實(shí)驗(yàn)一特殊顯微鏡及其使用

1、汕頭大學(xué)生物系游翠紅l本實(shí)驗(yàn)課共36學(xué)時(shí)，由12個(gè)實(shí)驗(yàn)組成。1、特殊顯微鏡及其使用、特殊顯微鏡及其使用2、線粒體和葉綠體的分離線粒體和葉綠體的分離3、巨噬細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)、巨噬細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)4、ACP、過(guò)氧化物酶等的顯示、過(guò)氧化物酶等的顯示5、小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備、小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備 6、動(dòng)物細(xì)胞染色體分帶技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞染色體分帶技術(shù)永久制片永久制片 實(shí)驗(yàn)開始前細(xì)查張數(shù)及有無(wú)破損實(shí)驗(yàn)開始前細(xì)查張數(shù)及有無(wú)破損清點(diǎn)器械清點(diǎn)器械實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生節(jié)約規(guī)范1、口腔上皮細(xì)胞2、活細(xì)胞（細(xì)胞系）3、培養(yǎng)的紫菜或小新月菱形藻4、流式細(xì)胞儀的演示實(shí)驗(yàn)所需的材料：實(shí)驗(yàn)所需的材料：

2、實(shí)驗(yàn)所需的試劑：實(shí)驗(yàn)所需的試劑：香柏油、乙醚:酒精=7:3暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡l實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀的原理、構(gòu)造及其使用方法。l學(xué)習(xí)特殊顯微鏡操作的目的：學(xué)習(xí)特殊顯微鏡操作的目的： 暗視野顯微鏡：暗視野顯微鏡：看到運(yùn)動(dòng)的物體，利用目標(biāo)物體的輪廓與背景區(qū)分開 熒光顯微鏡：熒光顯微鏡：辨別含有熒光物質(zhì)所在的位置1. 原理原理 利用暗視野聚光器（或擋板）使入射光束的中央光利用暗視野聚光器（或擋板）使入射光束的中央光束被阻擋不能由下而上地通過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡，只能傾束被阻擋不能由下而上地通過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡，只能傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上。標(biāo)本

3、遇光發(fā)生反射或散射，斜地照射在觀察的標(biāo)本上。標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，物鏡接觸不到入射光源的光線，只能接觸標(biāo)本的反射和物鏡接觸不到入射光源的光線，只能接觸標(biāo)本的反射和散射光。因而整個(gè)視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮散射光。因而整個(gè)視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的，使在黑暗的背景上呈現(xiàn)出明亮的像。的，使在黑暗的背景上呈現(xiàn)出明亮的像。丁達(dá)爾現(xiàn)象丁達(dá)爾現(xiàn)象斜向照明斜向照明1. 安裝暗視野聚光器安裝暗視野聚光器（或擋板），放在普通顯微鏡的聚光器（或擋板），放在普通顯微鏡的聚光器下方下方。2. 加香柏油加香柏油：把被檢樣品的標(biāo)本置于載物臺(tái)上，并在聚光器：把被檢樣品的標(biāo)本置于載物臺(tái)上，并在聚光器透鏡的上表

4、面滴香柏油透鏡的上表面滴香柏油 。向上緩慢調(diào)升聚光鏡，使香柏。向上緩慢調(diào)升聚光鏡，使香柏油與載玻片下表面緩緩接觸。油與載玻片下表面緩緩接觸。加香柏油的原因，加香柏油的原因，避免照明避免照明光線于聚光鏡上進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體。光線于聚光鏡上進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體。3. 聚光器光軸的調(diào)中聚光器光軸的調(diào)中：用低倍鏡對(duì)樣品聚焦，隨之用聚光器：用低倍鏡對(duì)樣品聚焦，隨之用聚光器升降螺旋上下緩慢調(diào)節(jié)聚光器位置，當(dāng)暗視野中清楚地窺升降螺旋上下緩慢調(diào)節(jié)聚光器位置，當(dāng)暗視野中清楚地窺見(jiàn)一光環(huán)或圓形光點(diǎn)時(shí)停止什降聚光器，用聚光器調(diào)中桿見(jiàn)一光環(huán)或圓形光點(diǎn)時(shí)停止什降聚光器，用聚光器調(diào)中桿推動(dòng)聚光器，把光環(huán)或光

5、點(diǎn)調(diào)至視野中心；推動(dòng)聚光器，把光環(huán)或光點(diǎn)調(diào)至視野中心；4. 調(diào)節(jié)聚光器焦點(diǎn)，使之位于被檢樣品處，調(diào)節(jié)聚光器焦點(diǎn)，使之位于被檢樣品處，轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器升降轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器升降螺旋，使視野中光環(huán)調(diào)成一最小的圓形光點(diǎn)，此刻聚光器螺旋，使視野中光環(huán)調(diào)成一最小的圓形光點(diǎn)，此刻聚光器的焦點(diǎn)恰好位于樣品處。的焦點(diǎn)恰好位于樣品處。物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑；物鏡的數(shù)值孔徑必須小于聚光器的數(shù)值孔徑；制作標(biāo)本時(shí)所用的載玻片和蓋玻片均應(yīng)清潔無(wú)痕；制作標(biāo)本時(shí)所用的載玻片和蓋玻片均應(yīng)清潔無(wú)痕；必須使用必須使用薄玻片薄玻片(載玻片厚度約載玻片厚度約0.81.1mm，蓋玻片厚，蓋玻片厚度約度約0.1mm)，否則會(huì)影響暗視野

6、集光器斜射光焦點(diǎn)，否則會(huì)影響暗視野集光器斜射光焦點(diǎn)的調(diào)節(jié)，如載玻片太厚，焦點(diǎn)只能落在載玻片內(nèi)，就的調(diào)節(jié)，如載玻片太厚，焦點(diǎn)只能落在載玻片內(nèi)，就不能看到物象；標(biāo)本也不能過(guò)厚。不能看到物象；標(biāo)本也不能過(guò)厚。采用的光源宜強(qiáng)，采用的光源宜強(qiáng)，一般均用強(qiáng)光燈照明一般均用強(qiáng)光燈照明。光線暗則物。光線暗則物象不清晰。象不清晰。用途：用途：1）利用樣品的散射光和反射光進(jìn)行觀察，只能看到）利用樣品的散射光和反射光進(jìn)行觀察，只能看到 物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辯其細(xì)微結(jié)構(gòu)；物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辯其細(xì)微結(jié)構(gòu)；2）可以看到許多細(xì)胞器的明亮輪廓，如細(xì)胞核，）可以看到許多細(xì)胞器的明亮輪廓，如細(xì)胞核， 線粒體、液泡等線粒體、

7、液泡等l 內(nèi)容：口腔上皮細(xì)胞的觀察內(nèi)容：口腔上皮細(xì)胞的觀察l 材料：口腔上皮細(xì)胞材料：口腔上皮細(xì)胞l 試劑：蒸餾水試劑：蒸餾水l 器材和儀器：載玻片、蓋玻片、顯微鏡、牙簽器材和儀器：載玻片、蓋玻片、顯微鏡、牙簽1 1 原理原理l 光波有光波有振幅振幅（亮度）、（亮度）、波長(zhǎng)波長(zhǎng)（顏色）及（顏色）及相位相位( (指在某一時(shí)間指在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置) )的不同。的不同。l 當(dāng)光通過(guò)物體時(shí)，如波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才當(dāng)光通過(guò)物體時(shí)，如波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部能觀察到。而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本，

8、因細(xì)胞各部微細(xì)結(jié)構(gòu)的微細(xì)結(jié)構(gòu)的折射率和厚度折射率和厚度略有不同，光波通過(guò)時(shí)，略有不同，光波通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化振幅并不發(fā)生變化，僅，僅相位相位有變化有變化( (相應(yīng)發(fā)生的差異即相應(yīng)發(fā)生的差異即相位相位差差) )，而這種微小的變化，人眼是無(wú)法加以鑒別的，故在普，而這種微小的變化，人眼是無(wú)法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。通顯微鏡下難以觀察到。l 相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差相位差變成變成振幅差振幅差( (明暗差明暗差) )，同時(shí)，同時(shí)它還吸收部分直射光線，

9、以增大其明暗的反差。它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。相差相差：同一光線經(jīng)過(guò)折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)：同一光線經(jīng)過(guò)折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。生變化并產(chǎn)生的差異。相差決定于光波所通過(guò)介質(zhì)的折射率之差及其厚度，等于相差決定于光波所通過(guò)介質(zhì)的折射率之差及其厚度，等于折射率與厚度的乘積之差（折射率與厚度的乘積之差（光程差光程差），介質(zhì)越厚或折射率越），介質(zhì)越厚或折射率越大，光波減速也越大。大，光波減速也越大。肉眼看不到的相差，利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把肉眼看不到的相差，利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差相位差變成變成振幅差振幅差(明暗差明暗差)，就可以看到。，就可以看到。 相差

10、顯微鏡與普通顯微鏡的相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：主要不同之處是：1 1）用）用環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌代替可變光闌代替可變光闌2 2）用）用相差物鏡相差物鏡( (通常標(biāo)有通常標(biāo)有PHPH的的標(biāo)記標(biāo)記) )代替普通物鏡；代替普通物鏡；3 3）帶有一個(gè)）帶有一個(gè)合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡CT:CT: 用于環(huán)狀光闌的環(huán)孔與相差用于環(huán)狀光闌的環(huán)孔與相差物鏡相板共軛面的環(huán)孔（暗物鏡相板共軛面的環(huán)孔（暗環(huán)）在光路中準(zhǔn)確合軸，使環(huán)）在光路中準(zhǔn)確合軸，使成像的相位差變?yōu)檎穹睿怀上竦南辔徊钭優(yōu)檎穹睿?）有）有綠色濾色片綠色濾色片：用于消色，：用于消色，可吸收紅色和藍(lán)色光，只透可吸收紅色和藍(lán)色光，只透過(guò)

11、綠光，使波長(zhǎng)范圍小的單過(guò)綠光，使波長(zhǎng)范圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良作用，能使相差觀察獲得良好的效果好的效果2 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相相相相 差差差差 附附附附 件件件件1. 燈箱 2. 濾色片座3. 相襯環(huán)桿4. 相襯環(huán)調(diào)節(jié)螺釘 5. 目鏡 6. 三目頭 7.手輪松緊張力圈8. 粗動(dòng)調(diào)焦手輪 9. 電源插頭 10. 電源插座 11. 微動(dòng)調(diào)焦手輪 12. 物鏡13. 載物臺(tái) 14. 聚光鏡調(diào)節(jié)螺釘15. 聚光鏡托架16. 孔徑光欄調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)環(huán) 17. 燈座調(diào)節(jié)螺釘18. 視場(chǎng)光欄調(diào)節(jié)手柄19. 聚光鏡固緊螺釘 20. 聚光鏡升降手輪 21. 移動(dòng)工作

12、臺(tái) 22. 縱向移動(dòng)手輪 23. 橫向移動(dòng)手輪 24. 電源開關(guān) 25. 亮度調(diào)節(jié)旋鈕 26. 移動(dòng)機(jī)構(gòu)固緊螺釘27. 升降限位固緊手柄 28. 鏡筒固緊螺釘 29. 觀察攝像拉桿 30. 集光鏡調(diào)節(jié)手柄 31.聚光鏡刻度處 3 使用方法：使用方法：倒置相差顯微鏡（科技樓倒置相差顯微鏡（科技樓516室）的使用方法：室）的使用方法： 先打開電源開關(guān)，再打開汞燈，然后光圈對(duì)準(zhǔn)最右邊的Ph模式（相差模式，其它數(shù)字表示明場(chǎng)），此時(shí)表示Ph模式下，光圈最大，再轉(zhuǎn)動(dòng)下面的轉(zhuǎn)盤，選擇Ph0，表示放大5倍，底下物鏡相應(yīng)用5倍目鏡；選擇Ph1，表示放大10倍或20倍，底下物鏡相應(yīng)用10倍或20倍；選擇Ph2，表

13、示放大40倍，底下用最大的40倍物鏡。 拍照時(shí)，將右邊的拉桿拉出。雙擊電腦上的軟件圖標(biāo)，選擇Preview按鈕，選擇set 可以拍照，選擇Auto set按鈕可以電腦自動(dòng)調(diào)整照片亮度。然后點(diǎn)擊保存圖標(biāo)，保存在電腦上。4 4 用途：用途： 用于觀察組織培養(yǎng)中活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)或未染色標(biāo)本。用于觀察組織培養(yǎng)中活細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)或未染色標(biāo)本。5 5、標(biāo)本、標(biāo)本 活細(xì)胞活細(xì)胞 熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光( (如紫外光如紫外光36503650入或紫藍(lán)光入或紫藍(lán)光42004200入入) )作為作為激發(fā)光，

14、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的可見(jiàn)激發(fā)光，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的可見(jiàn)熒光，再通過(guò)物鏡和目鏡的成像、放大，以供檢視和拍攝。熒光，再通過(guò)物鏡和目鏡的成像、放大，以供檢視和拍攝。 當(dāng)一個(gè)物體吸收了紫外光或者短波光的能量，它能發(fā)當(dāng)一個(gè)物體吸收了紫外光或者短波光的能量，它能發(fā)射出比原來(lái)吸收的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光。這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的射出比原來(lái)吸收的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光。這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見(jiàn)光稱為可見(jiàn)光稱為“熒光熒光” 。熒光顯微鏡具特殊光源，提供足夠強(qiáng)度和波長(zhǎng)熒光顯微鏡具特殊光源，提供足夠強(qiáng)度和波長(zhǎng)的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。l自發(fā)熒光（不加染色）：自

15、發(fā)熒光（不加染色）：有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光），但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光），但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。領(lǐng)域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。l二次熒光（用化學(xué)染色）：二次熒光（用化學(xué)染色）：非熒光性的物質(zhì)（蛋白質(zhì)、非熒光性的物質(zhì)（蛋白質(zhì)、碳水化合物）用熒光色素染色，由熒光色素產(chǎn)生熒光碳水化合物）用熒光色素染色，由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進(jìn)行觀察。對(duì)特定物體選擇合適（二次熒光），以便進(jìn)行觀察。對(duì)特定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或細(xì)胞區(qū)別出的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或細(xì)胞區(qū)別

16、出來(lái)而可以觀察到。來(lái)而可以觀察到。l抗體熒光技術(shù)（用免疫染色）：抗體熒光技術(shù)（用免疫染色）：利用特定的抗原必然利用特定的抗原必然和特定的抗體相結(jié)合這一個(gè)事實(shí)，有意識(shí)地使帶熒光和特定的抗體相結(jié)合這一個(gè)事實(shí)，有意識(shí)地使帶熒光標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗原進(jìn)行抗原標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗原進(jìn)行抗原/抗體反應(yīng)，這樣抗體反應(yīng)，這樣兩者的結(jié)合體就能通過(guò)抗體的熒光觀察到。兩者的結(jié)合體就能通過(guò)抗體的熒光觀察到。熒光染色分類：熒光染色分類：普通光學(xué)顯微鏡加附件： 1)熒光光源 2)激發(fā)濾片 3)雙色束分離器 4)阻斷濾片等的基礎(chǔ)上組成的。2.1 基本裝置基本裝置熒光顯微鏡內(nèi)部構(gòu)造（反射式） 2.22.2、光源：采用高壓

17、汞燈。、光源：采用高壓汞燈。 由于熒光和激發(fā)光相比，是非常微弱的，因由于熒光和激發(fā)光相比，是非常微弱的，因此熒光顯微鏡的光源強(qiáng)度必須很高，即使在近紫此熒光顯微鏡的光源強(qiáng)度必須很高，即使在近紫外區(qū)，也必須有足夠的強(qiáng)度。為了滿足這些要求外區(qū)，也必須有足夠的強(qiáng)度。為了滿足這些要求，通常采用高壓汞燈。，通常采用高壓汞燈。 使用中嚴(yán)禁頻繁啟閉，點(diǎn)亮后欲暫停使用時(shí)使用中嚴(yán)禁頻繁啟閉，點(diǎn)亮后欲暫停使用時(shí)，不可切斷電源，可用光閥阻斷光路。，不可切斷電源，可用光閥阻斷光路。 激發(fā)濾色激發(fā)濾色鏡鏡(exciter filter)為被檢樣品的熒光燃料提供最佳波段的激發(fā)光。為被檢樣品的熒光燃料提供最佳波段的激發(fā)光。加

18、放于汞燈和二向色鏡之間，物鏡之前。加放于汞燈和二向色鏡之間，物鏡之前。 2.3、濾色鏡系統(tǒng)、濾色鏡系統(tǒng)激發(fā)方法激發(fā)方法代號(hào)代號(hào)主波長(zhǎng)主波長(zhǎng)紫外紫外UV365nm紫紫V405nm蘭紫蘭紫BV436nm蘭蘭B，B2495nm綠綠G546nm幾種主要的激發(fā)濾色鏡幾種主要的激發(fā)濾色鏡 阻斷濾光鏡阻斷濾光鏡(barrier filter)(barrier filter)： 位于物鏡之上，二向色鏡與目鏡之間，用以阻斷位于物鏡之上，二向色鏡與目鏡之間，用以阻斷或吸收或吸收沒(méi)有被標(biāo)本吸收的激發(fā)光沒(méi)有被標(biāo)本吸收的激發(fā)光，以防傷害眼睛，使，以防傷害眼睛，使熒光透過(guò)。在熒光中也僅有部分波長(zhǎng)被選擇透過(guò)。熒光透過(guò)。在熒

19、光中也僅有部分波長(zhǎng)被選擇透過(guò)。 選用的原則，以能完全阻斷或吸收波長(zhǎng)長(zhǎng)于所需選用的原則，以能完全阻斷或吸收波長(zhǎng)長(zhǎng)于所需熒光的光線，并透過(guò)樣品發(fā)出的熒光。熒光的光線，并透過(guò)樣品發(fā)出的熒光。2.4、熒光顯微鏡的光路、熒光顯微鏡的光路因熒光激發(fā)的方式不同，分為：透射熒光顯微術(shù)光路透射熒光顯微術(shù)光路反射熒光顯微術(shù)光路反射熒光顯微術(shù)光路透射熒光顯微鏡光路圖透射熒光顯微鏡光路圖反射熒光顯微鏡光路圖反射熒光顯微鏡光路圖汞燈激發(fā)濾鏡集光鏡目鏡阻斷濾鏡二向色鏡物鏡樣品 3 3、熒光顯微鏡的分類：、熒光顯微鏡的分類： 3.1.3.1.透射熒光顯微鏡：透射熒光顯微鏡： 光源：高壓汞燈或鹵素?zé)?。光源：高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>

20、 聚光鏡：使用暗場(chǎng)聚光鏡，使激發(fā)光和熒光分離出來(lái)。聚光鏡：使用暗場(chǎng)聚光鏡，使激發(fā)光和熒光分離出來(lái)。 物鏡：可用任何種類的物鏡。物鏡：可用任何種類的物鏡。標(biāo)本：因?yàn)槭峭干溆^察，薄的標(biāo)本比較適合。標(biāo)本：因?yàn)槭峭干溆^察，薄的標(biāo)本比較適合。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 必須正確調(diào)整聚光鏡中心和高度，否則不能獲得明亮的熒必須正確調(diào)整聚光鏡中心和高度，否則不能獲得明亮的熒光像。光像。 由于暗視場(chǎng)聚光鏡焦距限制，不能使用厚的載玻片。由于暗視場(chǎng)聚光鏡焦距限制，不能使用厚的載玻片。 視場(chǎng)照明區(qū)不能過(guò)大，否則容易使熒光標(biāo)本熒光色衰褪。視場(chǎng)照明區(qū)不能過(guò)大，否則容易使熒光標(biāo)本熒光色衰褪。 厚的或不透明的標(biāo)本不適用。厚的或不透明的標(biāo)

21、本不適用。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 由于用了暗場(chǎng)聚光鏡，激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡，因此容由于用了暗場(chǎng)聚光鏡，激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。易形成暗的背景，得到良好的反差。 由于上述同樣的原因，任何物鏡都可用于觀察。由于上述同樣的原因，任何物鏡都可用于觀察。 用低倍物鏡時(shí)，比反射熒光顯微鏡更亮。用低倍物鏡時(shí)，比反射熒光顯微鏡更亮。 3.2.3.2.反射熒光顯微鏡：反射熒光顯微鏡： 光源：高壓汞燈或鹵素?zé)?。光源：高壓汞燈或鹵素?zé)簟?聚光鏡：因?yàn)槲镧R作為聚光鏡，所以不需要聚光鏡。聚光鏡：因?yàn)槲镧R作為聚光鏡，所以不需要聚光鏡。物鏡：所用的物鏡必須能透過(guò)足夠的紫外光，而且本物鏡：所用的物鏡必

22、須能透過(guò)足夠的紫外光，而且本身不產(chǎn)生熒光，對(duì)數(shù)值孔徑?jīng)]有限制。身不產(chǎn)生熒光，對(duì)數(shù)值孔徑?jīng)]有限制。標(biāo)本：厚的標(biāo)本或不透明的標(biāo)本都能觀察。標(biāo)本：厚的標(biāo)本或不透明的標(biāo)本都能觀察。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調(diào)節(jié)。由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調(diào)節(jié)。 采用柯拉照明法，可利用孔徑光闌和視場(chǎng)光闌的效果。采用柯拉照明法，可利用孔徑光闌和視場(chǎng)光闌的效果。 物鏡數(shù)值孔徑不受限制，在高放大被率時(shí)，也可以獲得高物鏡數(shù)值孔徑不受限制，在高放大被率時(shí)，也可以獲得高分辨率的像。分辨率的像。 厚的或不透明的標(biāo)本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。厚的或不透明的標(biāo)本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。 其它觀察法也能與

23、反射熒光結(jié)合使用，特別和相差法和透其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合。射微分干涉差法相結(jié)合。 可以避免不必要的熒光色衰褪現(xiàn)象?？梢员苊獠槐匾臒晒馍ネ尸F(xiàn)象。 1 1）打開燈源開關(guān)（汞燈及普通燈光源），）打開燈源開關(guān)（汞燈及普通燈光源），超高壓汞燈要預(yù)超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。才能達(dá)到最亮點(diǎn)。2 2）反射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)）反射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片雙色束分離器阻斷濾片的插塊。濾片雙色束分離器阻斷濾片的插塊。3 3）放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。）放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。 使用中應(yīng)注意

24、：使用中應(yīng)注意：末裝濾末裝濾光片不要用眼直接觀察光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；，以免引起眼的損傷；4 4）高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5 5分鐘后才能再分鐘后才能再啟動(dòng)啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。5 5）先在普通光源下（數(shù)字調(diào)為）先在普通光源下（數(shù)字調(diào)為1 1）用）用1010倍物鏡調(diào)整好玻片的倍物鏡調(diào)整好玻片的焦距，后轉(zhuǎn)至焦距，后轉(zhuǎn)至4040倍物鏡。材料目標(biāo)與焦距調(diào)好后，關(guān)閉普倍物鏡。材料目標(biāo)與焦距調(diào)好后，關(guān)閉普通光源的電源（或用載物臺(tái)下面的擋板將來(lái)自下面的普通通光源的電源（或用載物臺(tái)下面的擋板將來(lái)自下面

25、的普通光源擋住），數(shù)字調(diào)至光源擋住），數(shù)字調(diào)至2-42-4，其中，其中2 2為紅色激發(fā)光，為紅色激發(fā)光，3 3為藍(lán)為藍(lán)色激發(fā)光，色激發(fā)光，4 4為綠色激發(fā)光，藍(lán)色激發(fā)光波長(zhǎng)最短，一般為綠色激發(fā)光，藍(lán)色激發(fā)光波長(zhǎng)最短，一般應(yīng)用藍(lán)色應(yīng)用藍(lán)色3 3，即可看到熒光照片。，即可看到熒光照片。 熒光顯微鏡主機(jī)的上部分右側(cè)分別有調(diào)整熒光光圈、熒光顯微鏡主機(jī)的上部分右側(cè)分別有調(diào)整熒光光圈、光強(qiáng)的拉桿及照相拉桿。光強(qiáng)的拉桿及照相拉桿。4、使用方法（反射熒光顯微鏡）、使用方法（反射熒光顯微鏡）5 5、用途、用途 1)1)觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的細(xì)觀察標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標(biāo)記的

26、細(xì)胞和結(jié)構(gòu)胞和結(jié)構(gòu) 2)2)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，標(biāo)本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。借以研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織內(nèi)的分布。 3) 3)細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙細(xì)胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與錠與吖啶橙可與DNADNA綜合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)綜合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNADNA含量測(cè)定。含量測(cè)定。 4)4)熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗），用該標(biāo)酸或羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體（一抗或二抗），用該標(biāo)記抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測(cè)記抗體直接或間接地與細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原結(jié)合，以檢測(cè)該抗原的存在與分布。該抗原的存在與分布。熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色） l內(nèi)容：熒光顯微鏡下觀察單細(xì)胞藻類l材料：小新月菱形藻l儀器：載玻片、蓋玻片、載玻片、蓋玻片、熒光顯微鏡1、FCM的結(jié)構(gòu)可分為的結(jié)構(gòu)可分為5部分：部分：流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；激光光源及光速形成系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)。2、FCM的工作原理：的工作原理： 1） 將待測(cè)細(xì)胞染色后，制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測(cè)樣品壓人流動(dòng)室，同時(shí)，不含細(xì)胞的