飲用水中微囊藻毒素化學(xué)檢測(cè)方法-固相萃取與高效液相層

1、飲用水中微囊藻毒素化學(xué)檢測(cè)方法固相萃取與高效液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀法NIEA W539.50B一、方法概要本方法使用高效液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀（HPLC/MS-MS）檢測(cè)飲用水中的兩種微囊藻毒素（Microcystins，簡(jiǎn)稱MCs）MC-LR及MC-RR予以定量。水樣調(diào)整pH至約10.5，經(jīng)固相管柱萃取後，收集沖提液，以氮?dú)鉂饪s過(guò)濾後，以HPLC/MS-MS分析。二、適用範(fàn)圍(一)本方法適用於飲用水、淨(jìng)水廠淨(jìng)化後出水或清水等水樣中微囊藻毒素之檢測(cè)。（單一實(shí)驗(yàn)室所測(cè)得MDL：MC-LR為0.009 g/L；MC-RR為0.004 g/L。）(二)本方法所使用之HPLC/MS-MS宜由具高效液相層析

2、串聯(lián)式質(zhì)譜儀分析經(jīng)驗(yàn)之人員，或經(jīng)由訓(xùn)練通過(guò)認(rèn)定者擔(dān)任。(三)本方法係依效能為基準(zhǔn)（Performance-based），可依使用的固相萃取管柱、前處理程序、高效液相層析儀、LC層析管柱及串聯(lián)式質(zhì)譜儀廠牌的不同，分析人員可適當(dāng)修改本方法之樣品前處理程序，惟修改後之方法其執(zhí)行檢測(cè)之所有步驟及程序，應(yīng)符合本方法所述品質(zhì)管制規(guī)範(fàn)。三、干擾(一)本方法的干擾可能來(lái)自於溶劑、試劑、玻璃器皿及樣品處理過(guò)程中所使用的硬體設(shè)備之污染，干擾物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致層析圖基線之上移，須執(zhí)行空白樣品的測(cè)試，以證明無(wú)干擾情形。 (二)所有使用之實(shí)驗(yàn)器皿（包含玻璃器皿和塑膠器皿）必須謹(jǐn)慎清洗。實(shí)驗(yàn)器皿應(yīng)先用甲醇潤(rùn)洗，再以去離子水沖洗，

3、存放於乾淨(jìng)之環(huán)境自然風(fēng)乾。 (三)干擾物質(zhì)可能是樣品中之其他物質(zhì)，基質(zhì)干擾的程度隨樣品之來(lái)源而不同。由於本方法所使用之偵測(cè)系統(tǒng)具選擇性，因此本方法所探討之基質(zhì)中並無(wú)觀察到干擾物，如果有干擾發(fā)生，可用適當(dāng)?shù)腟PE淨(jìng)化去除。 (四)儀器必須將MS-MS的條件調(diào)整至最佳化，以達(dá)到要求的解析度及質(zhì)量的準(zhǔn)確度。在HPLC/MS-MS中如層析管柱材質(zhì)、管柱的長(zhǎng)度、內(nèi)徑、層析的流速、移動(dòng)相及添加劑的選擇，都足以影響分析效果及儀器感度。而電灑法又跟待測(cè)物、溶劑及流速的關(guān)係密切，所以需考量液體本身的電導(dǎo)係數(shù)及介電常數(shù)，以減少離子抑制的情況，以達(dá)到MS-MS分析效率的最佳化。 四、設(shè)備(一)採(cǎi)樣瓶：1 L，玻璃、

4、PP或HDPE採(cǎi)樣瓶，並附螺旋瓶蓋。使用前需先清洗並乾燥。(二)定量瓶：棕色硼矽玻璃材質(zhì)，10 mL和25 mL。(三)KD管：硼矽玻璃材質(zhì)，容量15 mL，可定容2.0 mL。(四)分析天平：可精秤至0.1 mg。(五)天平：可精秤至0.01 g。(六)酸鹼度計(jì)：能測(cè)量pH值至0.1單位。(七)純水裝置：Millipore公司之Milli-Q型純水系統(tǒng)；或同級(jí)品。 (八)高效液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀（HPLC/MS-MS）裝置、高效液相層析儀：HPLC（Agilent 1100；1200型）；或同級(jí)品。、串聯(lián)式質(zhì)譜儀：串聯(lián)式質(zhì)譜儀（ABI API 2000；API 3000 MS-MS）；或同級(jí)

5、品。、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：ABI公司Analyst 1.42版；或其他能顯示分析物的滯留時(shí)間及尖峰面積之定性及定量系統(tǒng)。(九)萃取裝置、固相萃取管柱：Oasis HLB Cartridges 200 mg，6 mL；或Supelco填充C18-E 1 g，6 mL；或同級(jí)品。、固相萃取裝置：Waters，SPE萃取裝置；或同級(jí)品。、蠕動(dòng)馬達(dá)：Gilson Minipuls 3型；或其他類似之蠕動(dòng)馬達(dá)，可調(diào)整流速。、真空幫浦：可調(diào)整真空度，可維持真空壓力至8-10 mmHg。、氮?dú)獯登b置（N2 Evaporator）：可調(diào)整加熱溫度和氮?dú)獯党隽?。、過(guò)濾膜：0.2 mm孔徑，13 mm直徑，Nylon

6、材質(zhì)；或同級(jí)品。、過(guò)濾膜：0.45 mm孔徑，47 mm直徑，Nylon材質(zhì)；或同級(jí)品。五、試劑(一)試劑水：不含待測(cè)物之去離子水，其電阻應(yīng)大於18 M-cm。 (二)甲醇（Methanol）：HPLC級(jí)或LC/MS級(jí)；或更高純度。(三)甲酸（Formic acid）：GR級(jí)；或更高純度。(四)乙酸（Acetic acid）：GR級(jí)；或更高純度。(五)氰甲烷（Acetonitrile）：HPLC級(jí)或LC/MS級(jí)；或更高純度。(六)氨水：33%，ACS試藥級(jí)。(七)含0.1%甲酸的試劑水：HPLC級(jí)或LC/MS級(jí)。(八)液態(tài)氮?dú)猓∟2）：純度99.99%以上。 (九)儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置來(lái)源

7、（註1）：()Microcystin- LR：購(gòu)自ZEN-U BIOTECHNOLOGY Co., LTD，純質(zhì)，1 mg瓶。()Microcystin- RR：購(gòu)自ZEN-U BIOTECHNOLOGY Co., LTD，純質(zhì)，1 mg瓶。、儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)品溶液配製：()將2.0 mL甲醇加入標(biāo)準(zhǔn)品瓶中完全混合，即為1 mg/2 mL500 mg/L。()取上述溶液20 mL加10 mL甲醇，即為1 mg/L。六、採(cǎi)樣與保存(一)使用乾淨(jìng)的高密度聚乙烯（HDPE）、聚丙烯（PP）材質(zhì)容器瓶或棕色玻璃瓶進(jìn)行水樣採(cǎi)集。(二)1L水樣採(cǎi)集後，為避免分析物被微生物降解，須冷藏於42下，並在14天內(nèi)完成萃取

8、，萃取液如置於冷凍櫃中保存，應(yīng)於一個(gè)月內(nèi)完成儀器分析。七、步驟(一)檢量線製備（建議配製方式及濃度如下，使用者須依儀器廠牌的感度及線性範(fàn)圍作適當(dāng)?shù)男拚?、 檢量線溶液配製：取1 mg/L之MC-LR及 MC-RR配製檢量線，檢量線建議濃度範(fàn)圍為1500 mg/L。、 分析至少5個(gè)不同濃度，可參考由上述所製備的檢量線標(biāo)準(zhǔn)品溶液，最低一點(diǎn)濃度應(yīng)與方法定量極限（約為3倍方法偵測(cè)極限）之濃度相當(dāng)。、 檢量線的濃度範(fàn)圍，需搭配使用的儀器偵測(cè)極限及感度範(fàn)圍來(lái)決定。(二)水樣前處理 水樣中如果含有微?；蚴遣幻骰旌衔飼r(shí)，則需經(jīng)過(guò)0.45 mm濾膜過(guò)濾；或以高轉(zhuǎn)速大體積之冷凍離心機(jī)（5000 rpm）離心去除

9、懸浮微粒。(三)固相萃?。⊿PE）步驟：（以下是單一實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證時(shí)之操作條件，實(shí)驗(yàn)室得依使用之萃取管柱不同，適當(dāng)修正之；建議操作流程圖如圖一所示） 、固相萃取管柱必須經(jīng)由5 mL甲醇流洗兩次後，再以5 mL試劑水流洗兩次。 、取200 mL水樣放入250 mL玻璃血清瓶中，以10%氨水調(diào)整水樣pH值至約10.5。 、水樣以6 mL/min的流速流經(jīng)固相萃取管柱後，並抽乾固相萃取管柱。 、固相管柱內(nèi)加入5 mL甲醇（含0.1%乙酸），重複2次，收集合併沖提液於KD管。 、沖提液於60下氮?dú)猓∟2）吹至約1 mL後，以甲醇水（含0.1%甲酸；50:50, v/v）溶解振盪均勻，定容至2 mL。

10、、最後經(jīng)由0.2 mm孔徑，Nylon過(guò)濾膜過(guò)濾之。 、取適量樣品以高效液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀分析。 (四)儀器分析條件（註2）：、高效液相層析建議條件：()層析管柱：Phenomenex公司之Gemini 3m C18 110 （100 2.0 mm）；或同級(jí)品。 ()移動(dòng)相A組成：水（含0.1%甲酸）。 ()移動(dòng)相B組成：甲醇含0.1%甲酸；亦可使用氰甲烷（ACN）。 ()清洗溶劑：100%甲醇（Methanol）。 ()流速：0.25 mL/min。 ()樣品注入量：10 mL。 ()管柱溫度：40。 ()分析時(shí)間：25 min。 ()層析條件：HPLC層析條件如下： 步驟時(shí)間（分）A（%

11、）B（%）10.19010219010362080416208051790106259010 、串聯(lián)式質(zhì)譜儀建議條件：()Ionization mode: 正離子電灑游離法模式（ESI+） ()Ion Spray Voltage (IS): 5.0 kV ()Curtain Gas (CUR): 10 psi ()Gas1 (GS1): 60 psi ()Gas2 (GS2): 50 psi ()Temperature (TEM): 420 ()Interface Heater: ON ()Collisionally Activated Dissociation (CAD): 4 ()MRM離

12、子對(duì)及其質(zhì)譜參數(shù)如表一及表二（註3）所示 (五)鑑定與分析（母子離子對(duì)層析圖如圖二所示）：、使用液相層析串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)之多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple Reaction Monitoring mode，MRM）時(shí)，對(duì)每一種化合物監(jiān)測(cè)其母離子子離子之離子對(duì)兩對(duì)，以其中感度較高的母子離子對(duì)作為定量，另一母子離子對(duì)則作為定性的依據(jù)。MC-LR的分子量為994.548，其【MH】為996，MC-RR的分子量為1037.565，其【M2H】2為520，而其結(jié)構(gòu)代表性的子離子分別為135PhCH2CH(OMe)及213Glu-Mdha+H 。 、初步篩選與定量準(zhǔn)則： ()待測(cè)物之滯留時(shí)間須落在當(dāng)天檢量線

13、標(biāo)準(zhǔn)品平均滯留時(shí)間 2.5%範(fàn)圍之內(nèi)。 ()以待測(cè)物感度較高的監(jiān)測(cè)母子離子對(duì)之面積來(lái)定量該待測(cè)物的含量。 ()當(dāng)樣品中藻毒濃度初步篩選定量結(jié)果未超過(guò)法規(guī)管制標(biāo)準(zhǔn)二分之一時(shí)，即可出具報(bào)告；若超過(guò)法規(guī)管制標(biāo)準(zhǔn)二分之一時(shí)，須完整進(jìn)行下節(jié)確認(rèn)動(dòng)作。、定性與定量準(zhǔn)則： ()待測(cè)物之兩監(jiān)測(cè)母子離子對(duì)須同時(shí)出現(xiàn)，且兩母子離子對(duì)的訊噪比（S/N）必須大於3。 ()待測(cè)物之滯留時(shí)間須落在當(dāng)天檢量線標(biāo)準(zhǔn)品（各點(diǎn)平均）或標(biāo)準(zhǔn)添加樣品之標(biāo)準(zhǔn)品之滯留時(shí)間 2.5%範(fàn)圍之內(nèi)。 ()以待測(cè)物感度較高的監(jiān)測(cè)母子離子對(duì)之面積來(lái)定量該待測(cè)物的含量。 ()待測(cè)物之兩監(jiān)測(cè)母子離子對(duì)（積分面積或高度）的相對(duì)比率（Ion Ratio）須

14、落在可接受的離子比例範(fàn)圍之內(nèi)（母子離子對(duì)比值的最大相對(duì)誤差表，如表三所示。），其相對(duì)比率須以當(dāng)天檢量線中點(diǎn)或標(biāo)準(zhǔn)添加樣品的母子離子對(duì)的比例為基準(zhǔn)計(jì)算之。()當(dāng)樣品待測(cè)物濃度超過(guò)檢量線時(shí)，應(yīng)以甲醇稀釋後，重新上機(jī)分析。 八、結(jié)果處理(一)線性回歸校正法 C水樣濃度，g/LCa由檢量線所求得之樣品濃度，g/LVf水樣濃縮後（沖提液）的體積，mLVi水樣的體積，mL(二)報(bào)告濃度單位為g/L。樣品濃度1 g/L（含）以上取3位有效位數(shù)；樣品濃度1 g/L以下，則取2位有效位數(shù)。 九、品質(zhì)管制(一)依本方法執(zhí)行藻毒檢測(cè)之實(shí)驗(yàn)室，必須有完整之品保品管程序，包括空白樣品分析、查核樣品分析、添加樣品分析及重

15、複樣品分析等實(shí)驗(yàn)室能力建立資料，據(jù)以持續(xù)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室之效能，以期執(zhí)行樣品分析時(shí)能確實(shí)符合各項(xiàng)品管指標(biāo)之規(guī)範(fàn)。 (二)每批次分析樣品前，須確認(rèn)試劑及儀器並無(wú)污染情形。 (三)檢量線應(yīng)每日製作，檢量線以線性回歸校正法，其線性相關(guān)係數(shù)（R）應(yīng)0.995，使用1/x加權(quán)。 (四)空白樣品分析：每20個(gè)樣品或每批次樣品，應(yīng)執(zhí)行空白樣品分析，空白樣品分析值應(yīng)小於方法偵測(cè)極限值之2倍。 (五)查核樣品分析：每20個(gè)樣品或每批次樣品，應(yīng)執(zhí)行查核樣品樣品分析，其回收率應(yīng)在70至130%範(fàn)圍內(nèi)。 (六)添加樣品分析：每20個(gè)樣品或每批次樣品，應(yīng)執(zhí)行基質(zhì)添加樣品分析，其回收率應(yīng)在60至130%範(fàn)圍內(nèi)。 (七)重複樣品

16、分析：每20個(gè)或每批樣品至少執(zhí)行一次重複樣品分析，其相對(duì)差異百分比應(yīng)在30%內(nèi)。十、準(zhǔn)確度與精密度 表四及表五為單一實(shí)驗(yàn)室查核樣品與添加樣品分析之準(zhǔn)確度與精密度的結(jié)果。十一、參考資料(一)潘復(fù)華、賴千豐、蕭美琪、莊士群等，飲用水水源及水質(zhì)中微囊藻毒以HPLC/MS-MS 之分析技術(shù)研究，環(huán)境檢驗(yàn)所調(diào)查研究年報(bào)，第13號(hào)：p.177192，2006。(二)潘復(fù)華、黃壬瑰、蕭美琪、莊士群等，行政院環(huán)境保護(hù)署環(huán)境檢驗(yàn)所，國(guó)內(nèi)水庫(kù)水源水質(zhì)中微囊藻及其藻毒調(diào)查與預(yù)警模式之建立（1/2），中華民國(guó)九十五年三月.(三)潘復(fù)華、黃壬瑰、蕭美琪、莊士群等，行政院環(huán)境保護(hù)署環(huán)境檢驗(yàn)所，國(guó)內(nèi)水庫(kù)水源水質(zhì)中微囊藻及其

17、藻毒調(diào)查與預(yù)警模式之建立（2/2），中華民國(guó)九十六年三月.(四)潘復(fù)華、黃壬瑰、趙春美、翁英明等，行政院環(huán)境保護(hù)署環(huán)境檢驗(yàn)所，水源水質(zhì)中藻類及其毒性調(diào)查研究，中華民國(guó)九十七年三月.(五)European Commission Decision of 13 March 2003 amending Decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues in food animal origin (2003/18/EC), Off.

18、 Eur. Commun. L71 (2003)註：由於微囊藻毒素被視為化學(xué)武器，受聯(lián)合國(guó)管制列為管制物質(zhì)，目前國(guó)內(nèi)可買到的只有MC-LR及MC-RR兩種標(biāo)準(zhǔn)品，且無(wú)法取得可追溯一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品及第二來(lái)源標(biāo)準(zhǔn)品。 註：本方法建議之前處理?xiàng)l件、儀器最佳化及分析條件是以HPLC（Agilent 1100型）和串聯(lián)式質(zhì)譜儀（ABI API 2000 HPLC/MS-MS）所開發(fā)完成。 註： ABI API 2000及API 3000微囊藻毒之相對(duì)應(yīng)母子離子對(duì)離子表及質(zhì)譜參數(shù)，如表一及表二所示。 表一目標(biāo)化合物其MRM離子對(duì)及其質(zhì)譜參數(shù)（API 2000）CompoundRetention time (mi

19、n)Precursor ion (m/z)Productions (m/z)Dwell time(msec)MS/MS parameters (volts)DPCEPCECXPMC-LR 16.53996135 213 100 115381051115381051MC-RR 14.38520135 213 100 25294522529452DP：Declustering Potential (volts), EP：Entrance Potential (volts), CE：Collision Energy Potential (volts), CXP：Collision Cell Exit Potential (volts) 表二目標(biāo)化合物其MRM離子對(duì)及其質(zhì)譜參數(shù)（API 3000）CompoundRetention time (min)Precursor