第四章植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉2014

1、 植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)指對植物胚、子房、胚珠、胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，指對植物胚、子房、胚珠、胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成使其發(fā)育成完整植株完整植株的培養(yǎng)方式。的培養(yǎng)方式。第四章第四章 植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉一、胚培養(yǎng)的意義（應(yīng)用）一、胚培養(yǎng)的意義（應(yīng)用）1. 促使促使發(fā)育不良和中途敗育發(fā)育不良和中途敗育的胚發(fā)育成熟（胚搶救）的胚發(fā)育成熟（胚搶救）高等植物的種間和屬間進(jìn)行高等植物的種間和屬間進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交遠(yuǎn)緣雜交時，時， 由由胚乳發(fā)育不良胚乳發(fā)育不良使雜種胚的敗育。使雜種胚的敗育。 可以建立胚胎培養(yǎng)，可以建立胚胎培養(yǎng)， 在人工培養(yǎng)基上供應(yīng)與在人工培養(yǎng)基上供應(yīng)與胚乳成分類似胚乳

2、成分類似的外源營養(yǎng)，以保證胚的正常發(fā)育。的外源營養(yǎng)，以保證胚的正常發(fā)育。2. 打破休眠期打破休眠期促使萌發(fā)促使萌發(fā)胚培養(yǎng)可以胚培養(yǎng)可以克服種子發(fā)育上的障礙克服種子發(fā)育上的障礙和和促進(jìn)胚的生長促進(jìn)胚的生長， 提高發(fā)芽率、縮短育種周期或加速良種繁育。提高發(fā)芽率、縮短育種周期或加速良種繁育。第一節(jié)第一節(jié) 胚培養(yǎng)胚培養(yǎng)3. 克服多胚品種克服多胚品種珠心胚的干擾珠心胚的干擾 仙人掌、仙人掌、柑橘柑橘等，除正常等，除正常有性胚有性胚外，還配以從外，還配以從珠心組織珠心組織發(fā)生多個不定胚。發(fā)生多個不定胚。 這些不定胚常常侵入胚囊，使這些不定胚常常侵入胚囊，使合子胚發(fā)育受阻合子胚發(fā)育受阻，影響了育種效率。，影

3、響了育種效率。4. 快速繁殖良種砧木快速繁殖良種砧木 可以產(chǎn)生大量的可以產(chǎn)生大量的次生胚次生胚，加速良種砧木的繁殖；，加速良種砧木的繁殖； 而且胚胎發(fā)生技術(shù)是而且胚胎發(fā)生技術(shù)是人工種子人工種子的重要基礎(chǔ)。的重要基礎(chǔ)。5. 誘導(dǎo)胚性愈傷組織誘導(dǎo)胚性愈傷組織 利用利用幼胚幼胚或或胚軸胚軸，珠心組織珠心組織等外植體，培養(yǎng)產(chǎn)生等外植體，培養(yǎng)產(chǎn)生胚性愈傷組織胚性愈傷組織， 為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體分離、融合，或遺傳轉(zhuǎn)化提供很好的為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體分離、融合，或遺傳轉(zhuǎn)化提供很好的材料材料。 6. 種子生活力的測定種子生活力的測定 測定測定休眠的種子休眠的種子生活力，應(yīng)用一般的萌發(fā)試驗需時間很長，生活

4、力，應(yīng)用一般的萌發(fā)試驗需時間很長， 要預(yù)先進(jìn)行要預(yù)先進(jìn)行后熟處理。后熟處理。 離體培養(yǎng)時間短離體培養(yǎng)時間短。 7. 稀有植物的繁殖稀有植物的繁殖 芭碧蕉芭碧蕉是商品香蕉的一個野生親緣物種，其是商品香蕉的一個野生親緣物種，其種子種子在在自然條件自然條件下下不能萌發(fā)不能萌發(fā)， 然而通過然而通過離體胚的培養(yǎng)離體胚的培養(yǎng)很容易產(chǎn)生幼苗。很容易產(chǎn)生幼苗。作為一種作為一種異常異?，F(xiàn)象，有些現(xiàn)象，有些椰子椰子不能產(chǎn)生不能產(chǎn)生液體胚乳液體胚乳，而是一種，而是一種肥厚的組織肥厚的組織。 由于十分罕見，價格非常由于十分罕見，價格非常昂貴昂貴，在菲律賓只有盛大宴會才供應(yīng)這種果實，在菲律賓只有盛大宴會才供應(yīng)這種果實，

5、 這種椰子的這種椰子的種子種子也只能通過也只能通過離體培養(yǎng)離體培養(yǎng)才能萌發(fā)。才能萌發(fā)。此外此外，通過胚胎培養(yǎng)，通過胚胎培養(yǎng)，探討胚胎發(fā)育的機(jī)制、探討胚胎發(fā)育的機(jī)制、開展人工受精、開展人工受精、以及胚與胚乳的相互關(guān)系以及胚與胚乳的相互關(guān)系等等基礎(chǔ)研究基礎(chǔ)研究。杜鵑杜鵑種子種子1. 材料的消毒與接種材料的消毒與接種 種子種子95%酒精消毒酒精消毒選取完好種子選取完好種子70%酒精浸數(shù)酒精浸數(shù)S 0.1%升汞或升汞或10%次氯酸鈉浸泡次氯酸鈉浸泡無菌水沖洗無菌水沖洗 種子培養(yǎng)幾天種子培養(yǎng)幾天剝離種胚剝離種胚接種在培養(yǎng)基上。接種在培養(yǎng)基上。2. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 成熟胚是含有成熟胚是含有根原基根原基和和莖

6、原基莖原基以及以及1個或個或2個次生附屬個次生附屬子葉子葉， 培養(yǎng)時進(jìn)一步發(fā)育產(chǎn)生根和莖，培養(yǎng)時進(jìn)一步發(fā)育產(chǎn)生根和莖， 此時在營養(yǎng)上相對獨立，只需要提供此時在營養(yǎng)上相對獨立，只需要提供簡單簡單的的營養(yǎng)條件營養(yǎng)條件， 在含有在含有大量元素大量元素的無機(jī)鹽和的無機(jī)鹽和糖糖的培養(yǎng)基上即能生長。的培養(yǎng)基上即能生長。二、成熟胚的培養(yǎng)二、成熟胚的培養(yǎng)3. 種胚培養(yǎng)的外界條件種胚培養(yǎng)的外界條件 光照光照：黑暗黑暗。 溫度：溫度：25溫度較適，溫度較適， 但但有些材料有些材料的生長需要較高的溫度，的生長需要較高的溫度， 如如熱帶熱帶蘭花的雜交種胚的培養(yǎng)，適于蘭花的雜交種胚的培養(yǎng)，適于30溫度；溫度； 具有具有

7、休眠休眠習(xí)性的植物種胚，習(xí)性的植物種胚， 接種后先在接種后先在4溫度下，培養(yǎng)一段時間，然后轉(zhuǎn)入正常溫度培養(yǎng)。溫度下，培養(yǎng)一段時間，然后轉(zhuǎn)入正常溫度培養(yǎng)。固體固體培養(yǎng)培養(yǎng) 原胚指原胚指未成熟未成熟的幼胚。的幼胚。 其離體培養(yǎng)技術(shù)其離體培養(yǎng)技術(shù)難度較大難度較大， 越越早期早期的胚，培養(yǎng)越困難。的胚，培養(yǎng)越困難。 其分離需在其分離需在顯微鏡顯微鏡下進(jìn)行。下進(jìn)行。 Hanning早在早在1904年就培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的年就培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚胚， 發(fā)現(xiàn)離體胚可以發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育充分發(fā)育， 并且并且提前萌發(fā)提前萌發(fā)形成小苗，形成小苗， 這是世界上這是世界上胚培養(yǎng)最早胚培養(yǎng)最早獲得成功的一例。獲得

8、成功的一例。三、原胚（幼胚）培養(yǎng)三、原胚（幼胚）培養(yǎng)幼胚則要求更幼胚則要求更復(fù)雜復(fù)雜的培養(yǎng)基。的培養(yǎng)基。除了一般的除了一般的無機(jī)鹽無機(jī)鹽成分外，還要加入成分外，還要加入微量元素微量元素和和生長輔助物質(zhì)生長輔助物質(zhì)，不同發(fā)育時期的幼胚對培養(yǎng)基成分要求不同，胚齡越小培養(yǎng)及成份越復(fù)雜。不同發(fā)育時期的幼胚對培養(yǎng)基成分要求不同，胚齡越小培養(yǎng)及成份越復(fù)雜。 對培養(yǎng)基對培養(yǎng)基營養(yǎng)營養(yǎng)的要求，認(rèn)為的要求，認(rèn)為無機(jī)氮無機(jī)氮是以硝酸鹽、亞硝酸鹽或銨鹽的形式供給，是以硝酸鹽、亞硝酸鹽或銨鹽的形式供給， 硝酸鹽硝酸鹽比銨鹽好。比銨鹽好。培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的滲透壓滲透壓對幼胚的發(fā)育有密切的關(guān)系。對幼胚的發(fā)育有密切的關(guān)系。通

9、常培養(yǎng)基的滲透壓用通常培養(yǎng)基的滲透壓用蔗糖蔗糖調(diào)整，也可以用甘露醇，調(diào)整，也可以用甘露醇，用量在用量在812左右（甚至左右（甚至1818），），糖濃度過低還會引起胚早熟萌發(fā)糖濃度過低還會引起胚早熟萌發(fā) 幼胚不同發(fā)育時期對培養(yǎng)基幼胚不同發(fā)育時期對培養(yǎng)基滲透壓滲透壓要求不一。要求不一。 液體液體培養(yǎng)培養(yǎng)1. 基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（1）生長調(diào)節(jié)劑）生長調(diào)節(jié)劑 生長素與細(xì)胞分裂素生長素與細(xì)胞分裂素合理搭配合理搭配，才能控制胚性生長，促使胚發(fā)育成熟。，才能控制胚性生長，促使胚發(fā)育成熟。 添加生長調(diào)節(jié)劑添加生長調(diào)節(jié)劑不當(dāng)不當(dāng)，可能改變胚胎，可能改變胚胎發(fā)育發(fā)育的的方向方向， 轉(zhuǎn)向脫分化而形成轉(zhuǎn)向脫分化而形

10、成愈傷組織愈傷組織， 或引發(fā)或引發(fā)早熟萌發(fā)早熟萌發(fā)。（2）其他物質(zhì)）其他物質(zhì) 氨基酸：氨基酸：谷氨酰胺谷氨酰胺等；等； 維生素：必需。硫胺素、煙酸、維生素：必需。硫胺素、煙酸、泛酸泛酸等；等； 附加物附加物：椰乳、香蕉、酵母提取物等天然有機(jī)物或活性炭。：椰乳、香蕉、酵母提取物等天然有機(jī)物或活性炭。2. 生長調(diào)節(jié)劑及其他附加物的影響生長調(diào)節(jié)劑及其他附加物的影響 多培養(yǎng)基多培養(yǎng)基培培養(yǎng)：養(yǎng)：外環(huán)，較簡單的培養(yǎng)基；外環(huán)，較簡單的培養(yǎng)基； 中央，較復(fù)雜的培養(yǎng)基中央，較復(fù)雜的培養(yǎng)基 - - 接種幼胚接種幼胚。 （異養(yǎng)（異養(yǎng)自養(yǎng)）自養(yǎng)） 胚乳看護(hù)胚乳看護(hù)培養(yǎng)：培養(yǎng)基周圍放置同種或異種培養(yǎng)：培養(yǎng)基周圍放置同

11、種或異種胚乳胚乳。胚柄胚柄的作用的作用位于胚根一端，對幼胚的位于胚根一端，對幼胚的存活存活是關(guān)鍵，顯著是關(guān)鍵，顯著刺激胚刺激胚的進(jìn)一步發(fā)育。的進(jìn)一步發(fā)育。3.培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法4. 培養(yǎng)過程培養(yǎng)過程幼胚培養(yǎng)的幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵技術(shù) 取材時期取材時期 幼胚剝離幼胚剝離 培養(yǎng)條件的控制培養(yǎng)條件的控制 （是否需要特殊處理）（是否需要特殊處理） 成熟或未成熟成熟或未成熟子房子房70%酒精浸數(shù)酒精浸數(shù)S0.1%升汞或飽和漂白粉浸升汞或飽和漂白粉浸10-30min 無菌水沖洗無菌水沖洗剖出胚珠剖出胚珠取出取出完整胚完整胚接種在培養(yǎng)基上。接種在培養(yǎng)基上。 一般采用一般采用液體液體培養(yǎng)法。培養(yǎng)法。 培養(yǎng)條件

12、：培養(yǎng)條件： 20-30，2000Lx，10-14hr1）按）按正常胚胎發(fā)育途徑正常胚胎發(fā)育途徑形成植株（維持胚性生長）形成植株（維持胚性生長）2）胚胎）胚胎脫分化脫分化形成愈傷組織形成愈傷組織 多數(shù)植物幼胚形成愈傷組織，多數(shù)植物幼胚形成愈傷組織，再分化再分化成胚狀體或形成芽苗。成胚狀體或形成芽苗。3）胚）胚“早熟萌發(fā)早熟萌發(fā)” 幼胚不再發(fā)育，迅速萌發(fā)成幼苗。幼胚不再發(fā)育，迅速萌發(fā)成幼苗。 多數(shù)情況多數(shù)情況1個幼胚萌發(fā)成個幼胚萌發(fā)成1個植株；個植株； 有時因細(xì)胞分裂形成有時因細(xì)胞分裂形成許多胚狀體許多胚狀體，進(jìn)而形成許多植株，即，進(jìn)而形成許多植株，即叢生胚叢生胚現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 “早熟萌發(fā)早熟萌發(fā)

13、”產(chǎn)生產(chǎn)生畸形苗畸形苗，或瘦弱發(fā)育不正常而，或瘦弱發(fā)育不正常而死亡死亡。 這種畸形苗加以利用分離培養(yǎng)這種畸形苗加以利用分離培養(yǎng)變異體變異體，作為育種材料，作為育種材料.5. 幼胚培養(yǎng)的發(fā)育途徑幼胚培養(yǎng)的發(fā)育途徑胚乳培養(yǎng)的最早研究始于胚乳培養(yǎng)的最早研究始于1933年，年，Lampe和和Mills首例進(jìn)行了首例進(jìn)行了玉米玉米胚乳培養(yǎng)。胚乳培養(yǎng)。到目前為止，已有到目前為止，已有40多種植物的胚乳進(jìn)行了培養(yǎng)。多種植物的胚乳進(jìn)行了培養(yǎng)。其中蘋果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴其中蘋果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等近薯、梨、核桃等近2

14、0種植物的胚乳培養(yǎng)得到了種植物的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株再生植株。其它有的分化出芽、根、葉等或得到愈傷組織。其它有的分化出芽、根、葉等或得到愈傷組織。 胚乳培養(yǎng)：將胚乳培養(yǎng)：將胚乳胚乳組織從母體上分離下來，通過離體培養(yǎng)，組織從母體上分離下來，通過離體培養(yǎng)， 使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。 裸子植物裸子植物，胚乳胚乳是由雌配子體發(fā)育而成，是是由雌配子體發(fā)育而成，是單倍體單倍體。 被子植物被子植物，胚乳胚乳是雙受精的產(chǎn)物，是是雙受精的產(chǎn)物，是三倍體三倍體，因此可以獲得，因此可以獲得無籽果實無籽果實。第二節(jié)第二節(jié) 胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)1.1.胚乳外植體的制備胚乳外植體的制備1 1）胚

15、乳較大胚乳較大塊組織的種子，如大戟科和檀香科的植物，塊組織的種子，如大戟科和檀香科的植物， 可直接將可直接將種子種子表面滅菌，無菌條件下表面滅菌，無菌條件下除去種皮除去種皮即可培養(yǎng)。即可培養(yǎng)。 2 2）帶果實帶果實的的種子種子（斛寄生類），（斛寄生類）， 取授粉幾天后的取授粉幾天后的幼果幼果，表面滅菌后，無菌條件下，表面滅菌后，無菌條件下切開幼果切開幼果， 取出種子，小心取出種子，小心分離出胚乳分離出胚乳，接種在培養(yǎng)基上。，接種在培養(yǎng)基上。 一、胚乳培養(yǎng)方法一、胚乳培養(yǎng)方法（1）愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo) 除除少數(shù)少數(shù)寄生或半寄生植物可寄生或半寄生植物可直接直接從胚乳中從胚乳中分化分化出器官，出

16、器官， 大部分大部分被子植物的胚乳，無論是未成熟的或成熟的，被子植物的胚乳，無論是未成熟的或成熟的， 都需要經(jīng)歷都需要經(jīng)歷愈傷組織階段愈傷組織階段，才能分化植株。，才能分化植株。 胚乳接種后的胚乳接種后的6-10天后，不斷增生成天后，不斷增生成乳白色團(tuán)狀乳白色團(tuán)狀，成為愈傷組織。，成為愈傷組織。2. 胚乳愈傷組織誘導(dǎo)及形態(tài)建成胚乳愈傷組織誘導(dǎo)及形態(tài)建成生長旺盛的愈傷組織應(yīng)及時進(jìn)行生長旺盛的愈傷組織應(yīng)及時進(jìn)行分化培養(yǎng)分化培養(yǎng)，此時，此時需光需光。胚乳愈傷組織誘導(dǎo)器官的形成也可通過胚乳愈傷組織誘導(dǎo)器官的形成也可通過器官發(fā)生器官發(fā)生和和胚胎發(fā)生胚胎發(fā)生2種途徑來實現(xiàn)。種途徑來實現(xiàn)。 通過通過胚胎發(fā)生

17、胚胎發(fā)生途徑獲得再生植株，最早的是途徑獲得再生植株，最早的是柑橘柑橘。 通過通過胚胎發(fā)生胚胎發(fā)生途徑獲得再生植株的植物有途徑獲得再生植株的植物有檀香、橙、桃、棗、核桃和獼猴桃等。檀香、橙、桃、棗、核桃和獼猴桃等。（2）形態(tài)建成）形態(tài)建成 （3） 3倍體后代的特征倍體后代的特征1）形態(tài)特征形態(tài)特征 由于被子植物的胚乳由于被子植物的胚乳是是3倍體，倍體， 因此，通過胚乳培養(yǎng)可得到因此，通過胚乳培養(yǎng)可得到3倍體倍體植株，產(chǎn)生植株，產(chǎn)生無籽果實無籽果實； 或由其加倍產(chǎn)生或由其加倍產(chǎn)生6倍體倍體植株。植株。 多倍體植株多倍體植株具有具有 粗壯、粗壯、 葉片大而肥厚、葉色濃、葉片大而肥厚、葉色濃、 花大或

18、重瓣、花大或重瓣、 果實果實大但大但結(jié)實率低結(jié)實率低的特征。的特征。 這些這些變異性狀變異性狀可直接利用或作為可直接利用或作為育種材料育種材料， 尤其在花卉和藥用植物新品種選育方面尤其在花卉和藥用植物新品種選育方面 往往有重要的利用價值。往往有重要的利用價值。 胚乳愈傷組織及再生植株的染色體數(shù)常常發(fā)生變化。胚乳愈傷組織及再生植株的染色體數(shù)常常發(fā)生變化。 如如蘋果蘋果（2n=34）胚乳植株根尖細(xì)胞）胚乳植株根尖細(xì)胞染色體數(shù)染色體數(shù)的分布范圍是的分布范圍是 29-56條，多數(shù)是條，多數(shù)是37-56條，條，3倍體細(xì)胞倍體細(xì)胞只占只占2%-3%。 同一植株是不同倍性細(xì)胞的同一植株是不同倍性細(xì)胞的嵌合體

19、嵌合體。 染色體染色體倍性混亂倍性混亂在胚乳培養(yǎng)中是相當(dāng)在胚乳培養(yǎng)中是相當(dāng)普遍普遍的。的。 但但有些有些植株胚乳培養(yǎng)，如核桃、檀香、橙和柚等，植株胚乳培養(yǎng)，如核桃、檀香、橙和柚等， 其其倍性倍性表現(xiàn)出相對的表現(xiàn)出相對的穩(wěn)定穩(wěn)定性，性， 這些植物的胚乳細(xì)胞往往也能長期保持這些植物的胚乳細(xì)胞往往也能長期保持器官的分化器官的分化能力。能力。2）胚乳再生植株的）胚乳再生植株的倍性倍性胚乳植株染色體數(shù)目的檢查胚乳植株染色體數(shù)目的檢查 取胚乳培養(yǎng)植株取胚乳培養(yǎng)植株根尖根尖、幼葉幼葉或或胚乳愈傷組織胚乳愈傷組織， 0.2-0.5%秋水仙素秋水仙素（或?qū)Χ缺斤柡腿芤海ɑ驅(qū)Χ缺斤柡腿芤海?5下處理下處理4

20、-8h， 流水沖洗，流水沖洗， 卡洛氏液卡洛氏液或或FAA固定（福爾馬林固定（福爾馬林-酒精酒精-醋酸混合固定液），醋酸混合固定液）， 1mol鹽酸，鹽酸，60水浴下，水解水浴下，水解10min， 染色（染色（1%醋酸洋紅，醋酸洋紅，3-5min）、）、 壓片（加壓片（加1滴滴45%醋酸）、醋酸）、 觀察。觀察。 胚乳的胚乳的類型類型、胚乳愈傷組織發(fā)生的胚乳愈傷組織發(fā)生的部位部位、培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中外源激素外源激素的種類和水平。的種類和水平。如獼猴桃來源于同一植株的胚乳，如獼猴桃來源于同一植株的胚乳，可以培養(yǎng)出可以培養(yǎng)出三倍體三倍體和和二倍體二倍體兩種倍性的植株。兩種倍性的植株。ZT 3.0mg

21、/L+NAA 0.5mg/L，愈傷組織再生，愈傷組織再生2倍體倍體植株；植株；ZT 3.0mg/L+2,4-D 1mg/L，愈傷組織再生，愈傷組織再生3倍體倍體植株；植株；影響胚乳培養(yǎng)細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的因素影響胚乳培養(yǎng)細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的因素1.1.培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件（1）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基 在胚乳培養(yǎng)中，常用的基本培養(yǎng)基有在胚乳培養(yǎng)中，常用的基本培養(yǎng)基有White、LS、MS、MT等，等， 其中以其中以MS使用最多。使用最多。 生長調(diào)節(jié)劑：生長調(diào)節(jié)劑：2,4-D、玉米素等；、玉米素等； 天然提取物：天然提取物：20%番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰乳、水解酪蛋白、番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰

22、乳、水解酪蛋白、 酵母提取物酵母提取物 促進(jìn)促進(jìn)胚乳培養(yǎng)；胚乳培養(yǎng)； 蔗糖：小麥蔗糖：小麥8%，枸杞，枸杞5%。（2）培養(yǎng)條件）培養(yǎng)條件 ph4.5-6.5；光照；光照10-12h；溫度；溫度24-26。二、影響胚乳培養(yǎng)的因素二、影響胚乳培養(yǎng)的因素胚乳培養(yǎng)中，胚乳培養(yǎng)中，通常有通常有帶胚培養(yǎng)帶胚培養(yǎng)和和不帶胚培養(yǎng)不帶胚培養(yǎng)兩種方式。兩種方式。帶胚培養(yǎng)帶胚培養(yǎng)胚乳比不帶胚的胚乳組織胚乳比不帶胚的胚乳組織容易容易形成愈傷組織。形成愈傷組織。當(dāng)愈傷組織形成后，當(dāng)愈傷組織形成后，除去胚除去胚并不影響胚乳組織的增殖。并不影響胚乳組織的增殖。2. 胚胚在胚乳培養(yǎng)中的作用在胚乳培養(yǎng)中的作用 被子植物胚乳的發(fā)

23、生方式分為被子植物胚乳的發(fā)生方式分為 核型核型（精核與極核受精后，只以（精核與極核受精后，只以核的分裂核的分裂方式增殖）、方式增殖）、 細(xì)胞型細(xì)胞型（精核與極核受精后，以（精核與極核受精后，以細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂方式增殖）、方式增殖）、 有的精核與極核受精后，有有的精核與極核受精后，有核核分裂和分裂和細(xì)胞細(xì)胞分裂兩種方式分裂兩種方式混生增殖混生增殖。 不論胚乳屬于核型或細(xì)胞型，不論胚乳屬于核型或細(xì)胞型， 處于發(fā)育處于發(fā)育早期早期的胚乳，其愈傷組織的胚乳，其愈傷組織誘導(dǎo)率較低誘導(dǎo)率較低。 旺盛生長期是取材的最佳時期。旺盛生長期是取材的最佳時期。 幾種植物胚乳培養(yǎng)的最佳時間（授粉后天數(shù)）幾種植物胚乳培

24、養(yǎng)的最佳時間（授粉后天數(shù)） 大麥大麥1012天；黃瓜天；黃瓜716天；小黑麥天；小黑麥 714天。天。3. 胚乳發(fā)育類型和發(fā)育程度胚乳發(fā)育類型和發(fā)育程度培養(yǎng)胚乳的培養(yǎng)胚乳的首要目的首要目的是為了直接獲得是為了直接獲得三倍體植株三倍體植株。三倍體三倍體六倍體六倍體生產(chǎn)；生產(chǎn)；倍性多樣性倍性多樣性篩選非整倍體植株；篩選非整倍體植株；雜種雜種胚乳胚乳附加系和代換系附加系和代換系遺傳育種。遺傳育種。 自自1965年以來，許多植物通過胚乳培養(yǎng)獲得了年以來，許多植物通過胚乳培養(yǎng)獲得了3倍倍體幼苗和植株。體幼苗和植株。 但但被子植物被子植物中，培養(yǎng)的胚乳細(xì)胞以及得到的胚乳植株，中，培養(yǎng)的胚乳細(xì)胞以及得到的胚

25、乳植株， 并并不都是不都是三倍體。三倍體。三、三、 胚乳培養(yǎng)的應(yīng)用胚乳培養(yǎng)的應(yīng)用附加系：正常染色體組附加系：正常染色體組添加添加了了1或多條或多條親緣種染色體的品系。親緣種染色體的品系。代換系：正常染色體被異源種屬的代換系：正常染色體被異源種屬的1條或條或1對對染色體染色體代換代換后所形成的品系。后所形成的品系。 一、胚珠培養(yǎng)一、胚珠培養(yǎng)胚珠胚珠是種子植物的大孢子囊，是種子植物的大孢子囊，是孕育雌配子體的是孕育雌配子體的場所場所，也是，也是種子種子形成的前身。形成的前身。 分為受精胚珠和未受精胚珠。分為受精胚珠和未受精胚珠。將將胚珠胚珠從母株中分離出來，從母株中分離出來，放在無菌的人工環(huán)境條件

26、下，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長發(fā)育，以致形成讓其進(jìn)一步生長發(fā)育，以致形成幼苗幼苗的過程。的過程。第三節(jié)第三節(jié) 胚珠和子房培養(yǎng)胚珠和子房培養(yǎng)（1）材料的選擇和滅菌）材料的選擇和滅菌 培養(yǎng)培養(yǎng)受精受精胚珠，摘取授粉時間合適的子房，胚珠，摘取授粉時間合適的子房， 如培養(yǎng)如培養(yǎng)未受精未受精胚珠，則在授粉前摘取子房。胚珠，則在授粉前摘取子房。 子房子房表面滅菌表面滅菌 剖開子房壁，取出剖開子房壁，取出胚珠胚珠或或帶胚珠的胎座帶胚珠的胎座接種。接種。（2）培養(yǎng)基對胚珠培養(yǎng)的影響）培養(yǎng)基對胚珠培養(yǎng)的影響 培養(yǎng)基多為培養(yǎng)基多為White、Nitsch、MS等，等， Nitsch使用更普遍。使用更

27、普遍。1. 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法（3）胎座胎座和和子房子房對胚珠培養(yǎng)的影響對胚珠培養(yǎng)的影響 帶有胎座和子房帶有胎座和子房 對胚珠早期發(fā)育對胚珠早期發(fā)育起重要作用起重要作用。（4）胚發(fā)育時期的影響）胚發(fā)育時期的影響 合子合子和和原胚期原胚期的胚珠的胚珠較難較難剝?nèi)『团囵B(yǎng)，剝?nèi)『团囵B(yǎng)， 對培養(yǎng)基的成分要求嚴(yán)格。對培養(yǎng)基的成分要求嚴(yán)格。原胚期：原胚期：合子不均等橫向分裂形成頂細(xì)胞和基細(xì)胞，合子不均等橫向分裂形成頂細(xì)胞和基細(xì)胞， 分別進(jìn)行縱向和橫向分裂，形成分別進(jìn)行縱向和橫向分裂，形成4個細(xì)胞的原胚。個細(xì)胞的原胚。2. 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 固體固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基 室溫室溫26， 50-60%相對濕度，相對濕度

28、， 光照光照18hr。3. 受精胚珠的發(fā)育受精胚珠的發(fā)育 胚珠胚珠種子種子 胚珠胚珠愈傷組織愈傷組織將將子房子房從母株上摘下，從母株上摘下，放在無菌的人工環(huán)境條件下，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長讓其進(jìn)一步生長發(fā)育，以至形成發(fā)育，以至形成幼苗幼苗的過程。的過程。子房是子房是雌蕊基部雌蕊基部膨大的部分，膨大的部分，由子房壁、胎座和胚珠組成。由子房壁、胎座和胚珠組成。根據(jù)培養(yǎng)的子房是否授粉分為根據(jù)培養(yǎng)的子房是否授粉分為 授粉授粉子房、子房、 未授粉未授粉子房。子房。二、子房培養(yǎng)二、子房培養(yǎng)1. 子房的獲取子房的獲取 未授粉未授粉子房在子房在開花前開花前1-5天摘取子房，天摘取子房， 授粉

29、授粉子房在授粉后摘取子房。子房在授粉后摘取子房。 滅菌滅菌 禾谷類禾谷類幼穗幼穗表面用表面用70%酒精酒精擦拭即可，擦拭即可， 雙子葉雙子葉花蕾漂白粉液花蕾漂白粉液滅菌，滅菌， 其他植株其他植株暴露暴露的子房須的子房須嚴(yán)格消毒嚴(yán)格消毒，無菌濾紙吸干。，無菌濾紙吸干。 撥開幼花，子房接種到培養(yǎng)基上。撥開幼花，子房接種到培養(yǎng)基上。（一）子房培養(yǎng)的過程（一）子房培養(yǎng)的過程固體和液體培養(yǎng)基固體和液體培養(yǎng)基均可均可，26，50-60%相對濕度，相對濕度，光照光照16h。 N6、MS、BN培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。2. .子房的培養(yǎng)子房的培養(yǎng)（二）培養(yǎng)子房的發(fā)育（二）培養(yǎng)子房的發(fā)育 子房子房性細(xì)胞性細(xì)胞愈傷組織或胚

30、狀體愈傷組織或胚狀體單倍體單倍體植株植株 子房子房體細(xì)胞體細(xì)胞愈傷組織或胚狀體愈傷組織或胚狀體二倍體二倍體植株植株 1. 胚珠胚珠 受精胚珠培養(yǎng)目的受精胚珠培養(yǎng)目的打破打破種子的種子的休眠休眠； 挽救胚挽救胚的發(fā)育以獲得雜交種。的發(fā)育以獲得雜交種。 未受精胚珠培養(yǎng)目的未受精胚珠培養(yǎng)目的獲得獲得單倍體單倍體細(xì)胞發(fā)育而來的植株。細(xì)胞發(fā)育而來的植株。2. 子房子房 授粉子房培養(yǎng)目的授粉子房培養(yǎng)目的挽救挽救子房內(nèi)子房內(nèi)雜種胚雜種胚的發(fā)育。的發(fā)育。 未授粉子房培養(yǎng)目的未授粉子房培養(yǎng)目的獲得獲得單倍體單倍體植株；植株； 試管受精試管受精解決雜交育種中解決雜交育種中不親和不親和問題。問題。三、胚珠和子房培養(yǎng)

31、的應(yīng)用三、胚珠和子房培養(yǎng)的應(yīng)用遠(yuǎn)緣雜交中遠(yuǎn)緣雜交中, , 受精前的障礙受精前的障礙如如花粉花粉在柱頭上在柱頭上不能萌發(fā)不能萌發(fā)；花粉管花粉管生長受抑制生長受抑制而不能進(jìn)入胚珠，而不能進(jìn)入胚珠，其原因是其原因是花柱太長花柱太長或花粉管或花粉管生長緩慢生長緩慢。 受精后的障礙受精后的障礙胚和胚乳之間的胚和胚乳之間的不親和不親和, ,或或胚乳胚乳發(fā)育不良，雜種發(fā)育不成熟。發(fā)育不良，雜種發(fā)育不成熟。第四節(jié)第四節(jié) 植物離體授粉植物離體授粉 （pollination in vitro） 離體授粉離體授粉 將未授粉的將未授粉的胚珠胚珠或或子房子房從母體上分離下來，進(jìn)行無菌培養(yǎng)，從母體上分離下來，進(jìn)行無菌培養(yǎng)

32、， 并以一定的方式授以無菌花粉，使之在試管內(nèi)實現(xiàn)受精的技術(shù)，并以一定的方式授以無菌花粉，使之在試管內(nèi)實現(xiàn)受精的技術(shù)， 所以又稱所以又稱離體受精離體受精（fertilization in vitro）。）。1. 離體離體柱頭柱頭授粉授粉 指通過指通過雌蕊雌蕊的離體培養(yǎng)，使無菌花粉授于的離體培養(yǎng)，使無菌花粉授于柱頭柱頭上，上， 得到含有可育的種子和果實的技術(shù)。得到含有可育的種子和果實的技術(shù)。 是一種接近于自然授粉的試管授精技術(shù)。是一種接近于自然授粉的試管授精技術(shù)。2. 離體離體子房子房授粉授粉 通過人工方法將花粉直接通過人工方法將花粉直接引入子房引入子房， 使花粉粒在使花粉粒在子房腔內(nèi)萌發(fā)子房腔內(nèi)萌發(fā)，并進(jìn)行正常受精，并進(jìn)行正常受精， 最后獲得具有生活力的種子，又稱為最后獲得具有生活力的種子，又稱為子房內(nèi)授粉子房內(nèi)授粉。一、離體授粉的類型一、離體授粉的類型 3 是指離體培養(yǎng)是指離體培養(yǎng)未受精的胚珠未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，并在胚珠上授粉， 最終在試管內(nèi)結(jié)出正常種子的技術(shù)。最終在試管內(nèi)結(jié)出正常種子的技術(shù)。 離體胚珠授粉既可以將胎座上切下的離體胚珠授粉既可以將胎座上切下的單個胚珠單個胚珠（裸露的胚珠）接種在培養(yǎng)（裸露的胚珠）接種在培養(yǎng)基上，然后撒播花粉與胚珠表面，實現(xiàn)受精；基上，然后撒播