液相色譜手性物質(zhì)分離工作總結(jié)

1、手性分析工作總結(jié) 2010.09.10 朱萬夏 一.手性現(xiàn)象的介紹 二.儀器手性拆分方式 三.液相手性柱分析方法開發(fā)流程 四.工作中的一些實(shí)例討論一.手性現(xiàn)象的介紹 概念：問:什么是手性？答:分子組成與構(gòu)造完全相同但分子的立體結(jié)構(gòu)不同的化合物,他們不能完全疊合卻互為鏡像,(如左手與右手),這種特性就叫手性手性(chirality)。而這兩個(gè)互為物體與鏡像關(guān)系的立體異構(gòu)體,稱為對(duì)映異構(gòu)體對(duì)映異構(gòu)體 (enantiomers)。等量對(duì)映體的混合物，其旋光性相互抵消，沒有旋光能力，稱為外消旋體外消旋體。 CCCOOHOHHCH3HOOCHOCH3HCH3CHCOOHOH乳酸 手性分子的研究歷史180

2、1年 Hauy發(fā)現(xiàn)水晶晶體顯示半面現(xiàn)象。1809年 Malus觀察到水晶晶體引起的偏光效應(yīng)。1812年 Biot發(fā)現(xiàn)了水晶片的旋光性1815年 Biot將研究延伸到有機(jī)物及其溶液，發(fā)現(xiàn)除石英外樟腦、檸檬油、 松節(jié)油等酒精溶液以及蔗糖、酒石酸水溶液劑許多液體有機(jī)化合物 具有旋光性。 1848年 Pasteur在28歲時(shí)，研究酒石酸鈉時(shí)發(fā)現(xiàn)有兩種晶體。他在放大鏡下 根據(jù)晶形的不同用鑷子將其分成兩份，配制成溶液測旋光，發(fā)現(xiàn)一 左旋、一右旋。又從結(jié)構(gòu)上推想和分子結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱聯(lián)系起來，認(rèn) 為一物一像。（歷史上第一個(gè)手性拆分實(shí)驗(yàn)）1874年 J.H. vant Hoff提出C四面體學(xué)說，記為： 如果一個(gè)C

3、上連有四個(gè)不同基因，在空間有兩種排列，表示有二 種不同的構(gòu)型。二種構(gòu)型之間為物象關(guān)系：外形相似，但不能重 合。 不對(duì)稱C原子數(shù)目（n）與立體異構(gòu)體數(shù)之間的關(guān)系為2n1966年 Lngold和V.Prelog分析討論了旋光性與分子結(jié)構(gòu)間的關(guān)系，建議將 分子本身與其鏡像不能重合的分子，定義為手性分子手性分子。 分子的手性與處于手性部分的一個(gè)或一個(gè)以上的特定原子有關(guān)，使分子具有手性的幾何因素有手性中心、手性軸和手性面手性中心、手性軸和手性面。手性中心：能引起分子具有手性的一個(gè)原子或者分子骨架的 中心，最常見的是手性碳手性碳；值得注意的是：多價(jià)雜原子 B,N,P,S等也可形成手性中心。手性軸：分子中若

4、干原子組成軸狀結(jié)構(gòu)，因分子中的一些原子或基團(tuán)在此軸周圍的空間排列不同而產(chǎn)生手性。手性面：分子的手性由于某些基團(tuán)對(duì)分子中的某一平面的不同分布而引起。CCCCabdc手性中心612345手性軸手性面螺幾省CabcdNabcSbac 對(duì)映異構(gòu)體特性:物理化學(xué)性質(zhì)上： 具備相同 的熔沸點(diǎn),溶解度，紫外，紅外，核磁，質(zhì)譜等,僅旋光方向相反。鑒別：XRD,XRPD生物活性上：可能有著巨大差異。OCH2CHCH2NHCH*OHCH3CH3Propranolol（萘心安）S-異構(gòu)體為治療心臟病藥物心得安R-異構(gòu)體為避孕藥NNHOOOO*R-(+)-苧烯L-(-)-苧烯* 桔子味 檸檬味OOHHOH2NNH2S

5、-天冬酰胺 甜的 苦的R-天冬酰胺NH2H2NOHOHOThalidomideR-異構(gòu)體為鎮(zhèn)靜藥（反應(yīng)停）S-異構(gòu)體有致畸胎作用對(duì)映體的不同生理活性對(duì)映體的不同生理活性 20世紀(jì)世紀(jì)90年代后，許多國家規(guī)定，凡結(jié)構(gòu)中具年代后，許多國家規(guī)定，凡結(jié)構(gòu)中具有不對(duì)稱因素的藥物，即有不對(duì)稱因素的藥物，即“手性藥物手性藥物”，必須必須拆分拆分其相應(yīng)的立體異構(gòu)體，并其相應(yīng)的立體異構(gòu)體，并分別研究分別研究其藥理、其藥理、毒理和藥物代謝性質(zhì)。對(duì)已上市的消旋體藥物，毒理和藥物代謝性質(zhì)。對(duì)已上市的消旋體藥物，要要重新評(píng)價(jià)重新評(píng)價(jià)其光學(xué)異構(gòu)體的性質(zhì)。對(duì)新申報(bào)的其光學(xué)異構(gòu)體的性質(zhì)。對(duì)新申報(bào)的藥品，一開始就要合成其光學(xué)異

6、構(gòu)體。藥品，一開始就要合成其光學(xué)異構(gòu)體。手性拆分在其他領(lǐng)域的應(yīng)用： 農(nóng)用化學(xué) 化妝品、香水、香料 營養(yǎng)品(人和動(dòng)物) 光學(xué)材料（如光電子用手性液晶）二.儀器手性拆分方式 高效液相色譜高效液相色譜 (HPLC) 氣相色譜 (GC) (樣品需具有一定的揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性） 毛細(xì)管電泳(HPCE) 超臨界流體色譜（SFC) 薄層色譜（TLC，定性）手性色譜柱的發(fā)展史1939年Henderson和Rule在乳糖上色譜分離外消旋樟腦衍生物1952年Dalgliesh：提出氨基酸在紙色譜上光學(xué)分離的三點(diǎn)作用假設(shè) 1966年Gil-Au等：用GC直接分離對(duì)映體 1971年Davankov和Rogozhin：引

7、入手性配體交換色譜 1972年Wulff和Sarhan：制備出手性LC的酶模擬聚合物 1973年Hesse和Hagel：制備出手性拆分的纖維素三乙酸酯 1973年Stewart和Dherty：把瓊酯糖鍵合的牛血清清蛋白（BSA）用于手性 拆分 1974年Blaschke：由光學(xué)活性單體合成出用手性LC的手性聚合物 1975年Gram等：用手性冠醚發(fā)展出主-客體色譜 1979年P(guān)irkle和House：合成出第 一個(gè)硅膠鍵合手性固定相，并應(yīng)用于手 性LC分離 1979年Okamoto等：合成出手性LC的螺旋形聚合物 1982年Allenmark等：把瓊酯鍵合的BSA用于手性LC 1983年Her

8、mansson：把硅膠鍵合的a1-酸糖蛋白用于手性拆分 1984年Armstrong和DeMond：制備出硅膠鍵合環(huán)糊精固定相 過去過去100年：拆分約年：拆分約7000種手性化合物種手性化合物手性色譜：已拆分近萬種手性化合物手性色譜：已拆分近萬種手性化合物液相色譜中的手性固定相已研制液相色譜中的手性固定相已研制100多種多種HPLC分離方式：直接法（CMPA、CSP）：n手性固定相法手性固定相法 是由具有光學(xué)活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相，通過引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異，從而達(dá)到光學(xué)異構(gòu)體拆分的目的。n手性流動(dòng)相添加劑法： 流動(dòng)相中加入手性添加劑，在普通

9、固定相上吸附，形成短暫的手性環(huán) 境并對(duì)對(duì)映異構(gòu)體間進(jìn)行手性識(shí)別而達(dá)到分離。（環(huán)糊精，萬古霉 素，手性金屬配合劑等）間接法（CDR）：n手性試劑衍生法： 流動(dòng)相對(duì)映體混合物在預(yù)處理中進(jìn)行柱前衍生組成一對(duì)非對(duì)映體(Diastereoisomers)，依其理化性質(zhì)的差異，在非手性柱上得以分離。常用的衍生試劑：異硫氰酸脂類，酰氯類等三種方法比較優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)手性固定相手性固定相法法1.適用范圍廣2.分離制備簡便3.定量分析可靠性高1.需特殊的固定相，價(jià)格昂貴2.少量樣品依然需要柱前衍生（不一定是手性衍生化試劑）手性流動(dòng)相添加劑法1.固定相簡單2.非對(duì)映異構(gòu)體化具可逆1.拆分化合物有限2.某些添加劑不夠穩(wěn)定手

10、性試劑衍生法1.固定相流動(dòng)相簡單2.有利于增加紫外或熒光靈敏度1.高純衍生化試劑2.異構(gòu)體間衍生速率無法保證3.不可逆破壞 Dalgliesh: 要實(shí)現(xiàn)手性識(shí)別，手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種相互作用。這種相互作用包括氫鍵、偶級(jí)-偶級(jí)作用、-作用、靜電作用、疏水作用或空間作用,并且其中至少有一種作用具有立體選擇性。 相互作用強(qiáng)，保相互作用強(qiáng)，保留長，后出峰留長，后出峰相互作用弱，保相互作用弱，保留短，先出峰留短，先出峰基體(S)-選擇子(R)-溶質(zhì)基體(S)-溶質(zhì)(S)-選擇子手性固定相法拆分機(jī)理2 手性分離效果是多種相互作用共同作用的結(jié)果。這些相互作用通過影響包埋復(fù)合物的形成，特

11、殊位點(diǎn)與分析物的鍵合等而改變手性分離結(jié)果。由于這種作用力較微弱，因此需要仔細(xì)調(diào)節(jié)、優(yōu)化流動(dòng)相和溫度以達(dá)到最佳分離效果。手性固定相分類手性固定相分類 刷（Brush）型或稱為Prikle型 聚合物固定相（如纖維素、淀粉，合成的手性聚聚合物固定相（如纖維素、淀粉，合成的手性聚合物）合物） 大環(huán)手性固定相（環(huán)糊精、手性冠醚、大環(huán)抗生素） 蛋白質(zhì)（Protein）型 配體交換（Ligand exchange）型 分子印跡固定相CelluloseAmyloseDipole-dipolestackingHydrogen bond-OOOOORRRRRRNHHHHHNNXYHydrogen bondCell

12、uloseAmylose（rigid & linear）（helical）OOOHOHHOnOOHOnOHOHOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO柱型號(hào)固定相，官能團(tuán)拆分化合物類型Chiralpak ODCellulose-1（phenomenex）纖維素三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）含有芳香基、酰胺基、羰基、硝基、氨基、磺?；?、氰基、羧基、羥基等化合物的分離，及具有不對(duì)稱點(diǎn)的位阻大的化合物的分離Chiralpak AS淀粉三（S）-甲基苯基氨基甲酸酯Chiralcel AD淀粉三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）Chiralcel OJ纖維素三（4-甲基苯基甲酸酯）Chiralpak I

13、A淀粉三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）Chiralpak IC纖維素三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）市售常用的手性色譜柱：Daicel的“四大金剛”及新型的鍵合相系列，Phenomenex的Cellulose-1三.液相手性拆分方法流程液相手性方法開發(fā)的基本配置：液相部分：四元泵，DAD檢測器手性色譜柱若干（150mm*4.6mm，5um）柱選擇器（最好帶溫控）流動(dòng)相:涂敷型：Hexane, Heptane, EtOH, IPA，ACN，MeOH（少量混合使用）添加劑：TFA，MSA，ESA(離子對(duì)),DEA，MEA，(HAC，HCOOH,丁胺)常備的配置的流動(dòng)相（14種）：Hexane,

14、Hexane(0.1%TFA), Hexane(0.1%DEA),Hexane(5%EtOH,0.1%MSA), Hexane(5%EtOH,0.1%MEA)EtOH, EtOH(0.1%TFA), EtOH(0.1%DEA)IPA, IPA(0.1%TFA), IPA(0.1%DEA), ACN，MEOH流動(dòng)相：鍵合型（8種）THF，MtBE，CHCl3，CH2Cl2乙酸乙酯，乙酸乙酯，1,4-二氧環(huán)乙烷，丙酮二氧環(huán)乙烷，丙酮, 甲苯（紫外吸收強(qiáng)）甲苯（紫外吸收強(qiáng)）添加劑與流動(dòng)相的互溶性及PH耐受范圍 強(qiáng)酸（例如：MSA），強(qiáng)堿（MEA，EDA ）的添加劑在加入到流動(dòng)相中時(shí)，需要考察其溶解度

15、，考慮色譜柱PH的耐受范圍,一般來說，添加量都不要超過0.5%。 例如：MSA只在含5%EtOH的正己烷中才能溶解，且添加的量占流動(dòng)相的總體積的比例不能超過0.1%。一般為0.05%。同樣MEA在正己烷中也難溶，需要加入其它中等極性的溶劑助溶。 DAD檢測器的功用：1.更易選擇最佳吸收波長。2.在沒有消旋體的情況下，通過比對(duì)光譜掃描圖，輔助判斷是否為對(duì)映異構(gòu)體。3.判斷峰純度，是否與非手性雜質(zhì)完全分離。注：完全一致的光譜掃描圖，并不一定是對(duì)映異構(gòu)體，也可能是結(jié)構(gòu)類似的化合物。方法步驟：方法步驟： 了解待分離化合物樣品結(jié)構(gòu)信息 了解化合物反相色譜信息 樣品前處理 選擇合適的手性固定相（手性分析柱

16、） 優(yōu)化流動(dòng)相，柱溫 了解待分離化合物樣品結(jié)構(gòu)信息： 手性方法建立的第一步為檢查待測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，盡可能地獲取樣品的如下信息在不同溶劑中的溶解性。形成氫鍵、鍵或者偶極相互作用的能力；是否有極性官能團(tuán)（是否含氨基NH2-、羧基-COOH或者既含酸性基團(tuán)又有堿性基團(tuán)）；手性中心附近有無大的剛性取代基；紫外光譜可否檢測，酸堿是否穩(wěn)定等。諸如此類的樣品結(jié)構(gòu)信息對(duì)預(yù)判手性分離能力及手性固定相的選擇有較大的幫助作用。 了解樣品反相色譜信息： 如果合成人員提供反相色譜信息，可以知道其樣品的純度。也可以根據(jù)流動(dòng)相條件來確定手性分離中烷烴與醇的比例，甚至依此判定以及是否需要添加酸堿添加劑。樣品前處理：1.12m

17、g EtOH，MeOH溶解。2.如難溶，且為鹽，加入酸堿添加劑助溶。酸堿總濃度不要大于1%，且要有空白對(duì)照。3.也可以先以少量DMSO，DMF，CHCl2溶解，然后再用流動(dòng)相稀釋至不析出為止。4.如果樣品紫外吸收很弱，則需加大樣品濃度至10mg/ml.5.無紫外吸收，換檢測器：ELSD或MS，或者讓合成人員接生色基團(tuán)。6.過濾進(jìn)樣。 選擇合適的手性柱： 從手性固定相對(duì)樣品的通用性，適應(yīng)范圍考慮。如果是制備服務(wù)，在選擇手性柱時(shí)還應(yīng)考慮柱容量（柱樣品荷載量）。 各商品化的手性柱使用順序大致為： IA（或AD-H）,IC，OD-H，AS-H，OJ-H 流動(dòng)相條件優(yōu)化 以無水乙醇/正己烷為初始流動(dòng)相，

18、比例通過調(diào)整流動(dòng)相中醇的含量或者改變醇的種類來增強(qiáng)對(duì)映體分離選擇性。如果酸堿樣品只有部分分離、沒有分離或者峰形差、不出峰，可在流動(dòng)相中添加有機(jī)酸、堿等改性劑來優(yōu)化分離。涂敷型涂敷型中性：Hexane：EtOH=70：30(V/V%)，流速：0.8ml/min酸性：含有-COOH，加入TFA堿性：含有-NH2，-NH-加入DEA，如峰形沒有改善，可加 入叔丁胺或者M(jìn)EA酸堿基團(tuán)都有：加入TFA，或者TFA與DEA混合的鹽或MSA(0.1%)添加劑含量0.05%0.3%。鍵合型鍵合型： 柱溫考察：常規(guī)溫度加減1015度1.常規(guī)條件：30度2.低溫：15度3.高溫：40度流動(dòng)相的極性：常用溶劑極性表

19、.xls流動(dòng)相的互溶性：溶劑互溶表.pdf常用溶劑物性必備常用溶劑物性必備四.手性分離的特殊例子手性分離min101520253035mAU 02004006008001000 VWD1 A, Wavelength=220 nm (201004201004270000006.D) 14.919 16.196 26.225Hexane：IPA=99：1(v/v%)NNONHOSiBoc改為梯度模式，220nm下，極小的基線漂移。min051015202530354045mAU 0100200300400500600 VWD1 A, Wavelength=220 nm (2010042010042

20、71R3R 2010-04-27 17-30-46DATA0005.D) 22.172 23.677 34.135 34.912 min01020304050mAU 0255075100125150175 VWD1 A, Wavelength=230 nm (201005112010-05-11 14-15-200000001.D)min01020304050mAU -4-2024681012 VWD1 A, Wavelength=230 nm (201005112010-05-11 14-15-200000001.D)Time%B(EtOH)FlowMax. Press.10.0095.00

21、.80060Bar220.0085.00.800320.1070.00.800430.0070.00.800530.1050.00.600645.0050.00.600752.0095.00.600860.0095.00.800注意：檢測波長最好不小于215nm強(qiáng)酸性添加劑：MSAmin051015202530354045mAU -20-15-10-50510 VWD1 A, Wavelength=230 nm (201006180000001.D)Chiralpak AS-H, 250mm*4.6mm, 5um EtOH(0.1%TFA) 0.6ml/minONHOClClClOSOOHOm

22、in051015202530354045mAU 020406080100120140 VWD1 A, Wavelength=214 nm (201006231R3R 2010-06-23 09-37-21DATA0001.D) 34.530 39.769Hexane:EtOH:MSA=82:18:0.1(v/v%) 1.0ml/minmin05101520253035mAU -250255075100125150175 VWD1 A, Wavelength=230 nm (201006070000006.D) 24.507 31.246 33.080Chiralpak IA, 250mm*4.

23、6mm, 5um.Mobile phase: Hexane: EtOH(0.1%DEA)=85:15Flow=0.8ml/minNONNNH換成酸性流動(dòng)相min02.557.51012.51517.52022.5mAU 020406080100 VWD1 A, Wavelength=220 nm (201007010000004.D) 17.292 20.124柱平衡中的問題min0123456789mAU -500-400-300-200-1000100200 VWD1 A, Wavelength=215 nm (201005280000004.D) 6.895 8.152min012345

24、6789mAU -400-2000200 VWD1 A, Wavelength=215 nm (201005280000005.D) 7.115 8.558ONOBocChiralpak IAHexane: IPA: DEA=95:5:0.11.如果有條件，將用酸堿添加劑的色譜柱分開使用。如果有條件，將用酸堿添加劑的色譜柱分開使用。2.使用堿性流動(dòng)相，可以先用使用堿性流動(dòng)相，可以先用EtOH：Hexane=50：50 0.6ml/min的流速?zèng)_洗的流速?zèng)_洗3.酸性，可以用少量堿中和，然后再用酸性，可以用少量堿中和，然后再用2中溶液沖洗中溶液沖洗4.如果更換流動(dòng)相體系，不建議直接用所需的流動(dòng)相平衡，中間最好以烷烴過渡。如果更換流動(dòng)相體系，不建議直接用所需的流動(dòng)相平衡，中間最好以烷烴過渡。配置流動(dòng)相的注意事項(xiàng) 在手性方法開發(fā)時(shí)，由于流動(dòng)相中添加劑導(dǎo)致的基線噪