DNA測(cè)序技術(shù)及展望

1、楊倩倩楊倩倩生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院Tel:Tel: 1 187575643428757564342Email:Email: 第一代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)的展望第一代測(cè)序技術(shù)DNA測(cè)序測(cè)序即即核酸核酸DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項(xiàng)重要的技術(shù)學(xué)一項(xiàng)重要的技術(shù)。生命的奧秘蘊(yùn)藏于 “四字天書(shū)”之中GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGC

2、TTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT第一代第一代DNADNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)： 傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來(lái)的各種礎(chǔ)上發(fā)展來(lái)的各種DNADNA測(cè)序技術(shù)。測(cè)序技術(shù)。 1963年，年，等人第一次完成胰島素等人第一次完成胰島素51個(gè)氨基酸序列個(gè)氨基酸序列測(cè)定測(cè)定 70年代后期，年代后期，和和Maxam-Gilbert等人又建立了等人又建立了Sanger雙脫氧雙脫氧鏈鏈終止法終止法和和Maxam-Gilbert化學(xué)裂化學(xué)裂解法解法第一代第一代DNAD

3、NA測(cè)序技術(shù)包括：測(cè)序技術(shù)包括：化學(xué)降解法化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法、熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)和和雜交測(cè)序技術(shù)雜交測(cè)序技術(shù)?；驹砘驹? : 利用特異的利用特異的選擇性試劑選擇性試劑，專(zhuān)一性的隨機(jī)斷裂，專(zhuān)一性的隨機(jī)斷裂DNADNA成不同長(zhǎng)短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分成不同長(zhǎng)短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷上的區(qū)帶位置，判斷DNADNA片段末端核苷酸的種類(lèi)，從而測(cè)出片段末端核苷酸的種類(lèi)，從而測(cè)出DNADNA的序列。的序列。 將雙鏈將雙鏈DNADNA樣品變?yōu)闃悠纷優(yōu)閱捂渾捂?每個(gè)單鏈的同一

4、方向末端都用放射每個(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素性同位素標(biāo)記標(biāo)記, ,以便顯示以便顯示DNADNA條帶條帶 分別用不同方法處理分別用不同方法處理, ,獲得只差獲得只差一個(gè)核苷酸的一個(gè)核苷酸的降解降解DNADNA群體群體 電泳，電泳，讀讀取取DNADNA的核苷酸順序的核苷酸順序技術(shù)路線技術(shù)路線堿基堿基特異修飾方法特異修飾方法GPh8.0,用用硫酸二甲酯硫酸二甲酯對(duì)對(duì) N7進(jìn)行甲基化進(jìn)行甲基化,使使 C8-C9鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的可使嘌呤環(huán)的N原子化原子化,從而導(dǎo)從而導(dǎo)致脫嘌呤致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的糖苷并

5、因此消弱腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的糖苷鍵鍵C+T肼肼可打開(kāi)嘧啶環(huán)可打開(kāi)嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去除去C1.5mol/L NaCl存在時(shí)存在時(shí),可用可用肼肼除去胞嘧啶除去胞嘧啶Maxam-Gilbert Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技術(shù)法所用的化學(xué)技術(shù) 化學(xué)降解法剛問(wèn)世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易化學(xué)降解法剛問(wèn)世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多為普通研究人員所掌握，因此用得較多。優(yōu)點(diǎn)：即所測(cè)優(yōu)點(diǎn)：即所測(cè)序列來(lái)自序列來(lái)自原原DNA分子分子而不是酶促合而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。缺點(diǎn)：操作

6、過(guò)程較麻煩缺點(diǎn)：操作過(guò)程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡(jiǎn)便快速的漸被簡(jiǎn)便快速的Sanger法所代替。法所代替。 利用利用DNA聚合酶聚合酶和和雙脫氧鏈終止物雙脫氧鏈終止物測(cè)測(cè)定定DNA核苷酸順序的方核苷酸順序的方法，是由英國(guó)劍橋分法，是由英國(guó)劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)家物化學(xué)家F. Sanger等等人于人于1977年發(fā)明的。年發(fā)明的。F. Sanger（19801980年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者）年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者） dideoxy chain-termination method反應(yīng)所需物質(zhì)：反應(yīng)所需物質(zhì)：DNA模板、引物、模板、引物、DNA聚合聚合 酶、酶

7、、dNTP、緩沖液、緩沖液每個(gè)循環(huán)包括：每個(gè)循環(huán)包括：變性（變性（90）、退火（）、退火（54 ）、延伸（）、延伸（72 ） 雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法基本原理：DNA聚合酶不能夠區(qū)分聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和和ddNTP，ddNTP參參入到寡核苷酸鏈的入到寡核苷酸鏈的3-末端，終止末端，終止DNA鏈鏈的增長(zhǎng)的增長(zhǎng)。合成的互補(bǔ)鏈在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，讀取待測(cè)DNA的順序。 讀出模板互讀出模板互補(bǔ)序列補(bǔ)序列dNTP 凝膠電泳凝膠電泳 較大片段較大片段 較小片段較小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物Klenow酶酶 未知序列的單

8、鏈未知序列的單鏈DNA 讀出待測(cè)讀出待測(cè)序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 A C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 Sanger Sanger法因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。法因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNADNA測(cè)序技測(cè)序技術(shù)，其中最重要的是術(shù)，其中最重要的是熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。*熒光自動(dòng)化測(cè)序熒光自動(dòng)化測(cè)序多色熒光標(biāo)記多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 單色熒光標(biāo)記單色熒光標(biāo)記平板電泳平板電泳同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記平板電泳平板電泳A C G TACGT測(cè)

9、序圖譜測(cè)序圖譜T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C Tcomputer analysis凝膠中凝膠中DNA移動(dòng)方向移動(dòng)方向樣品槽樣品槽激光器激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡成象透鏡聚焦透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)高靈敏度相機(jī)旋光鏡旋光鏡/棱鏡組件棱鏡組件DNADNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目前商品化生產(chǎn)的最先進(jìn)測(cè)序儀為目前商品化生產(chǎn)的最先進(jìn)測(cè)序儀為ABI3730測(cè)序儀，最長(zhǎng)可以測(cè)測(cè)序儀，最長(zhǎng)可以測(cè)1200個(gè)堿基個(gè)堿基1、DNA鏈終止法決定了一個(gè)反應(yīng)鏈終止法決定了一個(gè)反應(yīng)所測(cè)序列不能太所測(cè)序列不能太長(zhǎng)長(zhǎng)，目，目前前1000 bp左右。左右。2、測(cè)序反應(yīng)、測(cè)序反應(yīng)費(fèi)

10、時(shí)費(fèi)力費(fèi)時(shí)費(fèi)力 第一個(gè)人類(lèi)基因組測(cè)序花第一個(gè)人類(lèi)基因組測(cè)序花了了13年的時(shí)間，耗費(fèi)了年的時(shí)間，耗費(fèi)了30億美元的費(fèi)用億美元的費(fèi)用。3、測(cè)序、測(cè)序準(zhǔn)確度不高準(zhǔn)確度不高 DNA聚合酶造成的堿基錯(cuò)配，聚合酶造成的堿基錯(cuò)配，DNA序列判讀錯(cuò)誤序列判讀錯(cuò)誤。4、測(cè)序、測(cè)序基于基于PCR反應(yīng)反應(yīng)，需要引物，需要引物，有些些結(jié)構(gòu)復(fù)，有些些結(jié)構(gòu)復(fù)雜雜的難于進(jìn)行的難于進(jìn)行PCR反應(yīng)的片段不能測(cè)序。反應(yīng)的片段不能測(cè)序。 通過(guò)幾十年的逐步改進(jìn)通過(guò)幾十年的逐步改進(jìn), , 第第1 1 代測(cè)序儀的代測(cè)序儀的讀長(zhǎng)可以超過(guò)讀長(zhǎng)可以超過(guò)1000 bp, 1000 bp, 原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)以高達(dá)99.9

11、99%, 99.999%, 測(cè)定每千堿基序列的成本測(cè)定每千堿基序列的成本是是0.5 0.5 美元美元, , 每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到每天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600000 600000 堿基。堿基。第二代測(cè)序技術(shù) 第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過(guò)過(guò)重要的作用，如人類(lèi)基因組計(jì)劃重要的作用，如人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP(HGP) )主要主要基于第一代基于第一代DNADNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)。 隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，人們進(jìn)入的完成，人們進(jìn)入了后基因組時(shí)代，即功能基因組時(shí)代了后基因組時(shí)代，即功能基因組時(shí)代，傳統(tǒng)傳統(tǒng)的測(cè)序方法已經(jīng)不能滿(mǎn)足的測(cè)序方法已經(jīng)

12、不能滿(mǎn)足深度測(cè)序深度測(cè)序和和重復(fù)測(cè)重復(fù)測(cè)序序等大規(guī)?；蚪M測(cè)序等大規(guī)模基因組測(cè)序的需求，這促使的需求，這促使了新了新一代一代DNADNA測(cè)序技術(shù)的誕生。新一代測(cè)序技測(cè)序技術(shù)的誕生。新一代測(cè)序技術(shù)即術(shù)即第二代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)。測(cè)序設(shè)備發(fā)展現(xiàn)狀第一代（穩(wěn)定需求）第一代（穩(wěn)定需求）ABi3130 xL3730 xL3500 xL第三代第三代Helicos BiosciencesHelicos Genetic Analysis System Pacific BiosciencesRSSystem 第二代（高速發(fā)展）第二代（高速發(fā)展）RocheGenome Sequencer FLX System

13、 GS Junior System IlluminaGenome Analyzer IIxMiSeqHiSeq 1000HiSeq 2000Life Technologies (ABi)5500 SOLiD System5500 xL SOLiD SystemIon Torrent PGMDanaherMotionPolonator G.007Complete Genomics無(wú)錫艾吉因生物信息技術(shù)有限公司無(wú)錫艾吉因生物信息技術(shù)有限公司AG-100深圳華因康基因科技有限公司深圳華因康基因科技有限公司Pstar-1中科中科院北京基因組所院北京基因組所/半導(dǎo)體所半導(dǎo)體所BIGIS-1BIGIS-4

14、199020052020Year2015201020001995Mb1000Mb4000ABI373ABI377ABI3130ABI3730ABI3730 xlGA-I GA-IILess Than 5 yrsHiSeq1000/2000Mb4500ABI3700ABI3700 xlSOLiDSOLiD2SOLiD35500 xl SOLiDABI3130 xlGA-IIx5500 SOLiD測(cè)序設(shè)備的壟斷和高速度換代 第二代測(cè)序技術(shù)將第二代測(cè)序技術(shù)將片段化片段化的基因組的基因組DNADNA兩側(cè)連兩側(cè)連上上接頭接頭，隨，隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬(wàn)個(gè)后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬(wàn)個(gè)空間固定空間固定的的

15、PCRPCR克隆陣列克隆陣列。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫(kù)片。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫(kù)片段的多個(gè)段的多個(gè)拷貝組成拷貝組成，然后進(jìn)行然后進(jìn)行引物雜交引物雜交和和酶延伸反應(yīng)酶延伸反應(yīng)。 所有克隆在所有克隆在同一同一平面上，反應(yīng)大規(guī)模平行進(jìn)行，平面上，反應(yīng)大規(guī)模平行進(jìn)行，每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的的熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也的成像檢測(cè)也能同能同時(shí)進(jìn)行，從而獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。時(shí)進(jìn)行，從而獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。 DNADNA序列延伸和成像檢測(cè)序列延伸和成像檢測(cè)不斷重復(fù)，最后經(jīng)不斷重復(fù)，最后經(jīng)計(jì)計(jì)算機(jī)分析算機(jī)分析獲獲得完整的得完整的DNADNA序列。序列。*高通量高通量*準(zhǔn)確度高準(zhǔn)確度高*成本低成本低*覆蓋度高覆蓋度高

16、*產(chǎn)產(chǎn)出出巨大巨大Roche,Roche, 454454 GS FLXGS FLXIllumina,Illumina, Solexa Solexa Genome Genome AnalyzerAnalyzer/ /Hiseq2000Hiseq2000ABI,ABI, SOLiDSOLiD200520062007BirthdayPrinciple焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序Pyrosequencing合成法合成法Sequencing-by-Synthesis連接法連接法Sequencing-by-Ligation2.1 4542.1 454測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù) 原理：在原理：在DNADNA聚合酶聚合酶、AT

17、PATP硫酸化酶硫酸化酶、熒光素酶熒光素酶和和雙磷酸酶雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)的作用下，將每一個(gè)dNTPdNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)DNADNA序列的目的。序列的目的。 1、文庫(kù)制備、文庫(kù)制備：基因組基因組DNA/cDNA片段化處理至片段化處理至300-800bp，經(jīng)末端修復(fù)與特經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA 。2、Emulsion PCR：*單鏈單鏈DNA文庫(kù)被文庫(kù)被固定固定

18、在在DNA捕獲磁珠上，捕獲磁珠上，乳化乳化，形，形成油包水的混合物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反成油包水的混合物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，擴(kuò)增，回收純化回收純化 3、測(cè)序反應(yīng)、測(cè)序反應(yīng)：攜帶攜帶DNA片段的磁珠被放入片段的磁珠被放入PTP板中供測(cè)序反應(yīng)使用。板中供測(cè)序反應(yīng)使用。 4、數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100余萬(wàn)個(gè)讀余萬(wàn)個(gè)讀長(zhǎng)，讀取超過(guò)長(zhǎng)，讀取超過(guò)4-6億個(gè)堿基信息億個(gè)堿基信息 *454技術(shù)的主要技術(shù)的主要缺點(diǎn)缺點(diǎn)是是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度物的長(zhǎng)度。*例如當(dāng)待測(cè)例如當(dāng)待測(cè)

19、序列中出現(xiàn)序列中出現(xiàn)Poly(A)時(shí)，時(shí)，測(cè)序反應(yīng)中會(huì)測(cè)序反應(yīng)中會(huì)一次多加一次多加上一個(gè)上一個(gè)T，而加入，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)推測(cè)，的數(shù)目只能從熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)推測(cè)，有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。因而，。因而，454技術(shù)主要的錯(cuò)誤不是技術(shù)主要的錯(cuò)誤不是來(lái)自核苷酸的替換，而是來(lái)自插入或缺失。來(lái)自核苷酸的替換，而是來(lái)自插入或缺失。*454技術(shù)最大的技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì)在于在于較長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度較長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度，使得后繼的序，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。 454454生命科學(xué)公司在生命科學(xué)公司在20052005年最早推出了第二代年最早推出了第二

20、代測(cè)序平臺(tái)測(cè)序平臺(tái)Genome Sequencer 20Genome Sequencer 20，并測(cè)序了支原，并測(cè)序了支原體體Mycoplasma genitaliumMycoplasma genitalium的基因組；的基因組；20072007年推年推出性能更優(yōu)的第二代基因組測(cè)序系統(tǒng)一出性能更優(yōu)的第二代基因組測(cè)序系統(tǒng)一Genome Genome Sequencer FLX System(Sequencer FLX System(GS FLXGS FLX) )。 羅羅氏在氏在20052005年便與年便與454454公司洽談并購(gòu)事宜，公司洽談并購(gòu)事宜，20072007年完成并購(gòu)，緊接著公布了年完

21、成并購(gòu)，緊接著公布了DNADNA雙螺旋的發(fā)雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一現(xiàn)者之一沃沃森（森（Jim WatsonJim Watson）的個(gè)人基因組）的個(gè)人基因組，測(cè)序總花費(fèi)不到一百萬(wàn)美元。測(cè)序總花費(fèi)不到一百萬(wàn)美元。2.2 2.2 Solexa-IlluminaSolexa-Illumina GenomeGenome AnalyzerAnalyzer 核心技術(shù)核心技術(shù)：“DNADNA簇簇”和和“可逆性末端終止可逆性末端終止”。 原理原理：合成測(cè)序合成測(cè)序，將基因組，將基因組DNADNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃透明的玻璃表面（即表面（即Flow cellFlow cell），），這些

22、這些DNADNA片段經(jīng)過(guò)片段經(jīng)過(guò)延伸延伸和和橋式擴(kuò)增橋式擴(kuò)增后，在后，在Flow cellFlow cell上形成了數(shù)以?xún)|計(jì)上形成了數(shù)以?xún)|計(jì)ClusterCluster，每，每個(gè)個(gè)ClusterCluster是具有數(shù)千份相同模板的是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇單分子簇。 利用帶熒光基團(tuán)利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆可逆性終止性終止的的“邊合成邊測(cè)序邊合成邊測(cè)序”技術(shù)對(duì)待測(cè)技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板的模板DNADNA進(jìn)行測(cè)序。進(jìn)行測(cè)序。 圖圖2. Solexa測(cè)序技術(shù)流程測(cè)序技術(shù)流程*Solexa技術(shù)技術(shù)的的需要的需要的樣品量低至樣品量低至100 100 n

23、gng，文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，的時(shí)間，讀取長(zhǎng)度可以達(dá)讀取長(zhǎng)度可以達(dá)到到275 bp。 *主要的錯(cuò)誤來(lái)源是主要的錯(cuò)誤來(lái)源是核苷核苷酸的替換酸的替換，而不是插入或缺失，目，而不是插入或缺失，目前它的錯(cuò)誤率大約在前它的錯(cuò)誤率大約在1-1.5 %之間。之間。*每個(gè)循環(huán)獲每個(gè)循環(huán)獲得得20.5-25 Gb的測(cè)序結(jié)果，耗時(shí)約的測(cè)序結(jié)果，耗時(shí)約9.5天。天。*在合成中每次只能添加一個(gè)在合成中每次只能添加一個(gè)dNTP，因此很好地解決了同，因此很好地解決了同聚物長(zhǎng)度的準(zhǔn)確測(cè)量問(wèn)題。聚物長(zhǎng)度的準(zhǔn)確測(cè)量問(wèn)題。S Sequencing by equenci

24、ng by O Oligonucleotideligonucleotide LiLigation and gation and DDetectionetection基本原理：基本原理：連接反應(yīng)連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)序，以進(jìn)行測(cè)序，以四色熒光標(biāo)記四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。步驟步驟包括：包括：文庫(kù)準(zhǔn)備文庫(kù)準(zhǔn)備擴(kuò)增擴(kuò)增微珠與玻片連接微珠與玻片連接連接測(cè)序連接測(cè)序2.3 SOLiD2.3 SOLiD測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)圖圖3. SOLiD測(cè)序技術(shù)流程測(cè)序技術(shù)流程*1、SOLiD基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)的構(gòu)建的構(gòu)建 *2、油包水

25、、油包水PCR *3、含、含DNA模板模板P1磁珠的固定磁珠的固定 *4、SOLiD雙堿基編碼原理及測(cè)序流程雙堿基編碼原理及測(cè)序流程 *4、SOLiD雙堿基編碼原理及測(cè)序流程雙堿基編碼原理及測(cè)序流程 5. 數(shù)據(jù)分析原理數(shù)據(jù)分析原理 *SOLiD技術(shù)與技術(shù)與Solexa技術(shù)類(lèi)似，后續(xù)的序列拼接工作也比技術(shù)類(lèi)似，后續(xù)的序列拼接工作也比較復(fù)雜。較復(fù)雜。*SOLiD技術(shù)每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為技術(shù)每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為10-15 Gb，耗時(shí)約為，耗時(shí)約為6-7天。天。*SOLiD技術(shù)每個(gè)循環(huán)可以測(cè)兩個(gè)上樣玻片，讀取長(zhǎng)度可達(dá)技術(shù)每個(gè)循環(huán)可以測(cè)兩個(gè)上樣玻片，讀取長(zhǎng)度可達(dá)250bp，而且由于采用兩堿基測(cè)序，該

26、技術(shù)的準(zhǔn)確率能，而且由于采用兩堿基測(cè)序，該技術(shù)的準(zhǔn)確率能達(dá)到達(dá)到99.94 %以上以上。 超高通量是超高通量是SOLiDSOLiD系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLiD SOLiD 3 3單單次運(yùn)行可產(chǎn)生次運(yùn)行可產(chǎn)生50 GB50 GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于1717倍倍人類(lèi)基因組覆人類(lèi)基因組覆蓋度蓋度。第三代測(cè)序技術(shù) 第三代測(cè)序技術(shù)是以第三代測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的測(cè)序技術(shù)為特點(diǎn)的測(cè)序技術(shù)。生物生物科學(xué)公司科學(xué)公司(BioScience Corporation)(BioScience Corporation)的的HeliScopeHeliScope

27、單單分子測(cè)序儀分子測(cè)序儀(HeliScope SingleMolecular Sequencer(HeliScope SingleMolecular Sequencer) )太平洋太平洋生物科學(xué)公司生物科學(xué)公司(Pacific Biosciences)(Pacific Biosciences)的的單分子實(shí)時(shí)單分子實(shí)時(shí)DNADNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technologysequencing technology 牛津納米孔技術(shù)牛津納米孔技術(shù)

28、公司公司(Oxford Nanopore (Oxford Nanopore TechnologiesLtd)TechnologiesLtd)的的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)納米孔單分子測(cè)序技術(shù)等。等。 目前目前, ,我國(guó)也啟動(dòng)了第三代測(cè)序技術(shù)的研究。我國(guó)也啟動(dòng)了第三代測(cè)序技術(shù)的研究。20092009年年1212月月, ,中科院北京基因組研究所與浪潮成立中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北中科院北京基因組研究所京基因組研究所浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”, ,利用各利用各自的優(yōu)勢(shì)聯(lián)合研發(fā)國(guó)產(chǎn)第三代測(cè)序儀自的優(yōu)勢(shì)聯(lián)合研發(fā)國(guó)產(chǎn)第三代測(cè)序儀, ,第一臺(tái)樣機(jī)預(yù)計(jì)第一臺(tái)樣機(jī)預(yù)計(jì)20132

29、013年問(wèn)世年問(wèn)世, ,屆時(shí)有望緩解測(cè)序儀核心技術(shù)受制于國(guó)外屆時(shí)有望緩解測(cè)序儀核心技術(shù)受制于國(guó)外公司的現(xiàn)狀。公司的現(xiàn)狀。 第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用應(yīng)用, , 但是由于其但是由于其測(cè)序速度、成本、準(zhǔn)確度測(cè)序速度、成本、準(zhǔn)確度等關(guān)鍵問(wèn)題的等關(guān)鍵問(wèn)題的解決仍存在困難解決仍存在困難, ,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測(cè)序解決方案。測(cè)序解決方案。 單分子測(cè)序也就應(yīng)運(yùn)而生。單分子測(cè)序也就應(yīng)運(yùn)而生。第三代測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)非常驚人！非常驚人！1 1、它實(shí)現(xiàn)了、它實(shí)現(xiàn)了DNADNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)

30、速度，聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)一秒可以測(cè)1010個(gè)堿基個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的2 2萬(wàn)倍。萬(wàn)倍。2 2、它實(shí)現(xiàn)了、它實(shí)現(xiàn)了DNADNA聚合酶內(nèi)在自身的聚合酶內(nèi)在自身的processivityprocessivity（延續(xù)性，（延續(xù)性，也就是也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。 二代測(cè)序現(xiàn)在可以測(cè)到上百個(gè)堿基，二代測(cè)序現(xiàn)在可以測(cè)到上百個(gè)堿基，但是三代測(cè)序現(xiàn)在就可以測(cè)幾千個(gè)堿基。這為基因組的重復(fù)但是三代測(cè)序現(xiàn)在就可以測(cè)幾千個(gè)堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼

31、接提供了非常好的條件。序列的拼接提供了非常好的條件。3 3、它的、它的精度非常高精度非常高，達(dá)到，達(dá)到99.9999%99.9999%。4 4、可直接測(cè)、可直接測(cè)RNARNA序列。序列。5 5、可直接測(cè)、可直接測(cè)甲基化的甲基化的DNADNA序列。序列。 2008 2008年年4 4月，月，Helico BioScienceHelico BioScience公司的公司的TimothyTimothy等人在等人在ScienceScience上報(bào)道了他們開(kāi)發(fā)的上報(bào)道了他們開(kāi)發(fā)的真正的單分子測(cè)序真正的單分子測(cè)序技術(shù)技術(shù)，對(duì)一個(gè)對(duì)一個(gè)M13M13病毒基因組進(jìn)病毒基因組進(jìn)行重測(cè)序行重測(cè)序，被稱(chēng)為真被稱(chēng)為真正

32、的單分子測(cè)序，它跨過(guò)正的單分子測(cè)序，它跨過(guò)了前述了前述3 3種高通量測(cè)序依賴(lài)的種高通量測(cè)序依賴(lài)的基于基于PCRPCR擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增的信號(hào)放大過(guò)程，達(dá)到了讀取單個(gè)熒光放大過(guò)程，達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力。分子的能力。 斯坦福大學(xué)的斯坦福大學(xué)的科學(xué)家利用科學(xué)家利用HeliscopeHeliscope單分子測(cè)序儀單分子測(cè)序儀, ,用了用了48 00048 000美元的試劑和美元的試劑和4 4個(gè)星個(gè)星期的時(shí)間，對(duì)期的時(shí)間，對(duì)一名白一名白人男子的基因組進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序的覆蓋度達(dá)人男子的基因組進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序的覆蓋度達(dá)2828倍，倍，覆蓋覆蓋了了90%90%的人類(lèi)參考基因組。序列讀長(zhǎng)的人類(lèi)參考基因組。序

33、列讀長(zhǎng)24-70 bp,24-70 bp,平平均讀長(zhǎng)為均讀長(zhǎng)為32 bp,32 bp,并鑒定出并鑒定出280280萬(wàn)個(gè)萬(wàn)個(gè)SNPSNP位點(diǎn)和位點(diǎn)和752752個(gè)拷個(gè)拷貝數(shù)變異。貝數(shù)變異。3.1 HeliScope3.1 HeliScope單分子測(cè)序儀單分子測(cè)序儀 Pacific bioscience Pacific bioscience 在在ScienceScience上報(bào)道了他們的上報(bào)道了他們的基基于于SMARTSMART技術(shù)的單分子測(cè)序技術(shù)技術(shù)的單分子測(cè)序技術(shù), ,該技術(shù)利用單分子技該技術(shù)利用單分子技術(shù)和術(shù)和DNADNA聚合酶聚合酶, ,在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測(cè)序產(chǎn)在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測(cè)序產(chǎn)物物, ,目前一期的讀取速度為目前一期的讀取速度為3 3 bp/sbp/s, ,但他們聲稱(chēng)在但他們聲稱(chēng)在2013 2013 前實(shí)現(xiàn)三分鐘讀完人類(lèi)基因組。前實(shí)現(xiàn)三分鐘讀完人類(lèi)基因組。PacificPacific技術(shù)目前在研技術(shù)目前在研究大腸桿菌基因組時(shí)的評(píng)價(jià)讀長(zhǎng)為究大腸桿菌基因組時(shí)的評(píng)價(jià)讀長(zhǎng)為586586個(gè)堿基個(gè)堿基, ,有些能有些能達(dá)到達(dá)到28052805堿基堿基, ,新儀器的單個(gè)讀長(zhǎng)已達(dá)新儀器的單個(gè)讀長(zhǎng)已達(dá)1035110351個(gè)堿基個(gè)堿基, ,而且有望實(shí)現(xiàn)更大的讀長(zhǎng)而且有望實(shí)現(xiàn)更大的讀長(zhǎng), ,而且準(zhǔn)確率