微生物工程實驗

1、實驗一 淀粉酶生產(chǎn)菌的篩選一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方法。二、實驗原理淀粉酶在釀造、紡織、食品加工、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛用途。淀粉酶是一類淀粉水解酶的統(tǒng)稱，它能將淀粉水解成糊精等小分子物質(zhì)并進一步水解成麥芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再變藍色，因此可根據(jù)淀粉培養(yǎng)基上透明圈的大小來判斷所選菌株的淀粉酶活力。三、實驗用品1樣品淀粉含量豐富的土樣。2培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至1000ml，pH7.0。121滅菌20min。初篩平板培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉 2g，瓊脂 18g，加水至1000ml，pH7.4。121滅菌

2、20min。Lugol碘液：碘 1g，碘化鉀 2g，蒸餾水 300ml。先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘溶解于碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足水即可。3器材高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，電子天平，電爐，恒溫振蕩器，恒溫培養(yǎng)箱；燒杯，量筒，三角瓶，培養(yǎng)皿，移液管，洗耳球，試管，試管架，接種針，涂布棒。四、實驗方法1培養(yǎng)基制備：配制肉湯培養(yǎng)基45ml，分裝于250ml三角瓶中，紗布封口，滅菌。配制初篩平板培養(yǎng)基350ml，分裝于500ml三角瓶中，封口膜封口，滅菌。2倒平板：將融化的初篩平板培養(yǎng)基冷卻至5060，以無菌操作法倒至已滅菌的培養(yǎng)皿中，至蓋滿底部。冷卻凝固待用。3樣品預(yù)處理：取5g土樣接入4

3、5ml肉湯培養(yǎng)基中，30搖床振蕩15min制成土壤懸液，此時的稀釋度為10-1。另取4支試管，分別記作10-2、10-3、10-4、10-5共5個梯度，每支試管內(nèi)加入9mL無菌水。用無菌移液管從三角瓶中吸取1mL土壤懸液，加入到10-2試管中混勻，再從此試管中吸取1mL加入到10-3試管中，依此類推直至10-5試管。4平板涂布分離：分別從不同稀釋度的試管中吸取0.1ml懸液，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，于30培養(yǎng)2448h。5菌株檢測：待初篩平板長出菌落后，根據(jù)菌落不同挑取菌落進行保存并編號。同時，將檢測試劑（Lugol碘液）加入到平板中，涂布均勻，菌落周圍形成水解圈的菌株即是產(chǎn)淀粉酶的菌株，

4、記住其編號，以便進行下一步實驗。6保存菌種：將得到的菌株轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)4872h，待菌苔長好后，4保存。五、思考題微生物菌種的分離篩選通常包括哪幾個部分？實驗二 淀粉酶酶活測定一、實驗?zāi)康?掌握分光光度法測定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法2從初篩所獲得的菌株中篩選出淀粉酶活力高的菌株二、實驗原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的一類酶，包括-淀粉酶、淀粉1，4-麥芽糖苷酶（-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（異淀粉酶）。-淀粉酶可以從淀粉分子內(nèi)部切斷淀粉的-1，4糖苷鍵，形成麥芽糖、含6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使淀粉的粘度下降，

5、因此又稱為液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈藍色。這種淀粉-碘復(fù)合物在660nm處有較大的吸收峰，可以用分光光度計測定。隨著酶的不斷作用，淀粉長鏈被切斷，生成小分子糊精，使其對碘的藍色反應(yīng)逐漸消失，因此可以根據(jù)一定時間內(nèi)藍色消失的程度為指標來測定-淀粉酶的活力。三、實驗用品1粗酶液實驗一保存的菌種進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液離心后可作為粗酶液。2試劑碘原液：稱取碘化鉀22g，加少量蒸餾水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，貯于棕色瓶中；比色用稀釋碘液：取碘原液2ml，加碘化鉀20g，用蒸餾水定容至500ml，貯于棕色瓶中；2%可溶性淀粉：稱取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸餾水混合調(diào)勻，徐徐傾入煮

6、沸的蒸餾水中，邊加邊攪拌，煮沸2min后冷卻，加水定容至100ml，需當天配制；pH6.0的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）4.523g，檸檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；0.5mol/L乙酸溶液。3器材離心機，分光光度計，恒溫水浴鍋，試管架，秒表；試管，移液管，燒杯，離心管。四、實驗方法1標準曲線的繪制：表21標準曲線的制作試 劑管號123456淀粉稀釋液濃度/%00.20.51.01.52.0淀粉稀釋液/ml222222緩沖液/ml11111140水浴中保溫5min蒸餾水/ml11111140水浴中保溫30min，加入0.5mol

7、/L乙酸10ml，混勻后吸取反應(yīng)液1ml稀碘液/ml101010101010A660將可溶性淀粉稀釋成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀釋液；吸取淀粉稀釋液2.0ml加至試管中，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.0ml，40水浴保溫15min；加蒸餾水1ml，40保溫30min后加入0.5mol/L乙酸10ml；吸取反應(yīng)液1ml，加入稀碘液10ml，混勻，在660nm下測吸光值A(chǔ)；以淀粉濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，作標準曲線。2酶液的制備將發(fā)酵液離心（5000r/min，10min），取上清液作為粗酶液，以pH6.0緩沖液稀釋至適當濃度，作為待測酶液。3淀粉酶活力測定按下列程序操作：

8、試管A（空白）試管B（酶試樣，需作三個平行試樣）加2%淀粉稀釋液2.00ml加2%淀粉稀釋液2.00ml加緩沖液1.00ml（搖勻）加緩沖液1.00ml（搖勻）40±0.2，5min40±0.2，5min加蒸餾水1.00ml（搖勻）加粗酶液1.00ml（搖勻）40±0.2，30min40±0.2，30min加乙酸10.0ml加乙酸10.0ml混勻混勻取反應(yīng)液1.00ml取反應(yīng)液1.00ml加稀碘液10.00ml加稀碘液10.00ml混勻混勻測定A660測定A660五、注意事項1淀粉一定要用少量冷水調(diào)勻，再倒入熱水中溶解，若直接加到熱水中，會溶解不均勻，甚

9、至結(jié)塊。淀粉液應(yīng)當天配制，配好的淀粉液應(yīng)是透明澄清的，不能有顆粒狀物質(zhì)存在。2酶液應(yīng)該進行適當稀釋。六、作業(yè)1繪制標準曲線。2記錄各樣品的A660，并計算其酶活力，計算方法參見附錄。七、思考題1測定酶活力時，在具體操作上應(yīng)注意哪些問題？2為什么測定酶活力的試劑要在40水浴鍋中預(yù)熱？附：酶活力單位的定義：1ml酶液在40、pH 6.0的條件下，每小時分解的淀粉的毫克數(shù)。表示為u/ml。實驗三 淀粉酶生產(chǎn)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化一、實驗?zāi)康恼莆瞻l(fā)酵培養(yǎng)基的配制原則，熟悉用正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法。二、實驗原理發(fā)酵條件對產(chǎn)物的形成有著非常重要的影響，其中培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度和通氣狀況是三類最主要的發(fā)酵條

10、件。培養(yǎng)基pH一般指滅菌前的pH，可以酸堿溶液調(diào)節(jié)控制，因發(fā)酵過程中pH會不斷改變，所以最好用緩沖溶液來調(diào)節(jié)；通氣狀況可用培養(yǎng)基裝量和搖床轉(zhuǎn)速來衡量，封口紗布的厚度也會影響氧氣的傳遞，一般以68層為好。發(fā)酵培養(yǎng)基是指大生產(chǎn)時所用的培養(yǎng)基，一般碳源含量較高。工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基與菌種篩選時所用培養(yǎng)基不同，以經(jīng)濟節(jié)約為主，一般選用廉價的農(nóng)副產(chǎn)品為原料。由于天然原料的組分復(fù)雜，不同批次的原料成分各不相同，因此發(fā)酵前必須進行培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗。本實驗將對菌株的培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化。三、實驗用品1菌種:實驗一篩選得到的淀粉酶生產(chǎn)菌。2器材:搖床，高壓滅菌鍋；三角瓶，燒杯，移液管，試管。四、實驗方法1培養(yǎng)基制備：以

11、黃豆粉、玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏作為培養(yǎng)基的主要影響因素，每一因素設(shè)定3個水平，按表3-1配制培養(yǎng)基（W/V），另加入Na2HPO4 0.8%，(NH4)2SO4 0.4%，NH4Cl 0.15%，分裝于250ml三角瓶，每瓶50ml，6層紗布封口，滅菌。取5ml蒸餾水加入試管中，滅菌。2接種：挑取斜面菌苔5環(huán)接入5ml無菌水中，搖勻后用無菌移液管吸取0.5ml菌懸液，接到每一組培養(yǎng)基中。30，150r/min搖床培養(yǎng)36h左右。3結(jié)果測定：參照實驗三方法測定菌株在各培養(yǎng)基中培養(yǎng)的淀粉酶活力。表3-1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗表組別因素A黃豆粉因素B玉米粉因素C淀粉因素D酵母膏酶活力/(U/m

12、l)113%11%13%10.4%213%22%25%20.6%313%33%37%30.8%425%11%25%30.8%525%22%37%10.4%625%33%13%20.6%737%11%37%20.6%837%22%13%30.8%937%33%25%10.4%五、作業(yè)將酶活力測定結(jié)果填入表3-1，通過正交分析，確定三個因素對酶活力影響的主次順序，并確定最適培養(yǎng)基配方。六、思考題正交試驗原理。實驗四 淀粉酶的提取一、實驗?zāi)康恼莆整}析法的基本原理，學(xué)會用鹽析法提取蛋白質(zhì)。二、實驗原理鹽析法是加入中性鹽到蛋白質(zhì)溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度開始增大，但隨著繼續(xù)加入鹽，蛋白質(zhì)的溶解度卻逐步減小，

13、并形成沉淀，不同蛋白質(zhì)在不同中性鹽濃度下析出，利用此原理，可對溶液中的雜蛋白質(zhì)及目的蛋白進行分級沉淀以達到提取分離的目的。三、實驗用品1粗酶液實驗一保存的菌種進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液離心后可作為粗酶液。2器材燒杯，布氏漏斗，真空泵。四、實驗方法1鹽析：取120ml發(fā)酵液倒入燒杯中，調(diào)pH至6.7-7.8，加硫酸銨使其濃度達到40%-42%，加完后靜止數(shù)小時（3小時以上），即可抽濾或離心，收集濾餅。2加入硫酸銨量的計算方法：硫酸銨的溶解度在0-30變化很少，在水中飽和溶液濃度密度約為1.235g/ml。在20飽和溶液為533g/L，但加入硫酸銨體積會變大，1L水中加硫酸銨至飽和需加硫酸銨761g。考慮到溶液硫酸銨體積要增大，則于20時使1LM1摩爾濃度硫酸銨溶液增至M2摩爾濃度，所需的硫酸銨量為GG=533（M2-M1）/(4.05-0.3M2)上式如以飽和度表示，則以S1%增至S2%，需加入量為G=533（S2-S1）/(100-0.3S2)本實驗所需硫酸銨濃度為40%-42%當硫酸銨濃度為40%時，G