Bt伴胞晶體毒蛋白的結(jié)構(gòu)功能和應(yīng)用學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1Bt伴胞晶體毒蛋白的結(jié)構(gòu)功能和應(yīng)用伴胞晶體毒蛋白的結(jié)構(gòu)功能和應(yīng)用第1頁(yè)/共73頁(yè) Bacillus thuringiensis (Bt)Sporulated cultureCrystal第2頁(yè)/共73頁(yè)第3頁(yè)/共73頁(yè)蘇云金芽胞桿菌能產(chǎn)生7種毒素蛋白-內(nèi)毒素-外毒素-外毒素-外毒素不穩(wěn)定外毒素水溶性毒素鼠因子外毒素CryCryCryCryCry-Cyt第4頁(yè)/共73頁(yè)第5頁(yè)/共73頁(yè)第6頁(yè)/共73頁(yè)第7頁(yè)/共73頁(yè)本實(shí)驗(yàn)室主要研究?jī)?nèi)容：第8頁(yè)/共73頁(yè)1.毒素蛋白的基本特征和分類毒素蛋白的基本特征第9頁(yè)/共73頁(yè)米粒狀晶體 YBT-1518毒素蛋白的基本特征球形晶體B.thuringi

2、ensis M15菱形晶體第10頁(yè)/共73頁(yè)毒素蛋白的分類 第11頁(yè)/共73頁(yè)毒素蛋白的分類 第12頁(yè)/共73頁(yè)毒素蛋白的分類 第13頁(yè)/共73頁(yè)毒素蛋白在Bt中的分布 第14頁(yè)/共73頁(yè)2.毒素蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 第15頁(yè)/共73頁(yè)Cry5BaCry1Aa2.毒素蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 第16頁(yè)/共73頁(yè) Swiss-PdbViewer顯示Cry蛋白三維模型IIIIIIPymol顯示Cry蛋白三維模型2.毒素蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 第17頁(yè)/共73頁(yè)P(yáng)ymol預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)表面相對(duì)靜電荷2.毒素蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 第18頁(yè)/共73頁(yè)Molsoft預(yù)測(cè)cry蛋白活性位點(diǎn)2.毒素蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 第19頁(yè)/共73頁(yè)

3、2.毒素蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 2.1 結(jié)構(gòu)域：第20頁(yè)/共73頁(yè)2.1.1“鉛筆刀”模型： 第21頁(yè)/共73頁(yè)傘狀模型2.1.2 “傘狀模型” ： 第22頁(yè)/共73頁(yè)2.1.3 “5螺旋六聚體”模型： 第23頁(yè)/共73頁(yè) 2.2 結(jié)構(gòu)域： 第24頁(yè)/共73頁(yè)2.3 結(jié)構(gòu)域： 第25頁(yè)/共73頁(yè)2.4 三個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用 第26頁(yè)/共73頁(yè)第27頁(yè)/共73頁(yè)3.毒素蛋白與昆蟲的作用機(jī)理 毒素蛋白與昆蟲受體的相互作用模式： 第28頁(yè)/共73頁(yè)毒素蛋白與昆蟲受體的相互作用模式： 第29頁(yè)/共73頁(yè)毒素蛋白與昆蟲受體的相互作用模式： 第30頁(yè)/共73頁(yè)第31頁(yè)/共73頁(yè)3.2 毒素蛋白受體： 第32

4、頁(yè)/共73頁(yè)3.2.1 APN(aminopeptidase N) 第33頁(yè)/共73頁(yè)3.2.1.1 APN受體結(jié)合的毒素種類 第34頁(yè)/共73頁(yè)3.2.1.2 APN受體對(duì)毒素插入質(zhì)膜的介導(dǎo) 第35頁(yè)/共73頁(yè)昆蟲中腸 APN受體與 Bt 殺蟲毒力 第36頁(yè)/共73頁(yè)3.2.2 類鈣粘蛋白(Cadherin-like) 第37頁(yè)/共73頁(yè)棉鈴蟲中腸類鈣粘蛋白結(jié)構(gòu)模型 3.2.2 類鈣粘蛋白(Cadherin-like) 第38頁(yè)/共73頁(yè)堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase ，ALP ） 第39頁(yè)/共73頁(yè)3.2.4 其他的毒素受體 Glyco-conujgate recep

5、tor第40頁(yè)/共73頁(yè)毒素蛋白的應(yīng)用 4.1 Bt在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用 第41頁(yè)/共73頁(yè) Bt的主要產(chǎn)品劑型 蔬菜蔬菜-水劑，撒粉劑水劑，撒粉劑水稻水稻-油劑，粉劑油劑，粉劑林木林木-油劑，粉劑油劑，粉劑衛(wèi)生衛(wèi)生-漂浮粒劑漂浮粒劑4.1 Bt在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用 第42頁(yè)/共73頁(yè)Bt 的主要市場(chǎng)4.1 Bt在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用 第43頁(yè)/共73頁(yè) 主要防治對(duì)象小菜蛾小菜蛾菜青蟲菜青蟲棉鈴蟲棉鈴蟲玉米螟玉米螟稻稻 螟螟松毛蟲松毛蟲蚊子幼蟲蚊子幼蟲 4.1 Bt在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用 第44頁(yè)/共73頁(yè)4.1 Bt在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用 第45頁(yè)/共73頁(yè)4.2 Bt毒素在抗病方面的應(yīng)用 第46頁(yè)/共73

6、頁(yè)白血病T細(xì)胞正常T細(xì)胞肝癌正常肝細(xì)胞4.2 Bt毒素在抗病方面的應(yīng)用 Cell survival %Toxin proteins g/ mL Cell survival %Toxin proteins g/ mL Toxin proteins g/ mL Toxin proteins g/ mL Cell survival %Cell survival %第47頁(yè)/共73頁(yè)白血病T細(xì)胞宮頸癌細(xì)胞4.2 Bt毒素在抗病方面的應(yīng)用 Cell survival %Toxin proteins g/ mL Cell survival %Toxin proteins g/ mL 第48頁(yè)/共73頁(yè)4.

7、3 利用分子生物學(xué)技術(shù)定向進(jìn)化毒素蛋白基因 第49頁(yè)/共73頁(yè)4.3.1 新的毒素基因的鑒定與克隆 4.3.1.1 Bt140菌株中cry2Ac6新基因的克?。?第50頁(yè)/共73頁(yè) 中其他功能基因的擴(kuò)增 第51頁(yè)/共73頁(yè)4.3.2. 利用生化和分子生物學(xué)技術(shù)定向改造毒蛋白 4.3.2.1 利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，提高毒蛋白殺蟲毒力 第52頁(yè)/共73頁(yè)4.3.2.1 利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，提高毒蛋白殺蟲毒力 第53頁(yè)/共73頁(yè)Cry蛋白中18- 19loop的結(jié)構(gòu)與序列比對(duì)4.3.2.1 利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，提高毒蛋白殺蟲毒力 第54頁(yè)/共73頁(yè)Cry1Aa蛋白結(jié)構(gòu)，18- 19loop及與其

8、相鄰的殘基4.3.2.1 利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，提高毒蛋白殺蟲毒力 第55頁(yè)/共73頁(yè)4.3.2.1 利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，提高毒蛋白殺蟲毒力 第56頁(yè)/共73頁(yè)Bt4基因組易錯(cuò)PCRCry1AcPCR回收TA克隆篩選PCR回收pET28aBL21表達(dá)毒素基因cry1Ac核心區(qū)改組文庫(kù)通過易錯(cuò)PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第57頁(yè)/共73頁(yè)突變子的表達(dá)1、對(duì)照Cry-B(1Ac）2、突變子T524N 3、Cry-B陰性對(duì)照 M、Maeker通過易錯(cuò)PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第58頁(yè)/共73頁(yè)通過易錯(cuò)PCR和DNA shufflin

9、g定向改造毒蛋白，提高毒力 第59頁(yè)/共73頁(yè)16小時(shí)32小時(shí)對(duì)照vip3基因在Bt無晶體突變株XBU001中的表達(dá)4.3.3 工程菌構(gòu)建 4.3.3.1 中vip基因的克隆表達(dá)及重組殺蟲工程菌構(gòu)建 第60頁(yè)/共73頁(yè)4.3.3.2 攜帶異源毒素基因的Bt工程菌的構(gòu)建 pH5AXI（ hwtx-XI ）在菌株中的表達(dá) 1,Bt4.0718; 2-4, Bt4.0718(pH5AXI). 第61頁(yè)/共73頁(yè)采用EGFP抗體(A)和-ACTX 抗體(B)對(duì)Cry1Ac-ACTX-Hv1a-egfp融合蛋白的Western-blot檢測(cè) 工程菌伴胞晶體的原子力顯微鏡檢測(cè)A、Cry1-B(1Ac-AC

10、TX-EGFP) B、Cry1-B(1Ac）4.3.3.2 攜帶異源毒素基因的Bt工程菌的構(gòu)建 第62頁(yè)/共73頁(yè)5.蘇云金芽胞桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究 5.1 Bt殺蟲晶體蛋白質(zhì)組研究 第63頁(yè)/共73頁(yè) A B C D（A）、Bt武漢亞種（B）、和以色列亞種H14(C)、伴胞晶體殺蟲晶體蛋白的雙向電泳及其與HD-1殺蟲晶體蛋白的gel spot的匹配圖譜(D)5.2 不同亞種殺蟲晶體蛋白的比較蛋白質(zhì)組研究 第64頁(yè)/共73頁(yè)菌株Bt4.0718菌株、Bt庫(kù)斯塔克亞種HD-1Bt以色列亞種H14武漢亞種140斑點(diǎn)數(shù)1229126 1129025220105.2 不同亞種殺蟲晶體蛋白的比較蛋白質(zhì)組研

11、究 第65頁(yè)/共73頁(yè)5.2 不同亞種殺蟲晶體蛋白的比較蛋白質(zhì)組研究 第66頁(yè)/共73頁(yè)5.3 Bt工程菌株殺蟲晶體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 A B Bt4（Phah43）（A）、XBU001(pHTAcS60)（B）晶體蛋白的雙向電泳圖第67頁(yè)/共73頁(yè)NoImage 對(duì)部分特征蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行原位酶解、肽質(zhì)量指紋圖分析，鑒定到Bt菌株和轉(zhuǎn)Bt菌株含有Cry1Aa，Cry1Ac等蛋白，還發(fā)現(xiàn)第四期芽胞蛋白A，翻譯延伸因子-Tu，丙氨酸脫氫酶，丙酮酸脫氫酶E1復(fù)合物，亞單位，伴侶蛋白DnaK，ATP合成酶鏈，丙酮酸脫氫酶E3復(fù)合物等部分伴侶蛋白。如下表所示：5.3 Bt工程菌株殺蟲晶體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 第68頁(yè)/共73頁(yè)5.4