WB實驗步驟詳細總結(jié)

1、蛋白提?。ㄈ坎僮髟诒线M行）1. 裂解1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20保存，提前一天4解凍）取2ml裂解液，加20l PMSF混勻2) 稱取30mg組織，切碎放入標記好的AP管中，加入600l上述1中液體（加入液體與組織比例為20：1），冰上靜置10min2. 勻漿先用超純水潤洗一下勻漿機的鋼頭，（同時進行幾組勻漿時，組間也要潤洗鋼頭）在勻漿機（在生化室）上每次勻漿10s，兩次（間隔5s），冰上靜置30min3. 離心（在基礎(chǔ)4樓416室）1) 自帶1ml槍以及藍槍頭和黃槍頭，三個1.5的離心管（，兩個標記，加少量超純水，號是為了離心平衡，對稱放置）2) 將離

2、心機預(yù)冷至4為止，以1200×10r/min離心15min3) 用移液槍將上層清液取出放入號管中4. 變性（上樣緩沖液：樣品=4：1）將樣品轉(zhuǎn)移至23個0.5mlAP管中加上樣緩沖液，100變性10min儀器屏幕：S500：10S5100000：10時間（時：分鐘）溫度（）5. 保存變性結(jié)束后，打開AP管蓋放一下氣，然后4保存，點樣是取出即可用WB實驗步驟1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后風干，將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。2. 配制分離膠1) 籌備：1ml槍（藍色槍頭），200l槍（黃色槍頭）10l（白色槍頭）2) 10%分離膠的配置：（用50ml燒杯。1

3、.0mm板配1.5塊膠，1.5mm板配2塊板）5.91ml超純水4.95ml丙烯酰胺（30%）避光保存極易失效3.75mlPh8.8TrisHCL150l10%SDS150lAP（催化劑促凝作用）9lTEMED混合搖勻（用移液槍抽吸混勻液體，不要將液體完全打出防止氣泡）3. 灌膠沿玻璃板右上角緩慢勻速加入分離膠（用1ml移液槍，不要將移液管內(nèi)液體完全打出防止氣泡）保持液面平穩(wěn)上升至上方綠色線為止4. 水封立即用1ml超純水進行水封（利用重力把膠壓平），如有氣泡則用針頭吸出防止影響電泳效果，等待20-30min5. 濃縮膠的配制（5%）4.13ml超純水1ml丙烯酰胺（30%）避光保存極易失效7

4、50lPh6.8 TrisHCL60l10%SDS60lAP（催化劑促凝作用）6lTEMED攪拌混勻立即灌膠至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝膠30min或20min6. 電泳（電泳液最多使用兩次）1) 安裝電泳裝置低板對內(nèi)，上方夾住，往兩板中加入電泳液至黑線并觀察是否漏液，緩慢拔掉梳子（注意兩手平衡拔出防止拔歪）2) 點樣（不易時間過長，防止樣品條帶集中）Mark4l（Protern ladder）推舉9，實際4已經(jīng)足夠 樣品8l7-10l均可內(nèi)參挑齊即可組數(shù)少時盡量靠中間點樣，邊緣易跑歪3) 連接電泳儀電泳池與電泳蓋連接：黑對黑，紅對紅電永池的兩個電極插入電極蓋孔內(nèi)，打開開關(guān)恒壓電泳先調(diào)

5、電壓至70mV，跑約20min。（Mark跑開，分出彩帶即可）再調(diào)電壓至120mV，跑約60min。（不能跑過下面的玻璃板）注：Mark的條帶從紅色條帶往下依次為：7055403520，待測蛋白的分子量再哪一區(qū)域就在哪一段剪。用綠色的切板切割待測區(qū)域，邊緣留點空余，以防止切到條帶。放入裝有轉(zhuǎn)移液的皿中浸泡7. 轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)移液可用3-4次）1) 剪四層濾紙（大小與膜相，近可大不行小）浸入轉(zhuǎn)移液皿中。然后再講其剪成與膠全都大小（膠始終保持潮濕）2) 剪PVDF膜（用上述濾紙，勿用手直接接觸PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上3) “夾三明治”再大塑料盆中加入少量轉(zhuǎn)移液，將夾板、海綿、濾紙、膜均放入

6、浸泡，夾板黑板在下、兩層濾紙膠膜兩層濾紙（膠的大分子量條帶在上方，即在右上方）4) 安裝轉(zhuǎn)膜裝置：黑板對黑板，電極黑對黑，紅對紅。加入轉(zhuǎn)膜液至滿（否則儀器無法啟動）5) 打開開關(guān)，調(diào)節(jié)電流至100mA，轉(zhuǎn)膜2h（恒流）盆中加滿冰轉(zhuǎn)膜成功標志：膠上的條帶均轉(zhuǎn)移的膜上，膠呈無色8. 封閉1) 配制5%脫脂奶粉：小燒杯中混勻加入皿中2.5g脫脂奶粉50mlTBST2) 將膜取出放入上述加入了5%脫脂奶粉中的皿中常溫慢搖60min（轉(zhuǎn)移液回收其余清理掉，轉(zhuǎn)移液可以重復(fù)利用2次）9. 一抗1) 用TBST配，每一格加5ml TBST，再分別加入抗體抗體的量：2l（Psmad2l）免抗1:10005l：5

7、ml58（分子量）2l（Psmad2l）免抗1:50010l：5ml58Jnk免抗1:10005l：5ml雙帶內(nèi)參（小鼠抗GAPH）單抗，中杉金橋1:50001l：5ml362) 膜上用圓珠筆標記，分別放入小格中（正面朝上）3) 4冰箱中，慢搖過夜（正面朝上，搖床416室）10. 洗脫用TBST在皿中洗脫，搖床10min每次，洗三次。11. 二抗1) 用3%的脫脂奶粉小燒杯中混勻加入皿中1.5g的脫脂奶粉50mlTBST2) 每格吸入5ml 3%脫脂奶粉，抗體與奶粉比例均為1:5000，即加入1l注意：吸入微升時，肯定要檢查是否吸到液體，一抗用鼠抗則二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗3) 膜分別加入小格，慢搖1-2h（常溫）12. 洗脫用TBST在皿中洗脫，搖床10min每次，洗三次。13. 顯影：U盤所需物品A液，B液（顯影液。4保存）200l槍+槍頭（黃）膜（置于皿中）1) 開機后自動預(yù)冷，溫度降到1-20才可2) 顯影液現(xiàn)配現(xiàn)用（A液：B液=1：1）3) 膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液槍吧顯影液均勻涂在膜上4) 先點擊自動