CE-SDS與SEC-HPLC比較ppt

1、Page : 1 CE-SDS(非還原）與SEC-HPLC方法比較報(bào)告人：袁梵雨、謝敏、婁昆、陳小龍Page : 2 CE-SDS(CE-SDS(非還原法）非還原法）原理簡(jiǎn)介：原理簡(jiǎn)介：毛細(xì)管電泳是以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道。毛細(xì)管內(nèi)先填充凝膠，此時(shí)凝膠會(huì)在毛細(xì)管內(nèi)形成分子篩，樣品依分子量的大小在毛細(xì)管內(nèi)移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離，能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。Page : 3 CE-SDS(非還原）非還原）儀器組成毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)包括進(jìn)樣、填灌毛細(xì)管電泳系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)包括進(jìn)樣、填灌/清洗、電流回路、毛細(xì)管清洗、電流回路、毛細(xì)管/溫溫度控制、檢測(cè)度控制、檢

2、測(cè)/記錄記錄/數(shù)據(jù)處理等部分。數(shù)據(jù)處理等部分。Page : 4 CE-SDS(非還原）非還原）檢測(cè)器檢測(cè)器Page : 5 CE-SDS(非還原）非還原）進(jìn)樣方式1. 流體力學(xué)進(jìn)樣方式流體力學(xué)進(jìn)樣方式 （1）進(jìn)樣端加壓）進(jìn)樣端加壓 （2）出口端抽真空）出口端抽真空 （3）虹吸進(jìn)樣）虹吸進(jìn)樣進(jìn)樣量：毛細(xì)管長(zhǎng)度的進(jìn)樣量：毛細(xì)管長(zhǎng)度的1%-2%；nL級(jí)、非常小；級(jí)、非常??；2. 電動(dòng)進(jìn)樣方式電動(dòng)進(jìn)樣方式毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓。毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓。3. 擴(kuò)散進(jìn)樣擴(kuò)散進(jìn)樣 試樣通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分離柱端口處。試樣通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分離柱端口處。Page : 6 CE-SDS(非還原）非還原）

3、工作電壓的確定1、在電泳條件下，改變電壓（或電流）測(cè)定對(duì)應(yīng)的電流（或電壓）、在電泳條件下，改變電壓（或電流）測(cè)定對(duì)應(yīng)的電流（或電壓）2、做電壓、做電壓電流曲線電流曲線3、取線性關(guān)系中的最大電壓（或電流），作為分離電壓（或電流）。線性、取線性關(guān)系中的最大電壓（或電流），作為分離電壓（或電流）。線性以上的電壓，焦耳熱效應(yīng)過大，一般不宜選用。但如果分離效率很高，就可以上的電壓，焦耳熱效應(yīng)過大，一般不宜選用。但如果分離效率很高，就可以選用，以便加快分離速度。在做以選用，以便加快分離速度。在做CGE時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)控制在時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)控制在150400V/cm之間，否則容易導(dǎo)致凝膠的破壞。之間，否則容易導(dǎo)

4、致凝膠的破壞。電泳溫度的選擇電泳溫度的選擇，主要是指毛細(xì)管外表溫度的選擇與控制。溫度變化不僅影電泳溫度的選擇，主要是指毛細(xì)管外表溫度的選擇與控制。溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮：熱效應(yīng)控制、重現(xiàn)響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮：熱效應(yīng)控制、重現(xiàn)性控制、分離效率控制盒分離介質(zhì)對(duì)溫度的限制等因素。多數(shù)情況下，在性控制、分離效率控制盒分離介質(zhì)對(duì)溫度的限制等因素。多數(shù)情況下，在2030之間進(jìn)行電泳，就能獲得良好的分離結(jié)果。之間進(jìn)行電泳，就能獲得良好的分離結(jié)果。Page : 7 各試劑的作用各試劑的作用SDS-MW Sample Buffer： 由于蛋白是

5、兩性的，與SDS結(jié)合會(huì)使蛋白帶負(fù)電荷，使其在毛細(xì)管中往正極方向移動(dòng)。內(nèi)參蛋白溶液：指示遷移時(shí)間的變化。碘乙酰胺：與游離巰基反應(yīng)，防止其攻擊二硫鍵導(dǎo)致片段增多。樣品處理：樣品處理：在1.5mL離心管中加入SDS-MW Sample Buffer 50L，內(nèi)參蛋白溶液2L，碘乙酰胺溶液10L振蕩混勻。取供試品溶液（2.5mg/L）40L，振蕩混勻。將離心管置于70水浴加熱10min，再次振蕩混勻，室溫冷卻。3000rpm離心60s，取上清液90L至PCR管中。CE-SDS(CE-SDS(非還原）非還原）Page : 8 2010版中國藥典對(duì)儀器的一般要求：版中國藥典對(duì)儀器的一般要求：毛細(xì)管：彈性石

6、英毛細(xì)管，內(nèi)徑50m和75 m使用較多。根據(jù)分離度要求，可選用20cm-100cm長(zhǎng)度。CE-SDS(CE-SDS(非還原）非還原）直流高壓電源：直流高壓電源：采用采用0-30kV（或相近）可調(diào)節(jié)直流電源，可供應(yīng)約（或相近）可調(diào)節(jié)直流電源，可供應(yīng)約300 A電流。具有穩(wěn)壓和穩(wěn)流兩種方式可供選擇。電流。具有穩(wěn)壓和穩(wěn)流兩種方式可供選擇。沖洗進(jìn)樣系統(tǒng)：沖洗進(jìn)樣系統(tǒng)：每次進(jìn)樣之前毛細(xì)管要用不同溶液沖洗。進(jìn)樣方式有壓力進(jìn)每次進(jìn)樣之前毛細(xì)管要用不同溶液沖洗。進(jìn)樣方式有壓力進(jìn)樣，負(fù)壓進(jìn)樣，虹吸進(jìn)樣和樣，負(fù)壓進(jìn)樣，虹吸進(jìn)樣和電動(dòng)進(jìn)樣電動(dòng)進(jìn)樣。通過控制壓力或電壓及時(shí)間來控制進(jìn)。通過控制壓力或電壓及時(shí)間來控制進(jìn)樣

7、量。樣量。檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)系統(tǒng)：將毛細(xì)管接近出口端的外層聚合物剝?nèi)⒚?xì)管接近出口端的外層聚合物剝?nèi)?mm一段，使石英壁裸露一段，使石英壁裸露，毛細(xì)管一側(cè)放置一個(gè)石英聚光球，使光源聚集在毛細(xì)管上，透過毛細(xì)管達(dá)，毛細(xì)管一側(cè)放置一個(gè)石英聚光球，使光源聚集在毛細(xì)管上，透過毛細(xì)管達(dá)到光電池。對(duì)無光吸收或熒光的溶質(zhì)的檢測(cè)，還可采用間接測(cè)定法，即在操到光電池。對(duì)無光吸收或熒光的溶質(zhì)的檢測(cè)，還可采用間接測(cè)定法，即在操作緩沖液中加入對(duì)光有吸收或熒光的添加劑，在溶質(zhì)到達(dá)檢測(cè)窗口時(shí)出現(xiàn)反作緩沖液中加入對(duì)光有吸收或熒光的添加劑，在溶質(zhì)到達(dá)檢測(cè)窗口時(shí)出現(xiàn)反方向的峰。方向的峰。Page : 9 對(duì)電泳實(shí)驗(yàn)的影響因素 緩沖

8、液pH：pH能影響樣品的解離能力，樣品在極性強(qiáng)的介質(zhì)中離解度增大，電泳速度也隨之增大，從而影響分離選擇性和分離靈敏度。 CE-SDS(非還原）非還原）高電壓高電壓低電壓低電壓優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)是實(shí)現(xiàn)CE快速、高效的前提，電壓升高，樣品的快速、高效的前提，電壓升高，樣品的遷移加大，分析時(shí)間縮短遷移加大，分析時(shí)間縮短分離電壓越低，分離效果越好分離電壓越低，分離效果越好缺點(diǎn)缺點(diǎn)毛細(xì)管中焦耳熱增大，基線穩(wěn)定性降低，靈敏度毛細(xì)管中焦耳熱增大，基線穩(wěn)定性降低，靈敏度降低降低分析時(shí)間延長(zhǎng)，峰形變寬，導(dǎo)致分離效分析時(shí)間延長(zhǎng)，峰形變寬，導(dǎo)致分離效率降低率降低 分離電壓： 溫度 ：溫度影響分離重現(xiàn)性和分離效率。溫度升

9、高，緩沖液粘度 降低，分析時(shí)間減短，分析效率提高。但溫度過高，會(huì)引起毛細(xì)管柱內(nèi) 徑向溫差增大，焦耳熱效應(yīng)增強(qiáng)，柱效降低，分離效率也會(huì)降低。 Page : 10 SEC-HPLCSEC-HPLC體積排阻色譜(SEC)是利用多孔凝膠固定相的獨(dú)特特性，而產(chǎn)生的一種主要依據(jù)分子尺寸大小的差異來分離的液相色譜方法。簡(jiǎn)介：簡(jiǎn)介：分離機(jī)理：分離機(jī)理：固定相是多孔性凝膠，大分子大分子不能進(jìn)入凝膠孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，首先被洗脫出來；中等大小的分中等大小的分子子能進(jìn)入凝膠中一些適當(dāng)?shù)目锥粗校荒苓M(jìn)入更小的微孔，在柱中受到滯留，較慢地被洗脫出來；小分子小分子可進(jìn)入凝膠中絕大部

10、分孔洞，在柱中受到更強(qiáng)的滯留，會(huì)更慢地被洗脫出。Page : 11 圖示Page : 12 儀器：高效液相色譜儀需定期檢定，周期為1年。SEC-HPLCSEC-HPLC2010版中國藥典版中國藥典對(duì)儀器的一般要求和色譜條件對(duì)儀器的一般要求和色譜條件色譜柱：多使用凝膠或親水剛性、多孔微球、機(jī)械強(qiáng)度好的聚合物等填充物使用水或緩沖鹽作為流動(dòng)相，流動(dòng)相的pH值一般控制在28之間。流速一般在0.51.0ml/min檢測(cè)器：常用UV（紫外-可見）檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)通常為280nm。Page : 13 SEC-HPLC 柱效率N：色譜柱的效率可借用“理論塔板數(shù)”N進(jìn)行描述。 分離度分離度R：判斷物質(zhì)在色譜柱中

11、的分離情況：判斷物質(zhì)在色譜柱中的分離情況,常作為柱的總分離效能指標(biāo)。常作為柱的總分離效能指標(biāo)。 式中，式中，tR1， tR2分別為對(duì)應(yīng)于峰分別為對(duì)應(yīng)于峰1和峰和峰2的保留時(shí)間；的保留時(shí)間； W1，W2分別為峰分別為峰1和峰和峰2的峰底寬的峰底寬色譜柱性能評(píng)價(jià)的兩個(gè)重要參數(shù)N=16(tR/W)2 =5.54(tR/W1/2)2tR 為保留時(shí)間；為保留時(shí)間；W代表峰寬；代表峰寬；W1/2 ：半高峰寬，通過峰高的中點(diǎn)作平行于：半高峰寬，通過峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離。峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離。R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) Page

12、: 14 SEC-HPLC 色譜柱填料的孔徑大小及其粒徑分布均勻性 孔徑太小，待測(cè)物不易流出，分析時(shí)間長(zhǎng)，展寬嚴(yán)重 ?？讖教髣t很可能導(dǎo)致組分分不開。在做凝膠色譜時(shí)，先大致估計(jì)下待分析物的分子量，然后選擇合適的柱子，如果不知道粒徑，可先用大孔徑的先試試，接著再用小粒徑的以達(dá)到更高的精度。 流動(dòng)相 凝膠色譜中流動(dòng)相的影響不像別的色譜（如反相or離子色譜)那么明顯。其中主要影響的是流動(dòng)相的流速，一般流速越大，出峰越快，但分離效果可能不是很好。 色譜柱高度和直徑 色譜柱越長(zhǎng)，樣品組分分的越開，但過長(zhǎng)時(shí)會(huì)消耗太多的溶劑，而且柱展寬等也容易變的嚴(yán)重。色譜柱直徑太大時(shí)，樣品沿徑向的分布容易不均勻，容易出現(xiàn)

13、柱中心處比柱四周跑的快，從而增加了展寬。影響色譜分離因素Page : 15 兩種檢測(cè)方法的結(jié)果評(píng)定實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法系統(tǒng)適用性系統(tǒng)適用性樣品樣品SEC-HPLC1.參考品主峰面積百分比參考品主峰面積百分比RSD2%2.參考品保留時(shí)間參考品保留時(shí)間SD0.2min3.參考品理論塔板數(shù)參考品理論塔板數(shù)2000參照以往樣品和本次系統(tǒng)適參照以往樣品和本次系統(tǒng)適應(yīng)性條件而定應(yīng)性條件而定CE-SDS1.內(nèi)參峰出峰時(shí)間內(nèi)參峰出峰時(shí)間4.35.3min2.參考品純度在首次檢測(cè)結(jié)參考品純度在首次檢測(cè)結(jié)果的果的1%范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。內(nèi)參峰出峰時(shí)間內(nèi)參峰出峰時(shí)間4.35.3minPage : 16 抗體結(jié)構(gòu)IgGPag

14、e : 17 HLHHHHLMinutes02468101214AU0.000.050.10(Peak 4.817 Minutes)LCHCHLHHHHLIgG PDA - 220nmDP(light,49h)_GB232-20121102NameLCHCPage : 18 Minutes02468101214AU0.000.050.10(Peak 4.817 Minutes)LCHCHLHHHHLIgG PDA - 220nmDP(light,49h)_GB232-20121102NameMinutes02468101214AU0.000.050.10(Peak 4.825 Minutes)

15、LCHLHHHHLIgGPDA - 220nmDP(dark,49h)_GB232-20121102NameHMW(11.9%)HMW(7.4%)HMW（0.9%）Page : 19 兩種方法例證比較批號(hào)批號(hào)試驗(yàn)點(diǎn)試驗(yàn)點(diǎn)面積百分比結(jié)果面積百分比結(jié)果(%)CE-SDSSEC-HPLCHMWIgGLMWHMWMain PeakLMWGB232-201211020點(diǎn)點(diǎn)097.432.570.799.10.140，10天天096.013.991.496.62.040，20天天0.2794.635.101.795.62.740，30天天0.3193.336.361.994.83.3Page : 20 SEC-HPLC示例圖如下示例圖如下CE-SDSDP(40，30天)_GB232-20121102DP(40，20天)_GB232-20121102DP(40，10天)_GB232-20121102DP_GB232-20121102HMWLMWPage : 21 總結(jié)：總結(jié)：實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)時(shí)間準(zhǔn)備時(shí)間樣品量進(jìn)樣量分離效果SEC-HPLC16min1.5hNA30g/100g在分子量大的范圍內(nèi)分離效果相對(duì)比較好CE-SDS41