VEGF Ang-1Ang-2及涼血化瘀中藥誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管成熟的實(shí)驗(yàn)研究

1、.二 、對 病 因 病 機(jī) 的認(rèn) 識 .22三 、 辨 證 論 治 .，.23四 、涼 血 化 疲 中藥 方 的 立 方 依 據(jù) 、組 成 、功 效 及 作 用 機(jī) 理 .23( 一 ) 立 方 依 據(jù) .23(二 ) 組 成 .，. .2 4(三 ) 各 藥 物 功 效 及 藥 理 作 用 .24第 二 節(jié) A n g 一1 玻 璃 體 腔 注 射 與 涼 血 化 疲 中藥 灌 胃對 大 鼠實(shí) 驗(yàn) 性 C N V 的 影 響 .，2 7一 、 材 料 與 方 法 .2 7( 一 ) 實(shí) 驗(yàn) 材 料 與 儀 器 .2 7( 二 ) 實(shí) 驗(yàn) 方 法 .2 8( 三 ) 統(tǒng) 計(jì) 方 法 . 2 9

2、二 、 結(jié)果 .2 9( 一 ) C N V 眼 底 彩 照 和 F FA 觀 察 .2 9( 二 ) 視 網(wǎng) 膜 組 織 切 片 H E 染 色 結(jié) 果 .30三 、 討 論 . 31( 一 ) 涼 血 化 疲 中藥 組 方 意 義 及 對 大 鼠 C N V 的影 響 及 作 用 機(jī) 制 .32( 二 ) A n g 一】玻 璃 體 腔 注 射 對 大 鼠 C N V 的 影 響 及 作 用 機(jī) 制 .33 ( 三 ) 玻 璃 體 腔 注 射 A n g一】與 涼 一血北 疲 中藥 灌 胃抑 制 大 鼠 C N V 滲 漏 的 比較 .33 四 、 小 結(jié) .34結(jié)語 . .3 6參 考

3、文 獻(xiàn) .，. 37綜述 .4 2附錄 .，. 50致謝 .61論 文 著 作 .62：v“ F 、而 g一1/l ng一2 及 涼血 化瓣 中藥誘 導(dǎo) 脈 絡(luò) 膜 新 生血 管 成 熟 的 買驗(yàn) 研 兄引言脈 絡(luò) 膜 新 生 血 管 (C ho r o ida l n o eVa se。la r iZa t jon ， C NV ) 與 I垠部 許 多 疾 病 有 關(guān) ， 是 引起 視 力 障 礙 的重 要 原 因之 一 。近 來 關(guān) 于C NV 的研 究 己成 為 熱 點(diǎn) ，但 其 形 成 機(jī) 制 尚 未 闡 明 。 目前 已證 實(shí) ，CNV 是 由多種 可 以產(chǎn) 生 細(xì) 胞 因子 的細(xì)

4、胞 組 成 。許 多CN V 的刺 激 劑 和 抑 制 劑 已被 發(fā) 現(xiàn) ，其 中血 管 生 長 因 子 和 血 管 抑 制 因子 之 間 的 不 平 衡 是 C NV 生 成 的 關(guān) 鍵 啟 動 因 素 。 另 外 ，C NV 的 生 成 還 受 細(xì) 胞 因 子 和 細(xì) 胞 外 基 質(zhì) 之 間 相 互 作 用 的 調(diào) 控 。目前 所 有 的 治療 的 目的 都 在 破 壞 CNV ， 從 而 終 止 滲 出 過 程 。對 C NV 的 治 療 主 要 是 手 術(shù) 和 激 光 療 法 。這 些 療 法 主 要 是 針 對一己生 成 的CNV ，延 緩 其 發(fā) 展 ，并 未 從 根 本 上 去

5、除CNv 的刺 激 因素 ， 因而 不 能 有 效 地 抑 制 血 管 新 生 ， 治療 后 復(fù) 發(fā) 率 高 。另外 基 因 治療 及 藥 物 靶 向 治 療 如 血_管 生 長 因 子 受 體 抑 制 劑 亦 未 取 得 理 想 效 果 ，存 在 著 實(shí) 施 困難 及 需 反 復(fù) 用 藥 、 復(fù) 發(fā) 率 高 等 缺 點(diǎn) 。J自l管 內(nèi)皮 紅+IJ泡生 長 因 子 ( Va SC。lar e 。do the l ja g r ow th fa C 、。r ，V EG F ) 和 促 血 管 生 成 素 (朋 9 1()poi e 、in ，八。g ) 家 族 是 目前 已知的 兩 大 類 促

6、血 管 生 成 的 因 子 ?，F(xiàn) 在 已有 實(shí) 驗(yàn) 證 明V EG F 作 用 于 血_管 形 成 早 期 ，促 進(jìn) 原 始 血_管 網(wǎng) 形 成 。一而A og 一 l 則 作 用 于 隨 后 的 加_管 改 建 、塑 形 ，促 進(jìn) 形 成 成 熟 、有 空 間 結(jié) 構(gòu) 的血_管 網(wǎng) ; 且 具 有 降低 血_管 通 透性 ， 減 少 flI 管 滲 漏 的 作 用 。 因 此 我 們 設(shè) 想 通 過 聯(lián) 合 應(yīng) 用 V 氏 F 與 A ng 一1 以減 少 脈 絡(luò) 膜 新 生 血_管 的 滲 漏 ， 誘 導(dǎo) C N V 成 熟 ，減 少 癱 痕 形 成 ，緩 解 網(wǎng)膜 缺 血缺 氧 ， 減

7、輕 對一視 力 的 損 害 。本 買 驗(yàn) 一部 分 采 用 體 外 培 養(yǎng) 的 尺Liv 托C : ，通 過 盯 !比色 實(shí) 驗(yàn) 觀 察 V 巨G F 、A og一1爪 。g一2 三 利因 子 對 大 鼠臍 靜 脈 內(nèi)皮 細(xì) 胞 增 殖 作 用 的 影 響 ，并 通 過 掃 描 電 鏡 和 透 射 電鏡 分 別 觀 察 在 不 同 因 于 作 用 下 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 表 面 結(jié) 構(gòu) 和 內(nèi)部 超 微 結(jié) 構(gòu) 的 變 化 來 探 討三 種 因 子 誘 導(dǎo) CNV 成 熟 的 機(jī) 制 ; 第 二 部 分 通 過 建 立 激 光 誘 導(dǎo) 的 大 鼠 CN V 模 型 ，觀 察 玻 璃 體 腔 注 射

8、 A 。g一l 及 涼 血 化 疲 中 藥 灌 胃 對 CN V 的 不 同 效 果 ，探 一討他 們 對一C NV 的 抑 制 滲 漏 作 用 機(jī) 制 ， 以 期 對 臨 床 治 療 CN V 有 重 要 的 指 導(dǎo) 意 義 。殲山東 中 醫(yī)藥 大學(xué) 2 0 10 屆 碩 士 學(xué)位 論 文第 一 部 分 V EGF 、A ng一1 及 A ng一2 對 Ruv e s 增 殖 及 超 微 結(jié) 構(gòu) 的 影 響脈 絡(luò) 膜 新 生 血 管 (Chor oi da l n eo vas e u laf i:a t io n ，CN V) 又 稱 視 網(wǎng)膜 下 新 生 血 管 ， 是 來 自脈 絡(luò) 膜

9、 毛 細(xì) 血管 的增 殖 血 管 穿過 Br uch膜 ，在 Br 。Ch膜 與 視 網(wǎng)膜 色 素 上 皮 之 間增 殖 所 成 ，這 種 病 變 多 發(fā) 生 于 黃 斑 視 網(wǎng)膜 神 經(jīng) 上 皮 下 ，造 成 嚴(yán) 重 視 力 損 害 。它 是 年 齡 相 關(guān) 性 黃 斑 變 性 (a ge 一re lat e d m ac 。lar deg e nera t ion ，A MD ) 等 多種 眼 底 疾 病 的 病 理 基 礎(chǔ) ， 其 發(fā) 病 率 高 ，至 今 尚無 有 效 的 治 療 方 法 ， 目 前CNV 的 臨 床 治 療 有 激 光 光 凝 、光 動 力 療 法 、經(jīng) 瞳 孔 溫

10、熱 療 法 、手 術(shù) 剝 離C NV ，黃 斑 轉(zhuǎn) 位 手 術(shù) 及 放 射 治 療 等 ，但 復(fù) 發(fā) 率 高 、 不 可 避 免 損 傷 正 常 眼 組 織 結(jié) 構(gòu) 、加 重 或 誘 發(fā) 玻 璃 體 視 網(wǎng)膜 增 殖 、造 成 視 功 能進(jìn) 一 步 惡 化 等 。因 此 ，尋 求 抑 制 視 網(wǎng)膜 和 脈 絡(luò) 膜 新 生 血 管 生 成 的 藥 物 療 法 ，是 當(dāng) 前眼 科 學(xué) 臨 床 上 急 需 解 決 的一 個 問題 。目 前脈 絡(luò) 膜 新 生 血 管 的 發(fā) 生 確 切 機(jī) 制 尚 不 明 確 ，毛 細(xì) 血 管 主 要 由 內(nèi)皮 細(xì) 胞 組 成 ， 生 理 條 件 下 ，發(fā) 育 成 熟

11、 的 喃 乳 動 物 的 內(nèi)皮 細(xì) 胞 是 靜 _二的 飛。遇 到 適 當(dāng) 的 刺 激 靜 _l_L 的 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 可 降 解 周 圍 的基 底 膜 ，變 形 、增 殖 、遷 移 ，形 成 新 的 管 腔 ，產(chǎn) 生 微 血.管 芽 ?。 但 Br 。ch膜 的 受 損 ，擾 亂 尺”E 細(xì) 胞 外 基 質(zhì) 或 擾 亂 內(nèi)源 性 抑 制 劑 ， 是CN V 生 成 的 重 要 條 件 月。 引起 C Nv 的 原 因 ， 目前認(rèn) 為有 兩 種 可 能 :一 是缺 氧(;r 。nw a ld 1的 實(shí) 驗(yàn) 表 明 ，脈 絡(luò) 膜 的 血_流 減 少 引起 的缺 氧 可 能 是C N V 生 成

12、 的始 動 因素 ;另 一 種 觀 點(diǎn) 是 從 炎 癥 及 AM D 標(biāo) 本 中 發(fā) 現(xiàn) :”r:C h膜 _!二存 在 著 巨 噬 細(xì) 胞 和 異 物 巨細(xì) 胞 幾·、， 認(rèn) 為 由于 炎 癥 或 視 網(wǎng) 膜 色 素 上 皮 爾匹 ) 代 謝 紊 亂 ，吸 引 巨噬 細(xì) 胞 由脈 絡(luò) 膜 穿 過 玻 璃 膜 進(jìn) 人 R !”E 下 ，巨 噬 細(xì) 胞 分 泌 細(xì) 胞 因 子 ， 之匹 細(xì) 胞 和一l感 光 細(xì) 胞 亦 可 分 泌 某 些 細(xì) 胞 因 子 ，從 而 啟 動 了新 生 血 管 生 長 的 過 程 。C 入V 形 成 的 病 理 過 程 很 復(fù) 雜 ，視 網(wǎng)膜 脈 絡(luò) 膜

13、的 彌 漫 缺 氧 、 炎 癥 等 病 理 因 素 導(dǎo)致Br 。C h膜 f內(nèi)損 傷 變 化 ，基 質(zhì) 金 )lvi 蛋 白酶 (。a t: jx m e ta _土o p r():e ina se s，MM 尸s ) 的 活 化 ， 從 而 擾 亂 了 l又l”E 細(xì) 胞 外 基 質(zhì) 或 擾 亂 內(nèi)源 性 抑 制 機(jī) 制 ， 導(dǎo) 致 脈 絡(luò) 膜 血_管 擴(kuò)一張 、 血 管 通 透 性 增 力_、 周 圍基 質(zhì) 降 解 i丁， 接 著 脈 絡(luò) 膜 血一管 內(nèi)皮 細(xì) 胞 (va sc。a r e n do th e 州 a j Ce JI ， V EC ) 活 化 、移 行 、增 生 、 出 芽

14、 生 長 并 形 成 毛 細(xì) 血 管 腔 ，最 后 新 生 血 管 成 熟 、 重 塑 構(gòu) 成 血 管 網(wǎng) i呂:。在 新 生 血管 形 成 中 ，很 多 細(xì) 胞 因 子 、細(xì) 胞 都 參 與 了這 個 過 程 。其 中促 新 生 血_管 生 成 的 細(xì) 胞 因 子 有 血_管 內(nèi)皮 生 長 因 子 (va scu la r endo th e l ial gr ow t 日fa c 、o r ，V 氏 F ) 、 成 纖 維 細(xì) 胞 生 長 因 子 ( _fib r ob la s t g r ow t h fa c t o r ， F G I=) 、 轉(zhuǎn) 化生 長 l玉】子 (t: a 。

15、S fo:m in g gr ow t卜fac to r ，T G I了) 、 )咦 島 素 樣 生 長 因 子 ( j。s。1 in 一1 1k evEc F 、A:19一1/A ng一2 及 涼血 化瓣 中藥誘 導(dǎo) 脈 落 膜 新 生血 管 成 熟 的 實(shí)驗(yàn) 研 兄g row th fa C tor ， JG I了) 、 結(jié) 締 組 織 生 長 因 子 (eo n n e e t iv e 、js su e g r ow thfa C 、Or ，CT G F) 、 胎 盤 生 長 I玉1子 (p la e e n ta l gr ow th fa e to r ，尸L (;l了) 、 J爪

16、小 板 衍 生 生 一長因 子 (p la te le t d er ive d grow th fa C t。r ，PDG F) 不一肝 細(xì) 胞 生 長 因 子 ( h ep a to e y t egr 0W th fa ct or ，HG I:) 等 ，均 能 在 體 外 調(diào) 節(jié) 內(nèi)皮 細(xì) 胞 反 應(yīng) 。 同 時 ，_血 管 生 成 抑 制 因 子 主 要 有 色 素 上 皮 細(xì) 胞 衍 生 1引子 (p igm e 。、 ep ith i l i。m一d er iv e d fa e to r ，p EDF ) 、 J位管 抑 素 (an g i。Sta t in ， AS ) 、 內(nèi)

17、皮 抑 素 (en d0 Stat in ， ES) 等 。這 兩 類 相 互 制 約 的調(diào) 節(jié) 劑 ，正 常 情 況 下 他 們 處 于 動 態(tài) 平 衡 狀 態(tài) ，一 旦 受 到 致 病 動 因 刺 激 時 ，導(dǎo) 致 兩 者 之 間 的動 態(tài) 平 衡 失 調(diào) ， 當(dāng)生 成 因 素 超 過 抑 制 因素 時 將 產(chǎn) 生 新 生 血.管 。促 血 管 生 成 的細(xì) 胞 因子 主 要 有 兩 大 類 : 血_管 內(nèi)皮 生 長 因子 (VE G F) 和 促 血 管 生 成 素 (an g ioP O ie t in ，An g ) 家 族 ，_且特 異 作 用 于 血 管 內(nèi)皮 細(xì) 胞 ?，F(xiàn) 在

18、的研 究 多 在 于 通 過 多 種 手 段 ，來 阻 斷 和 / 或 抑 制 其 生 物 學(xué) 過 程 的 不 同 環(huán) 節(jié) ， 而 達(dá) 到 控 制 或 消 滅 C NV 的 目的 ，如 V EG 或 其 受 體 抑 制 劑 或 轉(zhuǎn) 基 因 治 療 ， 以抑 制 新 生 血 管 的 生 成 ，但 其 是 針 對 己生 成 的 C NV ，治 療 效 果 不 甚 顯 著 ，沒 從 根 本 上得 到 解 決 。CN V 形 成 后 ，由 于管 壁 的 通 透 性 高 于 正 常 血_管 ，極 易 引 起 出血_和 滲 出，繼 而 可 形 成 癱 痕 ，造 成 黃 功 部 損 傷 ，嚴(yán) 重 影 響 中

19、 心 視 力 ，甚 至 致 一盲 。，l改我 們 設(shè) 想 通 過 誘 導(dǎo) 即 己形 成 的 CN V 發(fā) 育 成 熟 以達(dá) 到 治 療 目 的 : 一 旦 新 生 血_管 成 熟 ，一方 而 缺 血_缺 氧 等 問 題 解 決 了 ， 另 一方 面 血 管 通 透 性 減 小 ， 呂們角.、滲 出 減 少 ，對 視 功 能 的 損 傷 也 就 降低 ，可 以達(dá) 到 很 好 的 治 療 效 果 。目 前有 研 究 認(rèn) 為 A ng 及 受 體 rri eZ 在 血 管 新 生 過 程 中 對 新 生 血 管 的 形 成 、 重 塑 、 成 熟 等 發(fā) 揮 重 要 的 一調(diào)節(jié) 作 用 。VII G

20、 廠 與 A 門g 作 用 于 不 同 的 環(huán) 節(jié) ，而 且 在 很 多 方 面 八n g 可 以 彌 補(bǔ) VI三;F 的 不 足 ，如 維 持 新 生 血 管 的 亢 整 性 與 穩(wěn) 定 性 ，防 止 炎 癥 與 1111 管 通 透 性 的 增 力!_!等 ，因 此 兩 者 的 聯(lián) 合 使 用 對 于 誘 導(dǎo) C / 成 熟 提 供 新 的 策 略 ，具 有 很 好 的 指 導(dǎo) 意 義 。第 一 節(jié) M T丁法 檢 測 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 增 殖 實(shí) 驗(yàn)在 血 管 生 成 過 程 中 ， _!fll.管 內(nèi)皮 細(xì) 胞 增 殖 是 血 管 發(fā) 生 的 最 基 本 和 最 重 要 的 環(huán) 節(jié) 卜門

21、。故 木 實(shí) 驗(yàn) 我 們 通 過 聯(lián) 合 應(yīng) 用 V l:G F 、A :g一l八 。g一2這 三 種 因 子 ，作 用 于 體 外 培 養(yǎng) 的尺U V C s ，通 過 觀 察 對 大 鼠臍 靜 脈 內(nèi)皮 細(xì) 胞 的 增 殖 作 用 ， 來 探 討 V 氏 F 與 A 。g 聯(lián) 合 應(yīng) 用 對 細(xì) 胞 活 性 的 影 響 ， 及 他 們 相 互 作 用 的 最 佳 劑 量 配 比 ， 為 臨 床 治 療 C NV 提 供 實(shí) 驗(yàn) 依 據(jù) 。用 唾 吟 藍(lán) 實(shí) 驗(yàn) (M 下T 法 ) 檢 測 內(nèi)皮 細(xì) 胞 增 殖 具 有 方 法 簡 單 、 快 速 的 優(yōu) 點(diǎn) 。廠山 東 中 醫(yī)藥 大 學(xué) 2

22、0 10 屆 碩 士 學(xué)位 論 文一 、 材 料 與 方 法(一 ) 材 料1. 細(xì) 胞 株 及 培 養(yǎng) 大 鼠臍 靜 脈 內(nèi)皮 細(xì) 胞 株 (RUV ECs ) 購 自上 海 拜 力 生 物 科 技 有 限 公 司 。將 RUV EC 細(xì) 胞 用 含 有 10 % 胎 牛 血 清 的DM EM 培養(yǎng) 液 ，于 3 7 、5 % C02 的培 養(yǎng) 箱 中培 養(yǎng) ，每 2 一 3d 傳 代 1 次，取 對 數(shù) 生 長 期 細(xì) 胞 用 于 實(shí) 驗(yàn) 。2 ， 主 要 試 劑DM EM 高 糖 型 培 養(yǎng) 基美 國 H y C lo n e 公 司 胎 牛 血_清杭 州 四 季 青 生 物 工 程 有

23、 限 公 司胰 蛋 白酶 凍 干 粉 (不 含 E DTA)美 國 Si gm a 公 司 ; 1邃一峰藍(lán) (M l、T )美 I國 G e nV iew 公 司二 甲基 亞 颯 (DM S O)美 國51 gm a 公 司內(nèi)皮 細(xì) 胞 生 長 因子 (VEG 助 美 國服 D 公 司 促 血 管 生 成 素 一1 (A ng 一l) 美 國 R& D 公 司 促 血 管 生 成 素 一2 (A og 一2) 美 國 R& D 公 司 3 .主 要 實(shí) 驗(yàn) 儀 器超 凈 工 作 臺蘇 州 蘇 凈 集 團(tuán) 女 泰 公 司二 氧 化 碳 孵 育箱德 國 仆 erm o 公 司自動

24、酶 標(biāo) 儀瑞 士 物 C。 公 司倒 置 相 差 顯 微 鏡卜本 01 lm p u : C KZ 型9 6 孔 培 養(yǎng) 板德 國 份 e iner 公 司 ( 二 ) 方 法l.M T 丁 比色 法 的 原 理 、方 法 及 特 點(diǎn)基 本 原 理 :MI T 即 澳 化 3一扭，5一二 甲基 咪 啤一2) 一2 ，5一二 苯 基 四 氮 峰 ，簡 稱 四 吐 鹽 ， 又 名 曝 l峽藍(lán) 。M T f 產(chǎn) 品 為 淡 黃 色 粉 木 ， 易 被 水 溶 解 和 透 過 細(xì) 胞 膜 而 進(jìn) 入 細(xì) 胞 內(nèi) 。可 被 活 細(xì) 胞 內(nèi) 的 玻 拍 酸 脫 氫 酶 還 原 ， 形 成 不 溶 于 水

25、的 藍(lán) 紫 色 甲 月 橋 (l了。 a Za 耐 結(jié) 晶 。 該 結(jié) 晶 可 溶 于 酸 性 異 丙 醇 、二 甲亞 礬 、SO D 等 有 機(jī) 溶 劑 中 ， 通 過 多 孔 掃 描 分 光 光 度 計(jì) 依 顏 色 深 淺 一可測 定 出各 吸 光 度 值 。 由 于結(jié) 晶物 形 成 的 量 與 細(xì) 胞 數(shù) 量 及 代 謝 活 性 成 比例 ， 因 此 吸 光 度 (A) 值 的 大 小 可 反 映 細(xì) 胞 的 數(shù) 量 及 活 性 。在 本 文 中 ， 我 們 選 用 !)M S O 為 溶 劑 ，不 但 解 決 了 蛋 白沉 淀 問題 ， 且 可 縮 短 溶 解 時 間 ，vEC F 、

26、A llg一1/A llg一2 及 涼血 化 擠 中 藥誘 導(dǎo) 脈 絡(luò) 膜 新 生血 管 成 熟 的 買驗(yàn) 研 兄溶 液 澄 清 ， 大 大 提 高 了M TT 法 的 靈 敏 性 。D MSO 不 需 配 制 ， 可 直 接 使 用 原 液 ， 方 便 快 速 。2 . 細(xì) 胞 培 養(yǎng)將 IU VI工S細(xì) 胞 株 置 于 含 10WO 熱 滅 活 胎 牛 血 清 ( !了B 幼 的 DM EM 高 糖 培 養(yǎng) 液 ，于 3 7 、 5% 二 氧 化 碳 的培 養(yǎng) 箱 中培 養(yǎng) ，約 2 一 3d 傳 代 l 次 。 倒 置 相 差 顯 微 鏡 下 見 尺UV EC S細(xì) 胞 貼 壁 生 長

27、，生 長 狀 態(tài) 良好 ，呈 鋪 路 石 樣 ，無 細(xì) 胞 重 疊 ，有 接 觸 抑 制 現(xiàn) 象 ( 見 圖一5 ，6 )， 當(dāng) 細(xì) 胞 鋪 滿 細(xì) 胞 瓶 壁 約 80 % 一 90 % 時 ，進(jìn) 行 細(xì) 胞 傳 代 。 具 體 如 下 :( l) 將 培 養(yǎng) 瓶 內(nèi)培 養(yǎng) 液 倒 掉 ，用 吸 管 將 瓶 內(nèi)剩 余 培 養(yǎng) 液 吸 出 ;(2) 咫 S 液 沖 洗 兩 遍 ，加 入 0 .25 % 胰 蛋 白酶 消 化 液 約 3ml ，以鋪 滿 瓶 壁 為 準(zhǔn) ， 再 放 入 培 養(yǎng) 箱 內(nèi) ，消 化 約 1一 Zmi n ;(3 ) 倒 置 相 差 顯 微 鏡 下 見 : 細(xì) 胞 回縮

28、 、變 圓 ，細(xì) 胞 間 隙 增 寬 ，數(shù) 目變 多 ，終 止 消化 ;(4 ) 倒 掉 胰 酶 ，并 用 吸 管 吸 凈 ，加 入 3耐 DM 巨M 高 糖 培 養(yǎng) 液 ，用 吸 管 反 復(fù) 吹 打 瓶 壁 ， 倒 置 相 差 顯 微 鏡 下 見 : 細(xì) 胞 無 貼 壁 ，呈 團(tuán)塊 狀 或 單 個 漂 浮 于 培 養(yǎng) 液 中 :(5 ) 將 液 體 移 入 離 心 管 內(nèi) ，離 心 : 2 00 轉(zhuǎn) /m in ， 100 1。;(6 ) 離 心 后 ，見 離 心 管 底 部 灰 白色 細(xì) 胞 團(tuán) 塊 ，用 吸 管 小 創(chuàng)吸棄 上 清 液 ; ( 7) 加 入 3【。1 I)M EM 高 糖

29、 培 養(yǎng) 液 ，反 復(fù) 吹 掃一至 細(xì) 胞 混 懸 液 ;(8 ) 將 液 體 分 別 移 入 3 個 培 養(yǎng) )板內(nèi) ，再 將 每 個 培 養(yǎng) )阪內(nèi)加 入 含 l()% 日3污的 DMI姻 高 糖 培 養(yǎng) 液 理rn ，放 入 3 7 OC 、5 % C ()2 的 培 養(yǎng) 箱 中繼 續(xù) 培 養(yǎng) ;(9 ) 細(xì) )飽一i一數(shù) : )一20 。 的微 量 加 樣 器 槍 頭 自第 月步 中 的 培 養(yǎng) 瓶 內(nèi)取 出 2 0。l， 沿 細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) 器 的邊 緣 輕 輕 打一入 液 體 ，勿 吹 起 氣 泡 ，在 倒 置 相 差 顯微 鏡 卜計(jì)數(shù) : 共 四 個 象 限 ，取 平 均 值 ，

30、 即 細(xì) 胞 數(shù) 目 (個 /耐 ) = 每 個 象 限 的 細(xì) 胞 數(shù) 目相 力l_之 和 門 x lo 個 /f:l1 。( JO ) 按 需 調(diào)整 細(xì) 胞 密 度 ，接 種 于 9 6 孔 板 用 于 實(shí) 驗(yàn) 。3 . 溶 液 配 制( 1 ) Ml飛T 溶 液 (sm g/ m1 )取 25 0m g Mrl、T 力L入 5 0 耐 0 .o lhl 尸I3S 溶 液 中 ， 攪 拌 30 m i。， 充 分 混 勻 后 ， 超 凈臺 內(nèi)用 0 .2 2 抖m 微 孔 濾 膜 除 菌 ，4 冰 箱 保 存 備 用 。( 2 ) 0 .2 5ry0)咦酶 消 化 液將 胰 蛋 白酶 干

31、粉 1.25 9 加 入 50 0ml )BS 溶 液 內(nèi) ，混 勻 充 分 溶 解 后 ，超 凈 臺 內(nèi) 0 .2 2p : 微 孔 濾 膜 除 菌 ，4 冰 箱 保 存 備 用 。鄉(xiāng)山 東中 醫(yī)藥 大學(xué) 20 10 屆碩 士 學(xué)位 論 文召. 實(shí) 驗(yàn) 分 組( 1) v EG 對 尺U v EC S 增 殖 的 影 響 及 濃 度 初 步 篩 選實(shí) 驗(yàn) 共 分 7 組第 l 組 即 空 白對 照 組 ， 不 加 任 何 藥 物 刺 激 的 細(xì) 胞 ;第 2 組 為極 低 濃 度 組 ， 即 VEG F 0.sng/ml ;第 3 組 為 低 濃 度 組 ， 即 V l二G F ing/m

32、l ; 第 召組 為 中濃 度 組， 即 V EG F 2 .sng/m l : 第 5 組 為對 照 濃 度 組 ， 即 V EG F sn g/m l ; 第 6 組 為 高 濃 度 組 ， 即 V EG F SO ng /耐 ;第 7 組 為 極 高 濃 度 組 ， 即 V l三G F 1O O ng/m l 。以上 各 組均 設(shè) 6 個 復(fù) 孔 。(2) VE G F 濃 度 的進(jìn) 一 步 確 定 篩 選實(shí) 驗(yàn) 共 分 硯組第 l組 即 空 白對 照 對 照 組 ，不 加 任 何 因 子 刺 激 的 細(xì) 胞 :第 2 組 為低 濃 度 組 ，即城 G F 5 09/rn ; 第 3 組

33、 為 中濃 度 組 ， 即 V EC F 1O ng /m l ;第 召組 為 高 濃 度 組 ， 即vI三(iF Z O ng/m1 。 以 _二各 組 均 設(shè) 6 個 復(fù) 孔 。( 3 ) A NG 一l協(xié) M 卜2 不 同濃 度 對 剛 V I三C S 增 殖 的影 響 及 濃 度 初 步 篩 選 實(shí) 驗(yàn) 共 分 11 組第 l 組 即 空 自對 照 組 ， 不 )Jl_I任 何 因 子 刺 激 的 細(xì) 胞 ; 第 2 組 為 A ng一l 極 高 濃 度 組 ， 即 A ng一1 1O On g/m l ; 第 3 組 為 A og一l 高濃 度 組 ， 即 A ng 一1 !o ng

34、/耐 ;第 組 為 A og一l 中濃 度 組 ， 即 A ng一1 ng/耐 ;第 5 組 為 A ng一l 低 濃 度 組 ， 即 A ng一 0 . 1ng /m l :第 6 組 為 A ng一l 極 低 濃 度 組 ， 即 A o g一1 0.01 ng/耐 ; 第 7 組 為 A og一2 極 高 濃 度 組 ， 即 A n g一2 IO 0 ng /耐 ; 第 8 組 為 A og一2 高濃 度 組 ， 即 A n g一2 1o ng/m1 ;第 9 組 為 A ng一2 1二，濃 度 組 ， 即 A n g一2 2ng /m l ;vEGF 、A ng一1/ ，19一2 及 涼

35、血 化 疥 中藥誘 導(dǎo) 脈 絡(luò) 膜 新 生血 管 成 熟 的 買驗(yàn) 研 兄第 10 組 為 A ng 一2 低 濃 度 組 ， 即 An g一20 . 1。g /耐 ;第 11 組 為 An g一2 極 低 濃 度 組 ， 即 A ng一20 .0 1ng /ml 。 每 組 6 個 復(fù) 孔(的 三 種 因子 不 同濃 度 配 比對 l刊VEC 、增 殖 的 影 響 實(shí) 驗(yàn) 分 為 l紐組 ，第 1組 : 空 白對 照 組 ， 即 不 加 任 何 因 子 刺 激 的 細(xì) 胞 ; 第 2 組 : v EG F sng/ m l ;第 3組 : A ng一1 10 n g/rnl ; 第 紐組 :

36、 A ng 一2 10 ng/m l ;第 5組 : V EG I了+A 。g一1 1: l ( 即V l三G l了sng/m +A n g一1 1On g /m ); 第 6 組 : V I三G 了十A ng 一1 2 : 2 ( 即v EG I了sn g/ m l +A ng一1 ZO n g/ m l ); 第 7組 : V EG I了+A ng 一1 1: 4 ( 即 V 巨(;I了sn g /m +A n g一l O ng /m ); 第 8 組 : VEG I了+A ng一1 2 : 1 ( 即 V 三(;F IO ng/m l+A og 一1 zo ng / rnl ); 第 9

37、 全且: VEG I，+A n g 一2 1: l ( 即 V l二G l一戶s n g/ m l 卜A n g一2 1O ng / m 王); 第 1()鄉(xiāng)l井: v E(;了+A n g一2 1 : 2 ( 即V I三(;F s ng /耐 + A ng一2 ZO ng / m );第 IJ組 : V EG I了+A n只一2 2 : x ( 即 v l三(;l了10 0 9/m _l+A og一2 10 0 9 /m );第 12 組 : VI三(;了+A n 拜一l+A 。g一2 1 : 1: l ( 即 VI二G I了sng /rn_l+ A 。g 一1 10 。g/rnl +A 。

38、g 一21O n g / m l ) ;第 l:;夕_I_: V I二(;I了+A ng 一l+ A 。耳一2 1 : 2 : 1 ( 即 V I三C l了s ng /!:+ A 。g 一1 ZO ng /rnl +A :g 一2l()n g / rnl ) ;第 川全I(xiàn)_:A n g一x+A ng一2 1 : z ( 即A ng一1 1O ng / : l + A ng一2 2()。g / : l )。 以上 各 組 均 設(shè) 5 個 復(fù) 孔 。5 . 細(xì) 胞 形 態(tài) 觀 察用 倒 置 相 差 顯 微 鏡 觀 察 各 組 R U V EC 的 生 長 情 況 和 按 照 第 的 步 實(shí) 驗(yàn) 分

39、 組 加 入 細(xì) 胞因子 后 培 養(yǎng) 2 4 小 時 后 的 形 態(tài) 變 化 ，并 拍 照 。6 . M fT 比色 法 測 定 細(xì) 胞 0 1) 值取 對 數(shù) 生 長 期 的 尺UV EC ， 用 0 .2 5ryo)J夷酶 消 化 并 收 集 細(xì) 胞 ，以l)M EM 高 糖 培 養(yǎng) 液 (含 10% !了B S ) 制 成 細(xì) 胞 懸 液 ，細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) ，調(diào) 整 細(xì) 胞 密 度 為 l 火 10幾個 /耐 ，接 種 于 96 孔 培 養(yǎng) 板 中 ，每 孔 2()0 件Jo 將 培 養(yǎng) 板 置 于 3 7 含 5 % C 02 的 培 養(yǎng) 箱 中 孵 育 2 如 ，7山 東中 醫(yī)藥 大

40、 學(xué) 20 1 0 屆碩 士 學(xué)位論 文觀 察 細(xì) 胞 貼 壁 良好 后 ，按 照 前面 分 組 所 示 分 別 加 入 不 同濃 度 的VE GI: 細(xì) 胞 I引子 ，空 白對 照 組 更 換 新 鮮 培 養(yǎng) 液 。繼 續(xù) 放 入 培 養(yǎng) 箱 培 養(yǎng) 24 h后 ，每 孔 加 入 smg/m1 的MTT 溶 液 20 0 1， 37 OC 孵 育 如 ， 然 后 吸 棄 各 孔 中 的液 體 ，加 入 DMSO 150 p l /孔 ，振 蕩 混 勻 ，室溫 放 置 IOmi 。，使 結(jié) 品充 分 溶 解 并 混 勻 ，于全 自動 酶 標(biāo) 儀 49 Onm 測 定 各 組 吸 光 度 值 (

41、即0D 值 )，繪 制 細(xì) 胞增 殖 曲線 。(三 ) 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 方 法統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 分析 : 用 S 尸55 13. 0 軟件 處 理系 統(tǒng)進(jìn) 行 統(tǒng)計(jì) 學(xué)分 析 ，實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù) 以均 數(shù) 士標(biāo)準(zhǔn) 差 ( x士 s 夕 表 示 ，采 用 z 檢 驗(yàn) 。結(jié) 果( 一 ) 細(xì) 胞 因子 對 R U V E C 顯 微 形 態(tài) 的 影 響倒 置 相 差 顯 微 鏡 下 發(fā)現(xiàn) 培養(yǎng) 48h 后 ，在 上 述 濃 度 范 圍 內(nèi)v EG F組 、v 巨G I了+A 。g一1組 、 V 巨G F+ A 。g一2 組 和 Vl二G F+ A n g一卜 A ng一2 各 組 均 較 空 白組 、A 。g一l

42、組 、A 門g一2 組 及 A ng一卜 An g- 2 組 各 組 細(xì) 胞 數(shù) 量 多 ，說 明VIi (;F組 、V EG F+ A og一1組 、V EG F十A 。g一2 組 和 v l三G l:+ A 。g一卜 A n g 一2 組 細(xì) 胞 分 裂 旺 盛 ， 具 有 明 顯 的 促 進(jìn) 細(xì) 胞 生 長 作 用 。 細(xì) 胞 形 態(tài) 上 在 倒 置 相 差 顯 微 鏡 下 未 見 明顯 異 常 : 細(xì) 胞 生長狀 態(tài) 良好 ，貼 壁 較 牢 ，細(xì) 胞 間連 接 緊 密 ; 細(xì) 胞 呈 多 角形 或 短 梭 形 ，邊 界 清 楚 ，大 小 均 勻 ，呈 單 層 鋪 路 石 樣 鑲 嵌 排

43、 列 ; 胞 核 圓 形 或 橢 圓 形 ，多 位 于 細(xì) 胞 中 央 ，多 核 仁 : 胞 漿 豐 富 ，內(nèi)含 小 顆 粒 位!一!圖 1一圖8)鄉(xiāng)了示 ) 。( _:-) M T T 法 測 得 各 組 O D 值l.v 叮 F 對 R七v氏 S 增 殖 的影 響及 濃 度 初 步 篩選此 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 中 ，MT下法 證 實(shí) 血 管 內(nèi)皮 細(xì) 胞 生 長 因子 作用 于 I禮Vl工: ，具 有 促 進(jìn) 細(xì) 胞 增 殖 作 用 ，且 在 一 定 范 圍 內(nèi)促 增 殖 效 應(yīng) 隨 V I三C F 濃 度 升 高 而 增 大 (濃 度 <50 。g / m l一) ， 見 表 一1 。

44、劑 量 進(jìn) 一 步 增 大 到 5() ng /m l二!付 ，促 增 殖 效 應(yīng) 反 而 下 降 。根 據(jù) 各 組 0D 值 均 數(shù) ， 繪 制 細(xì) 胞 增 殖 曲線 ， 見 圖一9v EG F 、A ng一1/Ang一2 及 涼血 化 癖 中藥誘 導(dǎo)脈 絡(luò)膜 新 生血 管 成 熟 的 實(shí)驗(yàn) 研 究一一圖一gV G 對 RUV cs 增 殖 的 影 響 及 濃 度 初 步 篩 選 2.V EG F 濃 度 的進(jìn) 一 步 確 定 篩 選如 表 一2 所 示 : 在 此 范 圍 內(nèi) 的 各 濃 度 VI (;F 對 RUVEC 增 殖 均 有 促 進(jìn) 作 用 ，并 且 這 種促 進(jìn) 作 用 隨

45、VE (;I了濃 度 增 加 而 遞 增 。各濃 度 組 0D 值 與 空 白對 照 組 比較 ，均 有 極 顯 著 性 差 異 (以 0 .05 ) ，見 表 一2 。 因此 ，我 們 選 取 sn g/ml VE 邵 進(jìn) 行 下 一步 實(shí)驗(yàn) 。根 據(jù) 各 組 ()I) 值 均 數(shù) ，繪 制 細(xì) 胞 增 殖 曲線 ， 見 圖一10 。一圖一10v G 濃 度 的進(jìn) 一 步 確 定 篩 選 3.A N(卜1/A N G 一2 不 同濃 度 對 IU v EC S 增 殖 的 影 響 及 濃 度 初 步 篩 選由 圖 可 以看 出 單獨(dú) 的 A n g- 1 或 A 。g一2 并 不 促 進(jìn) 體

46、 外 培 養(yǎng) 的 R 曰 I匯S 的增 殖 ，其 O D值 與空 白對 照 組 相 比 沒 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 (I) >0 .05 ) ， 見 表 一3 。但 當(dāng)濃 度 增 大 到 10 0 ng /m1 時 反 而 抑 制 增 殖 ， 為 此 我 們 均 選 擇 中 間 濃 度 10 ng /ml 進(jìn) 行 下一 步 實(shí) 驗(yàn) 。 根 據(jù) 各 組 O D 值 均 數(shù) ， 繪 制 細(xì) 胞 增 殖 曲線 見 圖 一1 1 。山東中醫(yī)藥 大學(xué) 201。屆碩 士學(xué)位論 文一牛圖 一11 ， 1AN G一 不 同 濃 度 對 RUVCs增 殖 的 影 響 及 濃 度 初 步 篩 選一圖一11

47、，2ANG一2 不 同濃 度 對 Ruv c s增 殖 的影 響 及 濃 度 初 步 篩 選 4.三 種 因 子 不 同濃 度 配 比對 RUVEC S增 殖 的 影 響與空 白組 相 比 ，v E(;F+ A ng 一l (l :l) 、V E(;:+A 。g 一l (l :2 ) 、V l三(;F + A ng一l (l :4 ) 、V EG F+A n g 一l (2 :l) 、V EG F + A ng一2 (l :l) 、V E(;F+ A ng一2 (l :2 ) 、V EG F+ A ng 一2 (2 :l) 、V E(;F+ A n g一l+ A ng 一2 (l :l :x)

48、 、v E(;F+ A ng一l+ A ng一2 (l :2 :l) 、VEG F5ng/m l 各 組 0 0 值 均 有 統(tǒng) 計(jì)學(xué) 意 義 (P <0 .0 5 ) 。 而 A ng一l+ A ng一2 (l :l) 、A N(;1 10 ng/m l 與 A ng 一2 10ng /m l 各 組 與 空 白 組 相 比均 沒 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 (P>0 .05 ) ，見 表一4 。據(jù) 此 我 們 篩 選 出最 佳 濃 度 配 比 ( 即 使 用 最 小 的 劑 量 得 到 最 佳 效 果 ) 為 VE G F : A ng 一l 為 l :2 。根 據(jù) 各 組 O D

49、 值 均 數(shù) ，繪 制 細(xì) 胞 增 殖 曲線 ，如 圖一12 所 示 。v EG F 、A ng -l/ Ang一2 及 涼血 化 瘍 中藥誘 導(dǎo) 脈 絡(luò)膜 新 生血 管 成 熟 的 實(shí)驗(yàn) 研 究圖一12三 種 因 子 不 同濃 度 配 比對 RUV EC S增 殖 的 影 響三 、 討 論(一 ) 選 擇 R U V E C 作 為 C N V 研 究 的優(yōu) 越 性血 管 新 生 是 從 現(xiàn) 有 的血 管 長 出毛 細(xì) 血 管 芽 的過 程 )，毛 細(xì) 血 管 主 要 由 內(nèi)皮 細(xì) 胞 組 成 ，在 生 理 條 件 下，發(fā) 育 成 熟 的喃 乳 動 物 的 內(nèi)皮 細(xì) 胞 是 靜 止 的 !l。 在 適 當(dāng)?shù)拇?激 下 ，靜 ll:的 內(nèi)皮 細(xì) 胞 可降解 周 圍 的 基 底 膜