IVF實(shí)驗(yàn)室的基本操作

1、IVF實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室的基本操作基本操作實(shí)驗(yàn)室操作原則實(shí)驗(yàn)室操作原則 防止防止 污染污染配子標(biāo)本的配子標(biāo)本的標(biāo)記；標(biāo)記；受精、胚胎受精、胚胎移植；移植； 兩人核對(duì)兩人核對(duì)毒性測(cè)試；毒性測(cè)試；培養(yǎng)液、耗材培養(yǎng)液、耗材的使用；的使用；實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制和管理控制和管理無(wú)誤無(wú)誤無(wú)菌無(wú)菌無(wú)毒無(wú)毒輔助生殖技術(shù)基本操作輔助生殖技術(shù)基本操作配子、胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)配子、胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)1配子的收集和處理配子的收集和處理2體外受精技術(shù)體外受精技術(shù)3胚胎培養(yǎng)和移植胚胎培養(yǎng)和移植4胚胎冷凍和解凍胚胎冷凍和解凍5培養(yǎng)液的準(zhǔn)備培養(yǎng)液的準(zhǔn)備v培養(yǎng)液的基本組分培養(yǎng)液的基本組分 無(wú)機(jī)鹽離子無(wú)機(jī)鹽離子-維持維持pHpH和滲透壓

2、和滲透壓 碳水化合物碳水化合物-能量來(lái)源能量來(lái)源 蛋白質(zhì)來(lái)源蛋白質(zhì)來(lái)源 抗生素抗生素v礦物油礦物油 有利于維持培養(yǎng)液溫度、有利于維持培養(yǎng)液溫度、pHpH值和滲透壓穩(wěn)定值和滲透壓穩(wěn)定 防護(hù)屏障，減少污染防護(hù)屏障，減少污染 吸收脂溶性毒素吸收脂溶性毒素 防止液體蒸發(fā)防止液體蒸發(fā)培養(yǎng)液的準(zhǔn)備培養(yǎng)液的準(zhǔn)備 取卵前一日下午進(jìn)行取卵前一日下午進(jìn)行v原則：高效、方便、安全、經(jīng)濟(jì)原則：高效、方便、安全、經(jīng)濟(jì) v四孔培養(yǎng)皿四孔培養(yǎng)皿卵卵v處理精液所需培養(yǎng)液處理精液所需培養(yǎng)液v微滴培養(yǎng)微滴培養(yǎng)受精卵、胚胎受精卵、胚胎v胚胎移植液胚胎移植液37 ， 5% 或或 6%CO2培箱內(nèi)培箱內(nèi) 平衡過(guò)夜平衡過(guò)夜卵母細(xì)胞的獲取

3、卵母細(xì)胞的獲取v注射注射hCGhCG后后36-3836-38小時(shí)取卵小時(shí)取卵v陰道超聲探頭引導(dǎo)下經(jīng)陰陰道超聲探頭引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺抽吸卵泡道穿刺抽吸卵泡v核對(duì)姓名核對(duì)姓名v解剖顯微鏡下辨認(rèn)卵冠丘解剖顯微鏡下辨認(rèn)卵冠丘復(fù)合物復(fù)合物OCCCOCCCv37, 537, 56%CO6%CO2 2 培養(yǎng)培養(yǎng) v操作迅速，避光操作迅速，避光精液處理精液處理v正常精液：同正常精液：同IUIIUIv極度少精：增加離心力極度少精：增加離心力v死精癥：低滲腫脹實(shí)驗(yàn)死精癥：低滲腫脹實(shí)驗(yàn)v附睪穿刺精子：附睪穿刺精子：v睪丸穿刺或活檢精子：睪丸穿刺或活檢精子： 1ml1ml注射器針頭挑碎組織，離心懸液注射器針頭挑碎組織，

4、離心懸液v附睪、睪丸精子的冷凍附睪、睪丸精子的冷凍常規(guī)受精常規(guī)受精 取卵后取卵后4-8h 適應(yīng)癥：精液正常，適應(yīng)癥：精液正常， 輕度少、弱精癥輕度少、弱精癥受精率：受精率：6580（MII卵）卵）受精時(shí)間：長(zhǎng)受精、短受精受精時(shí)間：長(zhǎng)受精、短受精卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射v適應(yīng)癥：嚴(yán)重少弱精、梗阻性無(wú)精、畸精癥、既適應(yīng)癥：嚴(yán)重少弱精、梗阻性無(wú)精、畸精癥、既往往IVFIVF常規(guī)受精失敗史、某些不明原因不孕等常規(guī)受精失敗史、某些不明原因不孕等v時(shí)間：取卵后時(shí)間：取卵后2 2小時(shí)小時(shí)v剝卵：利用透明質(zhì)酸酶（剝卵：利用透明質(zhì)酸酶（80mIU/ml)80mIU/ml)和機(jī)械法剝除

5、和機(jī)械法剝除顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射v卵母細(xì)胞成熟度的評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞成熟度的評(píng)價(jià)GVMIMII 卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射v操作滴的準(zhǔn)備：操作滴的準(zhǔn)備：7 7PVP PVP v加精加精v裝針裝針v顯微注射顯微注射 v受精率：受精率：7070受精方式的選擇受精方式的選擇vICSIICSI的安全性？的安全性？ 逃避了自然選擇過(guò)程逃避了自然選擇過(guò)程 垂直傳遞遺傳缺陷垂直傳遞遺傳缺陷 操作過(guò)程對(duì)配子的損傷操作過(guò)程對(duì)配子的損傷v嚴(yán)格掌握嚴(yán)格掌握ICSIICSI適應(yīng)癥適應(yīng)癥非男性因素不孕非男性因素不孕ICSI治療結(jié)局治療結(jié)局非男性因素不孕癥，非男性因素不孕癥，IC

6、SI未顯現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)未顯現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)檢查受精檢查受精v時(shí)間：受精后時(shí)間：受精后15151818小時(shí)小時(shí)v機(jī)械法除去顆粒細(xì)胞及放射冠機(jī)械法除去顆粒細(xì)胞及放射冠v正常受精：兩個(gè)原核，兩個(gè)極體正常受精：兩個(gè)原核，兩個(gè)極體合子形態(tài)評(píng)價(jià)合子形態(tài)評(píng)價(jià)v原核的大小、位置及方向原核的大小、位置及方向v核仁前體的數(shù)目、大小、分布核仁前體的數(shù)目、大小、分布v胞漿的外觀胞漿的外觀v早期卵裂情況早期卵裂情況異常受精異常受精1PN1PNv發(fā)生率發(fā)生率 1 15 5 卵裂率卵裂率 74%74% 染色體二倍體率染色體二倍體率 5 5 囊胚形成率囊胚形成率 29% 29% (Noyes 2008)(Noyes 2008)v機(jī)制：機(jī)制

7、： 雌雄原核發(fā)育不同步雌雄原核發(fā)育不同步 雌雄原核融合雌雄原核融合 孤雌來(lái)源孤雌來(lái)源 ICSIICSI多見(jiàn)多見(jiàn)異常受精多異常受精多PNv發(fā)生率：發(fā)生率：IVF 5-8% IVF 5-8% ICSI 1% ICSI 1%v發(fā)生機(jī)制：發(fā)生機(jī)制： 2 2精子進(jìn)入精子進(jìn)入 第第2 2極體滯留極體滯留 雙倍體卵母細(xì)胞雙倍體卵母細(xì)胞未見(jiàn)原核未受精未見(jiàn)原核未受精v可能機(jī)制可能機(jī)制 卵母細(xì)胞未成熟卵母細(xì)胞未成熟 卵母細(xì)胞染色體異常卵母細(xì)胞染色體異常v卵裂率卵裂率 10%10% 染色體二倍體率染色體二倍體率 3%3% 優(yōu)胚率低優(yōu)胚率低 (12/38) (12/38) 囊胚形成囊胚形成 (0/12) (0/12)

8、 (Noyes 2008)(Noyes 2008) 受精失敗受精失敗v受精率受精率20% 20% 受精率低下受精率低下 所有成熟卵均未受精所有成熟卵均未受精 受精失敗受精失敗v常規(guī)受精周期常規(guī)受精周期 失敗率失敗率 1010 精子功能障礙精子功能障礙 卵母細(xì)胞成熟障礙卵母細(xì)胞成熟障礙 補(bǔ)打補(bǔ)打ICSI?ICSI?vICSIICSI周期周期 失敗率失敗率 2 23 3 嚴(yán)重精子畸形嚴(yán)重精子畸形 卵母細(xì)胞激活卵母細(xì)胞激活 鈣離子載體？機(jī)械激活？鈣離子載體？機(jī)械激活？ 胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)v胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù) 碎片碎片: :無(wú)碎片無(wú)碎片 碎片碎片10% 50%

9、50% 卵裂球均勻程度卵裂球均勻程度 囊胚的評(píng)分體系囊胚的評(píng)分體系4AA4AA囊胚腔的大小囊胚腔的大小內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞分級(jí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞分級(jí)滋養(yǎng)層分級(jí)滋養(yǎng)層分級(jí)三位評(píng)分法三位評(píng)分法1:1:不到整個(gè)胚胎的一半不到整個(gè)胚胎的一半2 :2 :超過(guò)了胚胎體積的一半超過(guò)了胚胎體積的一半3 :3 :完全占據(jù)整個(gè)胚胎完全占據(jù)整個(gè)胚胎4:4:擴(kuò)張囊胚擴(kuò)張囊胚5:5:孵化囊胚孵化囊胚 6:6:孵化后囊胚孵化后囊胚A A包裹緊密，大量細(xì)胞包裹緊密，大量細(xì)胞B B結(jié)構(gòu)松散，少量細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，少量細(xì)胞C C極少量細(xì)胞極少量細(xì)胞A A許多細(xì)胞緊密結(jié)合許多細(xì)胞緊密結(jié)合B B少量細(xì)胞，結(jié)構(gòu)松散少量細(xì)胞，結(jié)構(gòu)松散C C極少量細(xì)胞極

10、少量細(xì)胞 2AA5AA 4BA4CC胚胎移植操作胚胎移植操作v選擇需要移植的胚胎選擇需要移植的胚胎, ,移入移植滴內(nèi)移入移植滴內(nèi) 3535歲以下，首次移植的病人移植歲以下，首次移植的病人移植2 2枚胚胎枚胚胎 3535歲以上，或非首次移植的病人移植歲以上，或非首次移植的病人移植3 3枚胚胎枚胚胎v確認(rèn)核對(duì)患者姓名確認(rèn)核對(duì)患者姓名vD3 or D5 D3 or D5 移植？移植？移植液移植液移植液移植液移植液和胚胎移植液和胚胎氣氣 20l氣氣胚胎移植操作胚胎移植操作胚胎冷凍胚胎冷凍v意義：提高累計(jì)妊娠率，避免多胎，減少卵巢過(guò)度意義：提高累計(jì)妊娠率，避免多胎，減少卵巢過(guò)度刺激風(fēng)險(xiǎn)刺激風(fēng)險(xiǎn)v溫度的急

11、劇變化形成冰晶溫度的急劇變化形成冰晶 機(jī)械性損傷機(jī)械性損傷 溶質(zhì)性損傷溶質(zhì)性損傷 滲透壓損傷滲透壓損傷 核心：避免冰晶形成核心：避免冰晶形成v冷凍方法：慢凍速融法冷凍方法：慢凍速融法 玻璃化冷凍法玻璃化冷凍法v冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑 滲透性保護(hù)劑：滲透性保護(hù)劑：EG PRON EG PRON 甘油甘油 非滲透性保護(hù)劑：蔗糖非滲透性保護(hù)劑：蔗糖 大分子物質(zhì)大分子物質(zhì)胚胎的冷凍胚胎的冷凍: :慢速冷凍慢速冷凍室溫室溫 15min室溫室溫 5min室溫室溫15minPBS1.5M丙二醇丙二醇1.5M丙二醇丙二醇0.1M蔗糖蔗糖慢凍速融法慢凍速融法v冷凍程序冷凍程序 2 2007 3/min7 3/mi

12、n -7 -7 人工植冰人工植冰 -7-730 0.3/min30 0.3/min -30 -30120 30/min120 30/min胚胎復(fù)蘇胚胎復(fù)蘇12340.5M丙二醇丙二醇0.2M蔗糖蔗糖 5min0.2M蔗糖蔗糖 5minPBS 5min1.0M丙二醇丙二醇 0.2M蔗糖蔗糖 5min 預(yù)防冰晶的再形成預(yù)防冰晶的再形成 復(fù)蘇程序：復(fù)蘇程序： 室溫室溫 40s 30水浴水浴 1min胚胎凍融損傷胚胎凍融損傷v復(fù)蘇胚胎評(píng)價(jià)：復(fù)蘇胚胎評(píng)價(jià)：50%50%卵裂球完整卵裂球完整 存活存活 復(fù)蘇率復(fù)蘇率90%90%v無(wú)損傷胚胎著床率高無(wú)損傷胚胎著床率高 部分損傷胚胎著床能力下降部分損傷胚胎著床能力下降玻璃化冷凍玻璃化冷凍v原理原理v條件：高濃度冷凍保護(hù)劑條件：高濃度冷凍保護(hù)劑 極快的降溫速度極快的降溫速度v載體：開(kāi)放式載體：開(kāi)放式 密閉式密閉式v適應(yīng)癥：卵母細(xì)胞適應(yīng)癥：卵母細(xì)胞 囊