Pull down與免疫共沉淀實驗

1、此技術文檔由廣州萊德盟生物實驗服務助手摘自于網絡Pulldown技術的基本原理是將一種蛋白質固定于某種基質上（如Sepharose）,但細胞抽提液經過該基質時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有被吸附的“雜質”則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或洗脫條件而回收下來。通過pulldown技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體外轉錄或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。為了更有效地利用pulldown技術，可以將待純化的蛋白以融合蛋白的形式表達，即將“誘餌”蛋白與一種易于純化的配體蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-轉移酶（G

2、ST）融合標簽從細菌中一步純化出GST融合蛋白。從此GST融合蛋白在蛋白質相互作用研究領域里得到了極大的推廣。GST融合蛋白在經過固定有谷胱甘肽（GSH）的色譜柱時，就可以通過GST與GSH的相互作用而被吸附。當再有細胞抽提物過柱，就可以得到能夠與誘餌”蛋白相互作用的興趣蛋白。一般來說，GST融合蛋白pulldown方法用于兩個方面：一是鑒定能與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質；二是鑒定兩個已知蛋白質之間是否存在相互作用。為排除假陽性所設的一組對照實驗是在沒有誘餌蛋白存在的條件下，將樣品結合到GST上。該對照可以是表達有GST（非誘餌融合蛋白）的分別轉化細胞裂解物，也可以是將GST加到非轉化細

3、胞的裂解物中。設計合適的對照實驗非常重要。該方法比較簡便，避免了使用同位素等危險物質，在蛋白質相互作用研究中有很廣泛的應用。除了GST以外，類似的融合蛋白很多，如與葡萄球菌蛋白A融合的誘餌”蛋白可以通過固定有IgG的色譜柱進行純化；與寡聚組氨酸肽段融合的誘餌”蛋白可以通過結合Ni2+的色譜柱進行純化；與二氫葉酸還原酶融合的誘餌”蛋白可以通過固定有氨甲蝶呤的色譜柱進行純化等等。Pulldown實驗一般用于體外轉錄或翻譯體系，如酵母雙雜交系統(tǒng)中檢測蛋白質之間的相互作用。但并不能真實的反應蛋白質之間的相互作用，因為在體內它們不一定空間上有碰到，所以并不意味著在生理條件下一定結合。免疫共沉淀技術的基本

4、原理是：在非變性條件下裂解細胞，蛋白質之間的相互作用還可以保持。在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結合的結合于Agarose微珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA），若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣的一種復合物：目的蛋白-興趣蛋白-抗興趣蛋白抗體-SPA/Agarose，因為SPA/Agarose比較大，這樣復合物在離心時就被分離出來。經蛋白上樣緩沖液變性煮沸，復合物四組分又被分開。然后經WB試驗，用抗體檢測目的蛋白是什么，是否為預測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的，符合體內實際情況，得到的蛋白可信度高。免疫共沉淀既可以用于檢測已知的兩個蛋白質在體內的相互作用，也可以找出未知的蛋白質相互作用，不管是兩者的哪個，其原則都是一樣的，都需要用特異性的抗體與其中的一種蛋白質結合，之后通過蛋白質A或蛋白質G-瓊脂糖微珠將復合物沉淀下來，然后用WB鑒定。免疫共沉淀中設置正確的對照非常重要，因為該方法可能出現(xiàn)假陽性的概率比較高，設置的對照包括：在對照組中使用對照抗體，以缺失目的蛋白的細胞系作為陰性對照等等。但這種方法也有兩個缺陷:一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，