的誘導(dǎo)作用(血糖濃度為19.87和20.19mmol/L)明顯大于鏈脲佐菌素(血糖值為14.79mmol/L)(P<0.05)。四氧嘧啶建模組小白鼠的死亡率為15%(1組20%,2組10%)及體重下降率為18.1%(1組19.2%,2組17.0%),均高于鏈脲佐菌素建模組(死亡率3.3%,體重下降率12.0%)(p<0.05), 這說明四氧嘧啶對動物造成的損害較鏈脲佐菌素大。四氧嘧啶連續(xù)2次小劑量給藥的建模效果優(yōu)于1次性高劑量

14、給藥,2次給藥不僅提高了建模率而且降低了對動物的損害,動物死亡率亦明顯降低。五·討論四氧嘧啶(ALX)能選擇性地破壞胰島p細(xì)胞,使胰島素分泌功能喪失,造成內(nèi)分泌功能紊亂,使糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝失調(diào),從而使血糖升高。而代謝失調(diào)又進(jìn)一步會導(dǎo)致負(fù)氮平衡,使機(jī)體消瘦而體重下降,甚至引起動物死亡。在建模過程中,由于四氧嘧啶不可逆地破壞胰島細(xì)胞,作用迅速而強(qiáng)烈,建模的同時也致肝、腎組織中毒性損害,從而使建模動物死亡率較高9。鏈脲佐菌素(STZ)為一種廣譜抗菌素、具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用,對試驗(yàn)動物胰島p細(xì)胞具有高度選擇的毒性作用,但其作用較為緩和,其對組織的毒性相對較小,動物存

15、活率較高。鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病因給藥方式不同,其成模效果也有所差別。如采用小劑量分次給藥的方法,則建立了與人類I型糖尿病表現(xiàn)相似的動物模型;如采用較大劑量一次性注射給藥的方法,則建立了與人類I型糖尿病表現(xiàn)相似的速發(fā)性糖尿病模型,其原理可能與胰島的損傷程度有關(guān)13。本試驗(yàn)結(jié)果表明,四氧嘧啶(ALX)誘導(dǎo)糖尿病模型的建模率高于鏈脲佐菌素(STZ),四氧嘧啶組的小白鼠藥物注射12h后,血糖濃度即開始上升,但血糖濃度波動很大,進(jìn)而加快了糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝失調(diào),這就造成了建模小白鼠的體重快速下降和死亡率增加。而鏈脲佐菌素組的小白鼠血糖上升的比較慢,血糖濃度的波動也不是很大,對小白鼠的代謝影響

16、相對較小。故糖尿病癥狀和動物死亡率較四氧嘧啶低,這可能與胰島的損傷程度輕于前者有關(guān)。由本試驗(yàn)結(jié)果可知,四氧嘧啶(ALX)連續(xù)2次小劑量給藥,可能會比1次性大劑量給藥(200mg/kg)降低其對動物胰島日細(xì)胞的毒性損傷作用,從而減輕肝、腎組織中毒性損害,降低動物的死亡率,提高建模率。藥物致糖尿病模型動物血糖濃度的改變可劃分為3個不同時相: 早期高血糖相,開始血糖濃度升高持續(xù)約1-2h,此乃該藥抑制胰島素釋放所致; 低血糖相,持續(xù)約6-10h,可能是由于胰島p細(xì)胞被破壞,大量胰島素釋放,使血糖濃度顯著降低; 12h后出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖階段10。在本研究中,為了避免藥物在低血糖相引起動物低血糖應(yīng)激性死

17、亡,在注射藥物后4-5h,給小白鼠灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的葡萄糖,以緩解低血糖時相的應(yīng)激性損害,較好地控制了成模前(72h)的死亡率,而且提高了建模率。糖尿病模型的建立過程中外界環(huán)境因素的控制亦相當(dāng)重要。在本研究建模過程中,包括建模前的預(yù)飼養(yǎng)均必須保持每日10-12h的充足光照,溫度20-22，相對濕度40%-70%。同時建模前小白鼠體重的選擇也相當(dāng)重要,一般為22-289,不可過重或過輕。綜合以上結(jié)果可知,四氧嘧啶雖然毒性大,對建模動物的損害較大,但由于其建?？焖?建模的動物血糖濃度比較穩(wěn)定且維持時間長,有明顯的糖尿病癥狀,而且價格低廉,仍然是建立糖尿病動物模型的首選藥物。用四氧嘧啶建模時,在控

18、制外界環(huán)境條件下,連續(xù)2次小劑量給藥,并給與質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%葡萄糖,在降低死亡率的同時,可以提高建模率。鏈脲佐菌素雖然價格昂貴,但其具有用藥量小,建模方法簡便,藥物毒性小,建模動物死亡率低等優(yōu)點(diǎn)。特別是小劑量鏈脲佐菌素與高糖高脂飼料相結(jié)合,可以誘導(dǎo)出類似人類型糖尿病的動物模型,在評價治療糖尿病的藥物療效方面具有重要的醫(yī)學(xué)研究意義。參考文獻(xiàn)：1 孫子林二型糖尿病動物模型及其進(jìn)展仁J.實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理,1999,16(2):44一46.2 壬芳,朱大菊,孫明謹(jǐn),等.鏈脲菌素在糖尿病鼠模型中的應(yīng)用及其作用機(jī)理仁月.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004,23():15一17.3 王曉穎.段有金.四氧啼咤實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型的復(fù)制及其發(fā)病機(jī)制的探討J.中國醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2002(7):802-803.4 金 勇,朱 勇,吳南翔.實(shí)驗(yàn)性鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大、小鼠糖尿病動物模型研究進(jìn)展. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)研究所,杭州 3100135 李聰然,游雪甫,蔣建東. 糖尿病動物模型及研究進(jìn)展. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究所藥理室,北京 1000506 孫敬方. 動物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)M. 北京: 人