第十一章 微生物的基本研究方法PPT課件

1、單擊此處編輯母版標題樣式單擊此處編輯母版文本樣式第二級第三級第四級第五級*第十一章 微生物的基本研究方法微生物的基本研究主要是在實驗室中進行的，主要有微生物的觀察、微生物的培養(yǎng)和純種分離、微生物基本研究過程中的滅菌與無菌操作。主要教學內(nèi)容：第一節(jié) 微生物的觀察第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離第三節(jié) 滅菌與無菌操作教學目的要求：掌握：1、觀察微生物所常用的光學顯微鏡分類、應(yīng)用。2、微生物單染色后的觀察方法與活體的觀察方法。3、細菌的染色法及其應(yīng)用，細菌單染色的原理、步驟。4、從試管中采取菌體制備染色涂片的無菌操作過程。第一節(jié) 微生物的觀察一、觀察微生物的常用設(shè)備顯微鏡分為普通光學顯微鏡、電子顯微鏡

2、等等，觀察微生物的常用設(shè)備為普通光學顯微鏡。*（一）、普通光學顯微鏡分類、應(yīng)用普通光學顯微鏡的分類：低倍鏡（放大倍數(shù)100左右）應(yīng)用：活性污泥菌膠團及生物相的觀察等。第一節(jié) 微生物的觀察高倍鏡（放大倍數(shù)400左右）應(yīng)用：霉菌、酵母菌等的觀察、用血球計數(shù)板觀察細菌等。油鏡（放大倍數(shù)1000左右）細菌的觀察等。光學顯微鏡可用于觀察微生物活體和死體。（二）、電子顯微鏡電子顯微鏡在微生物的研究中主要用于病毒及細菌微細結(jié)構(gòu)的觀察，如鞭毛等的觀察。第一節(jié) 微生物的觀察電子顯微鏡觀察的物體必須在真空和干燥的狀態(tài)下進行，因而無法用來進行活體的觀察。因此，微生物的觀察最常用的是光學顯微鏡（常簡稱顯微鏡）。二、觀

3、察方法*觀察方法分為涂片染色觀察法、活體觀察法（壓滴法）。（一）、涂片染色觀察法（微生物死體的觀察）第一節(jié) 微生物的觀察細菌等微生物很小，而且都是無色半透明的，用普通顯微鏡放大，也只能粗略地看到其大小和形態(tài)。象鞭毛、莢膜等特殊結(jié)構(gòu)更是看不清楚。因此要想觀察清楚，就必須進行染色。染色常用染料有美藍、結(jié)晶紫、沙黃等堿性染料。染色原理：細菌細胞內(nèi)含有大量的蛋白質(zhì)，其等電點較低，約在pH25之間，所以在中性、堿性或弱酸性溶液中細菌都是帶負電的，堿性染料電離時染料離子帶正電，容易與帶負電的細菌相結(jié)合而使細菌著色。第一節(jié) 微生物的觀察染色的方法主要有：單染色法、復(fù)染色法兩種。而用于細菌的芽孢、莢膜、鞭毛等

4、的復(fù)雜染色法則不常用。*（1）、細菌單染色法單染色法只用一種染料使細菌著色,主要是幫助觀察細菌的形狀和大小，鑒別作用不大。常用染色液為美藍、石炭酸品紅等。步驟及方法：P341第一節(jié) 微生物的觀察 涂片取干凈的載玻片于實驗臺上，在正面的中央滴一小滴無菌水或生理鹽，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量待染色的菌種與玻片的水滴混勻，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大?；钚晕勰嗳旧捎眯∫汗苋∫坏位钚晕勰嘁河谳d玻片上鋪成一薄層即可。*下圖為做涂片的無菌操作過程。第一節(jié) 微生物的觀察圖11-1、干燥最好在空氣中自然風干，為了加快干燥速度，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高溫下長時間烤干，

5、否則急速失水會使菌體變形。（正面向上）、固定將已干燥的涂片正面向上，玻片于酒精燈的火焰中通過34次，以玻片與手接觸面感到稍微燙手為度。作用：一是使菌體固定于玻片上不易脫落，二是可使標本容易著色。第一節(jié) 微生物的觀察、染色 在載玻片上滴加染色液（石炭酸品紅或美藍等），使染液鋪蓋涂有細菌的部位并持續(xù)一定的時間（石炭酸品紅約12min，美藍約35min，結(jié)晶紫1min ）。、水洗染色到達所需時間后，傾去染色液，將玻片稍傾斜，用細水流將涂片上的剩余染料洗去，直至水呈無色為止。水流切勿過急過猛，水由玻片上端流下，避免直接沖在涂片處。第一節(jié) 微生物的觀察、吸干將載玻片傾斜，用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠（注意

6、勿將細菌擦掉）。、鏡檢待標本片干后置顯微鏡下，先用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后再用油鏡觀察。第一節(jié) 微生物的觀察（2）、細菌的復(fù)染色法（鑒別染色法）細菌復(fù)染色法用兩種染料使細菌著色，有鑒別作用，所以又稱為鑒別染色法。如革蘭氏染色法是常見的細菌復(fù)染色法，可以鑒別革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌。革蘭氏染色法具體步驟及方法： 涂片 干燥 固定（此三步同細菌的單染色）第一節(jié) 微生物的觀察初染加草酸銨結(jié)晶紫一滴染色約lmin，水洗。、媒染加碘液覆蓋約lmin，水洗。作用：進入菌體細胞內(nèi)與結(jié)晶紫形成復(fù)合物，幫助染料與菌體蛋白結(jié)合。、脫色（關(guān)鍵步驟）第一節(jié) 微生物的觀察斜置載玻片于一燒杯之上，滴加95%乙醇脫色

7、，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，隨即水洗。（注：為了節(jié)約乙醇，可將乙醇滴在涂片上靜置0.51min，水洗）、復(fù)染用砂黃染液復(fù)染0.5min，水洗。、吸干用吸水紙吸掉水滴。（切勿擦拭）第一節(jié) 微生物的觀察、鏡檢待標本片干后置顯微鏡下，先用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后再用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。革蘭氏染色法的染色反應(yīng)特征：第一節(jié) 微生物的觀察陽性菌陰性菌圖11-2 革蘭氏染色法的染色反應(yīng)特征（3）、復(fù)雜染色法用于細菌的芽孢、莢膜、鞭毛等的觀察。這部分在此不做介紹，詳細可參閱微生物專書。注意：微生物經(jīng)過染色以后，就已經(jīng)被殺死。用涂片染色法制作成的微生物標本片可直接觀察，不用加蓋玻片，可根據(jù)微生物的大小

8、分別采用低倍鏡、高倍鏡及油鏡。第一節(jié) 微生物的觀察（二）、微生物活體觀察微生物活體觀察法有兩種，壓滴法和懸滴法，常用方法為壓滴法*1、壓滴法做法：取一小滴菌液或活性污泥液等，放在潔凈的載玻片中央，用蓋玻片覆蓋后，即可以進行觀察。水處理過程中活性污泥生物相的觀察等常用此法。第一節(jié) 微生物的觀察圖11-3 壓滴法1-載玻片；2-蓋玻片第一節(jié) 微生物的觀察教學目的要求：掌握：1、微生物純種分離的主要步驟。2、培養(yǎng)不同微生物時培養(yǎng)條件的選擇。3、利用純菌種處理廢水目前存在的問題。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離一、微生物的培養(yǎng)及培養(yǎng)基（復(fù)習，見第二章）環(huán)境工程中，根據(jù)培養(yǎng)微生物常用培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分為：

9、液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩種。液體培養(yǎng)基：用于細菌或微生物的增殖培養(yǎng)等。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離11-4 液體培養(yǎng)基示意圖固體培養(yǎng)基：可以制成平板和斜面培養(yǎng)基。平板固體培養(yǎng)：分離菌種、計數(shù)等。斜面固體培養(yǎng)：保藏菌種。（一）、固體培養(yǎng)基1、制成形式制成形式見圖11-5和圖11-6。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離圖11-5第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離圖11-6第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離木棒（或橡皮管） 2、作用（1）、平板培養(yǎng)基適用于分離菌種和菌種計數(shù)。原因是平板表面積大，容易分離得到純菌種。（2）、斜面培養(yǎng)基適易于培養(yǎng)和保藏菌種。原因是斜面底部可保存一些冷凝水，微生物不容易死亡；斜面做

10、在試管內(nèi)，表面積較小，不容易受到污染。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離二、微生物純種的分離（篩選對于某種特定廢水或污染物具有強大氧化分解能力的菌種）近年來，為了要提高特定廢水生物處理的處理效率，國內(nèi)外都在進行分離和培養(yǎng)純菌種處理此特定廢水的試驗研究。近年來，用微生物浸礦也需要分離和培養(yǎng)純的優(yōu)良菌種。微生物浸礦也稱為微生物選冶。*（一）、微生物純種分離的主要步驟第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離1、尋找在進行純種分離以前，先要尋找生活著我們所需要的微生物 (菌種)的樣品。例如：篩選分解氰化物能力強的菌種，可以從有含氰廢水排出的工廠附近的水溝、土壤中或含氰廢水生物處理的污泥雜質(zhì)里去尋找，因為在這些東西里

11、能分解氰化物的微生物比別處多。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離如果我們得不到合適的樣品，可以從一般土壤里去尋找，土壤是微生物的大本營，一克土壤中含有幾十萬到若干億微生物，各種微生物應(yīng)有盡有。許多微生物的分離篩選工作常從收集土壤樣品開始。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離2、直接分離或增值培養(yǎng)收集的樣品有兩種情況：直接分離：樣品中含有所需要的微生物較多，可直接用合適的固體培養(yǎng)基進行純種分離；增值培養(yǎng)：樣品中所含需要的微生物較少，在分離之前需要用液體培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)處理，使需要的微生物大量生長起來，而不需要的微生物不發(fā)展或發(fā)展很少，以利篩選分離。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離例如：在分離分解氰化物的微

12、生物時，如果樣品中這類微生物不多，就應(yīng)把樣品加到含有氰化物的液體培養(yǎng)基中，使它們經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，再進行分離。通過這樣的培養(yǎng)，也可以使不適于在有氰化物環(huán)境中生長的微生物不發(fā)展或少發(fā)展。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離3、稀釋培養(yǎng)液將樣品或經(jīng)增殖培養(yǎng)后的樣品中的微生物用滅菌過的水進行稀釋。4、菌種分離分離用培養(yǎng)皿進行,分離方法分為稀釋平板法和平板劃線法兩種。（1）、稀釋平板法（如果樣品中的微生物不多，可以不作稀釋，視具體情況確定）第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離做法：將樣品或經(jīng)增殖培養(yǎng)后的樣品中的微生物用滅菌過的水進行稀釋后倒入培養(yǎng)皿，然后再倒入融化的固體培養(yǎng)基溶液，搖動均勻，使菌體分散在培養(yǎng)基

13、內(nèi)。培養(yǎng)基冷凝成平板時分散的菌體就被固定，經(jīng)一定時間的培養(yǎng)后，這種被固定的單個菌體便繁殖形成一個個能被肉眼看到的菌落。這種由單個菌體發(fā)展成的菌落就是我們所需要的純種。這種分離微生物的方法稱為稀釋平板法。見下圖。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離圖11-7 稀釋平板法第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離（2）、平板劃線法（微生物不多，可以不作稀釋）做法：用接種環(huán)蘸取樣品稀釋液，在平板培養(yǎng)基上輕輕的按順序劃線，見圖11-8。這種在平板上劃線的方法稱為平板劃線法。圖11-8第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離平板劃線的幾種典型方法：圖11-9 平板劃線的典型方法第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離微生物隨著劃線次數(shù)的增加

14、而分散。一定時間的培養(yǎng)后在畫線的最后部分可形成單個分散的菌落，獲得純菌種。5、斜面純種增殖培養(yǎng)將分離開的單個菌落接種到斜面培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。6、性能測定第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離將用平板分離開的所有菌種用斜面固體培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)后進行性能等方面的測定，以獲得目標菌種（純菌種）。如氧化分解特定污染物的能力如何等，從而篩選出目標菌種。菌種分離的主要步驟見下圖，在操作中所用的器皿，培養(yǎng)基等在使用前均需要滅菌。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離圖11-10 菌種分離的主要步驟*（四）、不同微生物培養(yǎng)條件的選擇1、控制溫度培養(yǎng)不同的微生物所需要的溫度不一樣。一般的微生物最適宜的溫度在2040之間選擇，

15、耐高溫微生物在溫度為5060 。因此，培養(yǎng)不同微生物時可詳細查閱其培養(yǎng)溫度和時間，以便得到最佳培養(yǎng)。例如：第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離好氧的異養(yǎng)細菌：37恒溫，2448h。厭氧菌的丙酮丁酸梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌：37，7d。酵母菌：28，23d。霉菌、放線菌：28，57d。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離2、控制空氣培養(yǎng)好氧微生物采用液體培養(yǎng)基時，培養(yǎng)容器內(nèi)所裝液體培養(yǎng)基的深度應(yīng)當淺些，可以讓空氣比較容易透入下部。如有條件，還可采用一種能夠振蕩的搖床，把裝有液體培養(yǎng)基和菌種的培養(yǎng)瓶固定在搖床上，利用電動機的帶動，不停地振蕩，使瓶內(nèi)的培養(yǎng)基和菌種不斷攪拌，充分接觸空氣。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離

16、采用固體培養(yǎng)基時，可把培養(yǎng)基裝在培養(yǎng)皿內(nèi)，凝成較大的平面，制成平板；或把培養(yǎng)基裝在試管中，凝成斜面。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離圖11-11圖11-12培養(yǎng)厭氧微生物，要設(shè)法把培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣排除?？梢园雅囵B(yǎng)容器放在密閉的器皿內(nèi)，用真空泵把器皿內(nèi)的空氣抽出；或利用吸收氧氣的某些化學物質(zhì)，把容器中的氧氣除掉；或用氮氣等驅(qū)趕除去厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)的氧氣等。真空干燥器厭氧培養(yǎng)法第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離圖11-13 真空干燥器厭氧培養(yǎng)法連接真空泵干燥器厭氧菌培養(yǎng)試管10%NaOH溶液焦性沒食子酸粉末第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離10%NaOH溶液與焦性沒食子酸粉末混合，發(fā)生反應(yīng)吸氧，形成無氧小環(huán)境。

17、其它，厭氧罐厭氧培養(yǎng)法等。3、控制培養(yǎng)基的成分不同的培養(yǎng)基可以有選擇性地培養(yǎng)不同的微生物。例如：培養(yǎng)基只加纖維素作為碳源時，只有能夠分解纖維素的細菌生長。培養(yǎng)基用石蠟作碳源時，只有分解石蠟的微生物方可生長。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離表11-1第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離4、控制培養(yǎng)基的酸堿度（pH）細菌和放線菌在偏堿性的環(huán)境中生長得好。要篩選放線菌、細菌，應(yīng)把培養(yǎng)基的pH調(diào) 到7或7以上。酵母菌和霉菌在偏酸性的環(huán)境中生長得好。要得到霉菌、酵母菌，應(yīng)把培養(yǎng)基的pH調(diào) 到36，可抑制細菌、放線菌的生長。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離5、使用抑制劑（抗菌素等）利用控制pH的方法來篩選菌種，有時

18、效果不一定很好。有些霉菌也可在中性環(huán)境中生長。有的細菌也可在酸性環(huán)境中生長。因此，按照具體需要，還可以在培養(yǎng)基中加入某些抗菌素等抑制劑。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離例如：培養(yǎng)細菌和放線菌，可以加入灰黃霉素抑制霉菌和酵母菌生長。培養(yǎng)霉菌和酵母菌，可以加入抑制細菌生長的抗菌素，如青霉素。不同微生物培養(yǎng)條件的選擇方法除上所述外，還可能有很多方法可以采用，是一個有待于進一步探索和研究的問題。第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離*（五）、將純菌種直接投入生物處理構(gòu)筑物內(nèi)以處理廢水目前還存在的問題主要是：把大量分離出的適宜于分解某種物質(zhì)的菌種投入，則這一類微生物在短時期內(nèi)能在處理構(gòu)筑物內(nèi)取得優(yōu)勢地位，從而提高

19、該物質(zhì)的去除效率。但是，廢水中一般含有多種物質(zhì)和微生物，生物處理構(gòu)筑物內(nèi)的微生物也就多種多樣，并且還隨時受到空氣和土壤微生物的污染，處理構(gòu)筑物內(nèi)微生物的生長不但受環(huán)境的影響，同時它們互相之間也發(fā)生著影響，所以處理構(gòu)筑物內(nèi)的優(yōu)勢菌種會隨著條件的改變而發(fā)生變化。因此，菌種投入后經(jīng)一定時間，處理效果有可能下降。（有待于繼續(xù)關(guān)注、探討、研究等）第二節(jié) 微生物的培養(yǎng)和純種分離教學目的要求：掌握：1、消毒和滅菌的概念。2、微生物研究過程中滅菌的常用方法、常用設(shè)備。3、無菌操作的概念、無菌環(huán)境分類、無菌操作的方法。第三節(jié) 滅菌與無菌操作一、滅菌*消毒指只殺死一部分微生物，主要是病原微生物。一般消毒只能殺死普通微生物，而不能殺死其芽孢和孢子。*滅菌指殺死一切微生物包括芽孢和孢子。（一）、滅菌目的微生物實驗或研究過程中所有的器皿、培養(yǎng)基等在使用前都要進行滅菌。*滅菌的目的：是避免原來生活在這些器材上的微生物干擾我們的工作。第三節(jié) 滅菌與無菌操作圖11-14菌種的保藏第三節(jié) 滅菌與無菌操作例如：菌種分離圖11-15 菌種分離的主要步驟圖11-16第三節(jié) 滅菌與無菌操作（三）、滅菌方法滅菌方法：高溫滅菌法。方法： 燒灼、干熱烘烤、 高壓蒸汽滅菌等。*常用方法：燒灼法、高壓蒸汽滅菌法。燒