LAAT-1是溶酶體內(nèi)的賴氨酸精氨酸運(yùn)輸體

1、LAAT-1是溶酶體內(nèi)的賴氨酸/精氨酸運(yùn)輸體,以此保持體內(nèi)氨基酸的平衡摘要：從溶酶體運(yùn)出分解產(chǎn)物的缺陷導(dǎo)致人類溶酶體儲積病。發(fā)生于胱氨酸運(yùn)輸基因CTNS的突變導(dǎo)致胱氨酸病,但其他溶酶體氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在分子水平上很少有區(qū)別。在這里,我們找到了秀麗隱桿線蟲的賴氨酸/精氨酸運(yùn)輸?shù)鞍譒AAT-1。laat-1的損失造成賴氨酸和精氨酸在大量的有降解缺陷的溶酶體中的積累。在ctns-1的突變體(線蟲CTNS的同系物)中,LAAT-1可以減少溶酶體胱氨酸的水平,并且可以通過半胱胺抑制溶酶體變大，半胱胺是一種通過將胱氨酸轉(zhuǎn)化為賴氨酸類似物來緩解溶酶體病的藥物。LAAT-1也維持可供胚胎發(fā)育期利用的胞質(zhì)賴氨酸/

2、精氨酸水平。因此,LAAT-1是溶酶體內(nèi)的賴氨酸/精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,這暗示了半胱胺可以緩解溶酶體儲積病的分子解釋。從溶酶體運(yùn)出水解產(chǎn)物的功能缺陷引起溶酶體儲積病的發(fā)生，如胱氨酸病,其特點(diǎn)由于溶酶體胱氨酸運(yùn)輸體基因CTNS(cystinosin)的突變導(dǎo)致自由的胱氨酸在溶酶體內(nèi)的積累(1 - 4)。對胱氨酸病最有效的治療藥劑,半胱胺(一種氨基硫醇),它可以將溶酶體內(nèi)自由的胱氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸和混合的半胱氨酸-半胱胺的二硫化物,這被認(rèn)為是通過賴氨酸/陽離子氨基酸運(yùn)輸體將其從溶酶體以賴氨酸類似物的形式運(yùn)出的一種方式 (5 - 7)。這種運(yùn)輸體的分子類型仍然未知。盡管有生化檢測的方法,但大多數(shù)哺乳動物的溶

3、酶體氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體仍然沒有分子水平的表征(1)。通過對可持續(xù)增多的胚胎細(xì)胞尸體的秀麗隱桿線蟲突變體的一個正向遺傳篩查,我們隔離了一個隱性突變體qx42,其內(nèi)積累了許多具有折光性的尸體狀物質(zhì)和陽性溶酶體示蹤物斑點(diǎn),提示存在異常溶酶體(圖S1,A到G)。使用可以標(biāo)記溶酶體的NUC-1:mCherry (8、9)或溶酶體示蹤染色,我們發(fā)現(xiàn)qx42溶酶體的體積平均是野生型秀麗隱桿線蟲溶酶體體積(1.3*0.5 um³) 的兩倍(圖1,A到F,和圖S1,H 到K)。圖1.laat-1突變體積累了增大的溶酶體。(A到F) 在一個laat-1(qx42)胚胎(B)或除野生型(A)和(E)到(E)外的

4、細(xì)胞(F)到(F)中通過NUC-1:mCherry(A)和(B),箭頭) 或紅色溶酶體示蹤物(LTR)(E)到(F),箭頭的頭) 來顯示觀察增大的溶酶體。在(C)和(D)中溶酶體的體積被量化。不同種系中溶酶體的平均體積(±SEM,n = 100)如(D)所示。* * P < 0.0001。(G和H)在野生型動物皮下(G)或鞘(H)細(xì)胞的熒光圖像中顯示有LAAT-1: GFP和NUC-1: mCherry的表達(dá)。在(A),(B)和(G)到(H)中，插圖顯示的是黃色箭頭溶酶體放大4倍的圖像。比例尺: (E)和(F)中是2微米; 其他圖片中是5微米。我們接著檢查qx42突變體是否影響

5、溶酶體的產(chǎn)物降解。凋亡細(xì)胞首先被吞噬,然后在溶酶體內(nèi)降解。細(xì)胞死亡和細(xì)胞尸體吞食在qx42突變體中是正常的(圖S2)。然而, 通過HIS-24:GFP或H2B:GFP (分別標(biāo)記所有體細(xì)胞和胚芽核包括細(xì)胞尸體中的染色質(zhì))的缺失衡量在吞噬體(通過GFP:RAB-7或NUC-1:mCherry)中凋亡細(xì)胞的降解，其在qx42突變體中受到了嚴(yán)重影響,其中的HIS-24:GFP持續(xù)大于野生型的4倍(圖2A和圖S2,L到O)。通過卵黃脂蛋白的降解來滋養(yǎng)生長中的細(xì)胞貫穿于整個胚胎發(fā)生時期(10、11)。在qx42突變體中, 卵黃標(biāo)記VIT-2:GFP的腸道分泌和卵母細(xì)胞對物質(zhì)的吸收是正常的(圖S3,A到B

6、)。然而,值得注意的是在擴(kuò)大的斑點(diǎn)中qx42胚胎累積了更多的VIT-2:GFP,這與NUC-1:mCherry重疊,暗示溶酶體對卵黃的降解存在缺陷(圖2,B到D,和圖S3,C到H)。細(xì)胞表面蛋白CAV-1和RME-2在野生型胚胎中是可以內(nèi)在化和降解的, 而在qx42胚胎中則累積于增大的溶酶體中(圖S4)(12)。受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚合物是通過自噬途徑遞送到溶酶體對其進(jìn)行降解的(13)。在野生型中胚胎發(fā)育期的自噬基質(zhì)SEPA-1和T12G3.1(哺乳動物p62的線蟲同系物)被清除，但在qx42突變體胚胎中將持續(xù)到后期，并且與NUC-1:mCherry重疊,這顯示自噬溶酶體的降解存在缺陷(圖2，

7、E到G和圖S5)(14、15)。因此,qx42突變體影響了溶酶體內(nèi)吞噬、內(nèi)吞和自噬物質(zhì)的降解。圖2.laat-1突變體在溶酶體降解各種物質(zhì)方面存在缺陷。(A) 野生型和laat-1(qx42)胚胎在不同的時間點(diǎn)顯示HIS-24:GFP和GFP:RAB-7的熒光圖像。箭頭指示吞噬溶酶體。右邊的柱狀圖顯示其量化的結(jié)果, 括號中顯示的是平均持續(xù)時間(±SEM)。(B到G) 野生型(B)和(E)或laat-1(qx42)(C)和(F)胚胎顯示NUC-1:mCherry和VIT2:GFP(B)和(C)或T12G3.1:GFP(E)和(F)的共焦熒光圖像。箭頭表示重疊的GFP和mCherry;箭

8、頭的頭指示不重疊的GFP。插圖顯示黃色箭頭或箭頭的頭所指的結(jié)構(gòu)放大4倍的效果。量化結(jié)果顯示在(D)和(G)中。每個種系中至少選出10個胚胎。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM。* * P < 0.0001。比例尺：5微米。在qx42中受到影響的基因是Y43H11AL.2,它編碼一個內(nèi)含七個可預(yù)測的跨膜域和兩個內(nèi)在的PQ(脯氨酸-谷氨酰胺)循環(huán)重復(fù)單位的保守蛋白質(zhì),這是溶酶體胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LCTs) 的特點(diǎn)(16)(圖S6F)。Cystinosin，這一原始型LCT的家族成員是溶酶體胱氨酸運(yùn)輸體，其功能異常將導(dǎo)致胱氨酸病(4)。我們基于其與LCT家族蛋白和細(xì)胞功能將Y43H11AL.2基

9、因命名為laat-1(溶酶體氨基酸運(yùn)輸體1) (見下文)。在qx42中l(wèi)aat-1上存在一個A > T的突變,從而導(dǎo)致在Asn127之后產(chǎn)生了一個提前終止的密碼子。其他獨(dú)立分離的laat-1等位基因突變也導(dǎo)致增大的溶酶體和持續(xù)性細(xì)胞死亡的表型(圖S1,L到R,和圖S2K)。在胚胎、幼體以及成體的各種細(xì)胞中均有l(wèi)aat-1的表達(dá) (圖S7)。GFP或mCherry與LAAT-1的融合,充分彌補(bǔ)了qx42的缺陷(圖S6,A到E), NUC-1-或溶酶體陽性示蹤物標(biāo)記的膜的結(jié)構(gòu)和與溶酶體膜蛋白CTNS-1這一人類cystinosin的秀麗隱桿線蟲同系物重疊(17),表明LAAT-1位于溶酶體膜

10、(圖1,G到H,和圖S7,A到C)。LAAT-1(299 - 304):GFP缺乏C末端溶酶體分選基序(18)，染色的血漿膜代替了溶酶體并且未能獲得LAAT-1(qx42)突變體的表型,這表明LAAT-1的功能取決于它的溶酶體的定位(圖S6,A到F,和S7，D到E)。我們對從線蟲胚胎純化出的溶酶體進(jìn)行了檢查 (圖S8),并且發(fā)現(xiàn)CTNS-1的缺失導(dǎo)致胱氨酸積累,這表明CTNS-1就像人類的cystinosin一樣介導(dǎo)了胱氨酸從溶酶體的流出 (圖3A)。在laat-1突變的溶酶體中,胱氨酸的水平是正常的,但賴氨酸和精氨酸的含量分別比野生型的高16和8倍,表明LAAT-1從溶酶體中運(yùn)出賴氨酸和精氨

11、酸 (圖3A和圖S9A)。來自于ctns-1突變體的巨噬細(xì)胞狀的體腔細(xì)胞包含有巨大的顆粒(直徑>6.5微米),它們累積內(nèi)源性的產(chǎn)物Cherry并且可被溶酶體膜蛋白CUP-5標(biāo)記，而不是胞內(nèi)蛋白REM-8,這表明他們是增大的溶酶體(19、20)(圖3,B和C,和圖S9B)。大多數(shù)野生型和laat-1(qx42)體腔細(xì)胞包含小溶酶體(< 4.5毫米)或大2至3倍的溶酶體(4.5-6.5微米)(圖3C)。ctns-1突變體的半胱胺治療大大降低了溶酶體內(nèi)胱氨酸的積累并幾乎完全抑制了溶酶體增大的表型(圖3,C和D)。然而,在laat-1(qx42)和ctns-1(ok813)雙突變體中,半胱

12、胺不能耗盡溶酶體的胱氨酸，也不能抑制溶酶體的增大,它積累了高水平的胱氨酸和賴氨酸類似物與半胱氨酸-半胱胺二硫化物的混合物(圖3,C到E)。這些數(shù)據(jù)清楚地表明laat-1將賴氨酸運(yùn)輸出溶酶體。圖3.LAAT-1是溶酶體賴氨酸和精氨酸的運(yùn)輸?shù)鞍住?A)在確定野生型中胚胎溶解產(chǎn)物并且將其規(guī)定為一個單位的前提下，溶酶體中氨基酸濃度與胞質(zhì)中氨基酸濃度的比值 (y軸)。(B) 野生型和ctns-1(ok813)coelomoctyes的微分干涉差(DIC)和熒光圖像顯示分泌的Cherry(ssCherry)和溶酶體的標(biāo)記物GFP:CUP-5。溶酶體被Cherry和CUP-5標(biāo)記(箭頭)。插圖顯示的是黃色箭

13、頭所指的溶酶體。比例尺：5微米。量化結(jié)果顯示在(C)中。(D和E)胱氨酸(D)和半胱氨酸-半胱胺混合二硫化物(E)決定于半胱胺治療后和規(guī)范化為1個單位的野生型中溶酶體的純化分?jǐn)?shù)(PLF)。(F和G) 在(F)LAAT-1 -或(G)PQLC-2-表達(dá)的 cos 7細(xì)胞中賴氨酸和精氨酸的吸收量。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM。* * P < 0.0001;* P < 0.05;所有其它點(diǎn)P > 0.05。數(shù)據(jù)在(A)、(D),(E)、(F)和(G)代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。我們設(shè)計(jì)了研究LAAT-1或與其相對應(yīng)的人類PQLC2運(yùn)輸賴氨酸和精氨酸是否使用基于整個細(xì)胞運(yùn)輸體的試驗(yàn)(4

14、)。野生型中PQLC2:GFP定位于COS-7細(xì)胞的溶酶體中,而缺乏溶酶體分選基序的PQLC2(LL):GFP則與漿膜結(jié)合, 這表明PQLC2是一種像LAAT-1一樣的溶酶體膜蛋白 (圖S6F和圖S9 ，C 到H)。漿膜有針對性的表達(dá)LAAT-1LAAT -1(299 - 304):PQLC2 GFP或PQLC2(LL):GFP導(dǎo)致了賴氨酸和精氨酸的吸收增加,當(dāng)在第一個PQ循環(huán)中不變的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼釙r，這一現(xiàn)象幾乎完全被消除(圖3,F和G,和圖S6F)。在LAAT-1或PQLC2-表達(dá)的細(xì)胞中組氨酸吸收量增加,而不是丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、胱氨酸,這表明陽離子氨基酸具有特定的運(yùn)輸(圖S1

15、0)。laat-1溶酶體沒有明顯的組氨酸積累,這表明在體內(nèi)LAAT-1可能不是主要的組氨酸運(yùn)輸體(圖S9A)。laat-1突變體是可以存活的,但是生長緩慢(圖4A)。外部補(bǔ)充賴氨酸和精氨酸可以完全緩解生長遲緩的胚胎發(fā)育(圖4B和圖S11,A和B)，但是不能逆轉(zhuǎn)laat-1突變體中增大的溶酶體或有缺陷的卵黃降解表型(圖S11C)。因此,laat-1突變體中的缺陷影響賴氨酸和精氨酸運(yùn)出溶酶體,這限制了其胞質(zhì)的可用性,從而阻礙了胚胎發(fā)育。當(dāng)氨基酸缺少時,真核細(xì)胞通過蛋白激酶GCN2的激活觸發(fā)氨基酸反應(yīng)(AAR)途徑,導(dǎo)致整體的蛋白質(zhì)合成受到抑制(21)。與此一致的是,laat-1胚胎也減少了蛋白質(zhì)的

16、合成,這樣就通過補(bǔ)充賴氨酸和精氨酸得到了有效地緩解(圖4 C和圖S11D)(22)。AAR途徑是氨基酸不足時生物體存活所必需的在(23、24)。gcn-2(ok871)胚胎發(fā)育正常,但當(dāng)laat-1有缺陷時則死亡。合成的致死性可以被補(bǔ)充賴氨酸和精氨酸所完全緩解，而不是甘氨酸(圖4 D)。因此, laat-1的缺陷限制了胞質(zhì)賴氨酸和精氨酸的合成, 當(dāng)gcn 2介導(dǎo)的AAR途徑受到影響時就會引起胚胎死亡(圖S11E)。圖4. LAAT-1維持正常胚胎發(fā)育中賴氨酸和精氨酸的可用性。(A和B) 外部補(bǔ)充賴氨酸和精氨酸可以緩解laat-1突變體中的胚胎發(fā)育阻滯。至少有88個胚胎被檢測。(C) 在野生型,

17、laat-1(qx42)和laat-1(qx111)胚胎中通過熒光光漂白恢復(fù)在有或沒有外部提供的賴氨酸和精氨酸的情況下測定Plaat-1mCherry來表示蛋白質(zhì)合成率。在每個種系和治療后至少有20個胚胎被量化。(D) laat-1和gcn 2的缺陷導(dǎo)致產(chǎn)生胚胎的致死性。y軸表示每個種系和治療后可存活的胚胎的比例。三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)里每個至少有95個胚胎被檢測。在圖(C)和(D)中,數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM。* * P < 0.0001。在圖(B)到(D)中,賴氨酸(K)和精氨酸(R) 每種補(bǔ)充100毫摩爾,甘氨酸(G)補(bǔ)充200毫摩爾。我們已經(jīng)將LAAT-1及其人類的同系物PQLC2確定為溶酶體的賴氨酸/精氨酸運(yùn)輸體。在ctns-1(lf) 單突變體中，半胱胺治療顯著降低了