實驗8 污水中噬菌體的分離與效價測定

1、實驗七實驗七污水中噬菌體的分離、純化與效污水中噬菌體的分離、純化與效價測定價測定實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康恼莆帐删w分離的基本原理和方法學(xué)會觀察噬菌斑了解噬菌體純化、效價測定方法基本原理噬菌體是專性寄生物，必需寄生細(xì)菌才能繁殖，伴隨細(xì)菌的分布而分布，只要有細(xì)菌的地方，就有噬菌體噬菌體顆?？梢栽诃h(huán)境中獨立存活，但不能繁殖噬菌體對宿主的寄生通常具有特異性溫和噬菌體和烈性噬菌體烈性噬菌體在液體中，可以使渾濁的菌液變?yōu)槌吻辶倚允删w在固體瓊脂平板，可以形成透明的噬菌斑利用噬菌體斑的特征可以分離、純化、效價滴定噬菌斑的形成 在固體瓊脂培養(yǎng)基上，噬菌體感染細(xì)菌后，在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)的生物合成，最后裝配成噬

2、菌體完整的顆粒，通過裂解宿主細(xì)胞釋放出來，使感染的細(xì)菌不能生長，從而形成肉眼可以觀察到的透明或渾濁的空斑，稱為噬菌斑。噬菌體的初次分離將可能含有宿主菌的材料在液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后將液體培養(yǎng)液過濾除菌，濾液備用。將宿主菌涂布在平板表面，自然干燥。取濾液10l滴在平板上，過夜培養(yǎng)，如果有針對該宿主菌的噬菌體，則可以看到透亮的抑菌圈。問題如果采用這種方法，看不到抑菌圈，可以如果采用這種方法，看不到抑菌圈，可以說明的是哪些情況？說明的是哪些情況？如何進(jìn)行噬菌體的純化挑取單一清晰可見的單個噬菌斑，接種液體培養(yǎng)基，并加入相同指示菌，重復(fù)上述從加入氯仿開始的各個試驗步驟，得到噬菌斑重復(fù)多次，可以得到由

3、一個噬菌體的后代形成的噬菌斑，即獲得了純化的噬菌斑。觀測噬菌斑的特征如何測定噬菌體的效價效價指1ml培養(yǎng)液中所含有活的噬菌體的數(shù)量采用雙層瓊脂平板法，進(jìn)行噬菌斑的計數(shù)，計量單位為pfu，即，即plaque forming unit(噬菌斑形成單位）。獲得的噬菌體濾液作10倍的倍比遞減稀釋取每個稀釋度噬菌體0.1ml加入0.9ml的指示菌，混勻后，加入到上層瓊脂，傾注平皿，選擇30300個pfu的平皿計算每毫升未稀釋的噬菌體原液的效價。噬菌體的分離操作程序于100ml 3倍濃縮肉湯加入污水樣本污水樣本200ml和大腸桿菌指示菌2ml 37C培養(yǎng)8小時取上述混懸液5ml接種到20ml的新鮮的LB液

4、體培養(yǎng)基，并加入125ul絲裂霉素絲裂霉素，37 C培養(yǎng)18小時。無菌取上述培養(yǎng)液無菌取上述培養(yǎng)液1ml于于1.5ml Eppendrof管中，加管中，加入入200ul氯仿后振蕩氯仿后振蕩15min，4 C 4000g離心離心20min，上清過濾，取濾液。上清過濾，取濾液。培養(yǎng)指示菌大腸桿菌培養(yǎng)指示菌大腸桿菌MC1061 18小時小時將細(xì)菌涂布在平板培養(yǎng)基表面，然后將濾液滴加到平將細(xì)菌涂布在平板培養(yǎng)基表面，然后將濾液滴加到平板表面，過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。板表面，過夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。肉眼如何判定噬菌體是否已經(jīng)純化？每個初次分離的噬菌斑可能含有多種噬菌每個初次分離的噬菌斑可能含有多種噬菌體，要獲得單

5、一的噬菌體，必需進(jìn)行噬體，要獲得單一的噬菌體，必需進(jìn)行噬菌體的純化。菌體的純化。噬菌體效價的測定（以下開始自己做）噬菌體效價的測定（以下開始自己做）仔細(xì)觀察提供的平皿，選取邊緣清晰的單個噬菌斑仔細(xì)觀察提供的平皿，選取邊緣清晰的單個噬菌斑用滅菌移液器槍頭輕輕挑取噬菌體斑到裝有用滅菌移液器槍頭輕輕挑取噬菌體斑到裝有1ml培養(yǎng)培養(yǎng)液的液的1.5ml Eppendrof管中，管中，震蕩震蕩2-3分鐘分鐘。采用采用1ml 針筒吸取針筒吸取1ml 混合液，于混合液，于0.22um濾膜過濾。濾膜過濾。濾液收集在一個新的無菌濾液收集在一個新的無菌1.5ml Eppendrof管中，管中，獲獲得噬菌體濾液的原液

6、。得噬菌體濾液的原液。每組取7個個1.5ml 的Eppendrof離心管，分別標(biāo)注 10-1-1、10-2-2、 至至 10-7-7。每個每個Eppendrof離心管分別各加900ul LB，從噬菌體濾液中取100ul 于10-1-1離心管中，混勻后混勻后，取100ul 于10-2-2離心管中，依次類推10倍倍比遞減稀釋至-7。（一個移液槍頭用到底）操作程序另取4支支無菌的Eppendrof離心管，分別標(biāo)記10-6 -6 、 10- -5 5、10-4-4、 10-3-3（注意次序）（注意次序），從上述相對應(yīng)的各稀釋管中分別取300ul 噬菌體液，然后各管加300ul 指示菌，37 C溫箱15

7、min。（每組可以使用4個個移液槍頭，注意次序，不能混淆 ）取上層瓊脂，融化并孵育在取上層瓊脂，融化并孵育在48C（已經(jīng)融化），每人（已經(jīng)融化），每人1支，加入上述支，加入上述10-6 -6 、 10-5-5、10-4-4、 10-3-3其中一個稀釋其中一個稀釋度的度的噬菌體與細(xì)菌的混懸液噬菌體與細(xì)菌的混懸液，輕輕混勻，輕輕混勻5min。（。（特別特別注意瓊脂不能離開水浴時間太長，否則瓊脂會凝固，但注意瓊脂不能離開水浴時間太長，否則瓊脂會凝固，但瓊脂不能太燙，不能劇烈振蕩瓊脂不能太燙，不能劇烈振蕩）立即倒入底層瓊脂平板立即倒入底層瓊脂平板，室溫，室溫510分鐘，待上層凝固分鐘，待上層凝固后，將平板倒置，作好標(biāo)記。后，將平板倒置，作好標(biāo)記。37 C 18小時觀察結(jié)果小時觀察結(jié)果記錄噬菌斑的數(shù)量記錄噬菌斑的數(shù)量選擇選擇30300個個pfu的平皿計算每毫升未稀的平皿計算每毫升未稀釋的噬菌體原液的效價。釋的噬菌體原液的效價。與先前的噬菌體裂解液的稀釋度相對應(yīng)，與先前的噬菌體裂解液的稀釋度相對應(yīng)，計算噬菌體的含量計算噬菌體的含量要要 求求星期三星期三(四）四） 12：00觀察結(jié)果觀察結(jié)果描述噬菌斑特征，并計數(shù)描述噬菌斑特征，并計數(shù)（包括噬菌斑的分布