植物DNA、質(zhì)粒DNA的提取以及載體構(gòu)建

1、植物DNA、質(zhì)粒DNA的提取以及載體構(gòu)建一、植物DNA的提取1、目的和意義2、原理3、試劑的準(zhǔn)備4、操作過程5、DNA檢測6、注意事項7、常見問題及解決辦法1、目的和意義、目的和意義:1、抗性苗的檢測、抗性苗的檢測2、分子雜交、分子雜交3、分子標(biāo)記、分子標(biāo)記4、基因擴(kuò)增、基因擴(kuò)增2、原理、原理 : CTAB（十六烷基三甲基溴化銨hexadyltrimethyl ammomum bromide）是一種非離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA游離出來。植物材料在 CTAB 的處理下，結(jié)合 65 水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、 DNA 被釋放出來。 CTAB 與核酸形成復(fù)合物，

2、此復(fù)合物在高鹽（0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度 （0.1-0.5 mM NaCl ）下 CTAB -核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，最后用75%的乙醇清洗沉淀，吹干，溶于TE中。3、試劑的準(zhǔn)備 試劑的全稱：試劑的全稱： CTAB：十六烷基三甲基溴化銨 EDTA：已二胺四乙酸二鈉 PVP : 聚乙烯吡咯烷酮。試劑的配制（ 2CTAB（100ml）2%CTAB：2g1.4mol/LNaCl: 8.19g20mmol/LEDTA: 4ml(0.5mol/L母液）100mmol/L TrisCl(PH8.0): 10ml（1mo

3、l/L母液）2%PVP: 2g2% -巰基乙醇: 2ml試劑的作用Tris-HCl (pH8.0)：提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞CTAB：溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離 EDTA：抑制DNase活性 -巰基乙醇：抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐化，使酚類物質(zhì)容易去除 PVP ：是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。 4、操作過程（小樣法）1、將水浴鍋打開，調(diào)到65度，并將裂解液放到水浴鍋中預(yù)熱；2、挑取1-2g幼嫩的組織放到碾缽中，加入液氮迅速研磨成粉末；3、將粉末迅速轉(zhuǎn)入1.5ml的 離心管中，

4、迅速加入裂解緩沖液，混勻，放入65度水浴鍋水浴30min，期間晃動離心管2-3次；4、將離心管取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），混勻，靜置10min；5、室溫12000r離心10min，然后將上清轉(zhuǎn)移至干凈的新離心管中再抽提一次；6、將上清轉(zhuǎn)移至干凈的新離心管中，加入2/3體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇，混勻，靜置沉淀30min，10000r離心10min；7、將上清倒掉，倒置離心管使殘液流盡，加入50075%酒精，將沉淀搖起來放置510min，離心，倒掉酒精，重復(fù)一次；8、倒置離心管使殘液流盡，離心，用槍頭將殘液吸干，吹干，溶于TE(10mM Tris-HCl;1mM

5、EDTA PH=8.0)； 9、加入RNA酶，37度水浴1h或4度放置過夜；10、加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，靜置10min，12000r離心10min；11、將上清轉(zhuǎn)入新的干凈離心管中，加入2倍體積的無水乙醇， 混勻，靜置30min，10000r離心10min；12、上清倒掉，用75%的乙醇清洗2次，倒掉酒精，離心，用槍頭吸干殘液，吹干，溶于TE即為可以進(jìn)行分子操作的DNA。分光光度法：分光光度法：DNA在260nm處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長進(jìn)行分光測定DNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50g/ml的dsD

6、NA，37g/ml的ssDNA，40g/ml的RNA。DNA純品的OD260/OD280為1.8，故根據(jù)OD260 /OD280的值可以估計DNA的純度。若比值較高說明含有RNA，比值較低說明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。 5、DNA檢測MarkerMarker定量法定量法 ：DNA的紫外檢測通常使用熒光染料溴化乙錠，該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的平面基團(tuán)，這個基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光。根據(jù)Marker的量及其熒光的強弱，可大致對檢測的DNA樣品進(jìn)行定量。使用此法還有一

7、個突出優(yōu)點，即它可令操作者直觀地獲悉所檢測DNA樣品的完整性及其大小。DNA電泳圖 6、注意事項：1、在整個操作過程中要戴手套；2、使用液氮時要小心，不要濺到皮膚上，因為液氮溫度很 低，會把皮膚凍壞；3、加試劑時要在通風(fēng)櫥中加，因為有些試劑具有揮發(fā)性，會 散發(fā)出難聞的氣味，如巰基乙醇、氯仿等。4、每次吸取上清液時一定要輕柔，否則會吸到下面的液體；5、每次混勻的時候要輕柔，因為DNA裂解出來之后用力搖晃的話易使DNA斷裂；6、使用離心機(jī)的時候一定要注意平衡，否則會損壞離心機(jī)。7、每次廢液都要倒到廢液瓶中，不可隨處傾倒。8、一次性手套不可遺棄在通風(fēng)櫥內(nèi)，以免被吸入堵塞通風(fēng)櫥補充： 高質(zhì)量DNA的提

8、取相對于普通提法增加的步湊：1、預(yù)處理2、NH4AC去除多糖3、酚去除蛋白質(zhì)4、高鹽TE去除殘余的多糖二、質(zhì)粒DNA的提取 1、質(zhì)粒的概念：質(zhì)粒的概念：質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細(xì)胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。 2、質(zhì)粒的特點1、質(zhì)粒不是細(xì)菌生長所必需的遺傳物質(zhì)，可自行丟失或人工處理而消除；2、攜帶的遺傳信息能賦予宿主菌某些生物學(xué)性狀，有利于細(xì)菌在特定的環(huán)境下生存；3、能獨立于染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳；4

9、、常包含編碼對宿主有利的酶的基因；5、天然天然DNADNA質(zhì)粒具有質(zhì)粒具有3 3種構(gòu)型：種構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀共價閉合環(huán)狀(scDNA)(scDNA)、開環(huán)、開環(huán)(ocDNA)(ocDNA)和線性和線性(lDNA)(lDNA)構(gòu)型構(gòu)型試劑的配置液體液體I：50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(Ph8.0) 配制好后高壓滅菌，于4冰箱保存液體液體II：0.4mol/L NaOH 2% SDS 溶液II要現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫下使用液體液體III：5mol/L乙酸鉀 60.0ml 冰乙酸 11.5ml H2O 28.5ml配好后高壓滅菌，于4

10、冰箱保存，用時置于冰上 實驗原理實驗原理 加入溶液I使菌體懸浮。加入溶液II后SDS使菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破裂，使細(xì)胞內(nèi)核酸釋放出來，同時NaOH處理可破壞DNA堿基配對，使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。加入溶液III后，宿主的線狀染色體DNA未來得急復(fù)性就在冰冷條件下與SDS、蛋白質(zhì)、高分子量RNA纏繞在一起沉淀下來，而質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞狀鏈，迅速得到準(zhǔn)確配對，重新形成完全天然的超螺旋分子，處于溶解狀態(tài)保留在上清中。操作步驟1、挑取單菌落于加有一定濃度的抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200r/min，37震蕩培養(yǎng)過夜。2、將菌液轉(zhuǎn)移到1.5m

11、l的離心管中，10000r離心1min。3、棄上清，將管子倒置于濾紙上，使殘液流盡，加入200液體I，于渦旋振蕩器上震蕩，使菌液充分重懸。4、加入新配制好的400液體II，蓋緊管子快速顛倒混勻，不可劇烈震蕩，靜置5min。 5、加入預(yù)冷的300液體III，顛倒離心管數(shù)次，冰浴5min，12000r離心5-10min。6、上清轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），混勻，靜置5-10min，12000r離心10min。7、上清移入干凈離心管，加入2/3體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇，混勻，靜置沉淀20min，12000離心10min。8、棄上清，倒置離心管使殘液流盡，用75%

12、的乙醇洗滌兩次。9、棄上清，倒置離心管使殘液流盡，將離心管離心幾分鐘將殘液離到管底，用槍頭將殘液吸干，吹干。10、將沉淀溶于30的TE溶液中，于4 或-40 保存?zhèn)溆谩?1、質(zhì)粒的檢測：對質(zhì)粒的檢測我們一般就是進(jìn)行電泳檢測。11、質(zhì)粒的檢測：對質(zhì)粒的檢測我們一般采用電泳檢測。注意事項1、加入液體I后一定要充分懸浮菌體細(xì)胞，確保沒有結(jié)塊的菌體，否則細(xì)胞裂解不充分，質(zhì)粒產(chǎn)量會降低。2、溶液II在室溫較低時特別是在冬天，容易產(chǎn)生沉淀。如果有沉淀產(chǎn)生，一定要水浴加熱溶解，并混勻后才能使用。3、如果抗生素失效，或濃度太低可能會導(dǎo)致雜菌大量擴(kuò)增，從而得不到質(zhì)?；虻玫胶苌儋|(zhì)粒。大腸桿菌生長時間過長或過短，也

13、會導(dǎo)致抽提不到質(zhì)粒或質(zhì)粒產(chǎn)量很低。補充：儀器的使用1、稱量天平的使用稱量天平的使用：天平是配制試劑的時候稱量試劑用的，每次使用是要用稱量紙墊著，避免試劑直接接觸天平，否則天平就會被腐蝕，影響稱量的準(zhǔn)確性和天平的使用壽命。另外，每次使用完之后要把天平用軟毛刷掃干凈，以免灑落的試劑腐蝕天平。2、通風(fēng)櫥的使用通風(fēng)櫥的使用：通風(fēng)櫥是由外向內(nèi)抽風(fēng)的，目的是為了避免在實驗過程中揮發(fā)性氣體污染室內(nèi)，因此在使用的時候要保持通風(fēng)櫥的通暢，注意不要把手套放在通風(fēng)櫥里面，以免吸到排風(fēng)口里面堵塞排風(fēng)孔而導(dǎo)致通風(fēng)櫥不能正常工作。3、離心機(jī)使用的注意事項離心機(jī)使用的注意事項 使用離心機(jī)的時候首先要調(diào)平衡，沒有調(diào)平衡的話容

14、易損壞轉(zhuǎn)軸，從而損壞離心機(jī)；其次在使用過程中會有離心管破裂而導(dǎo)致試劑漏在離心機(jī)里面，發(fā)生這種情況要及時將露出的試劑處理干凈，將離心機(jī)擦干凈，以免試劑腐蝕離心機(jī)。三、載體的構(gòu)建載體（載體（vectorvector）：）：是指將外源是指將外源DNADNA或基因攜帶進(jìn)或基因攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具，按功能可入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具，按功能可以分為克隆載體和表達(dá)載體。以分為克隆載體和表達(dá)載體?？寺≥d體：克隆載體：是指用于擴(kuò)增或保存外源是指用于擴(kuò)增或保存外源DNA片段而片段而設(shè)計的載體。設(shè)計的載體?？寺≥d體具備的條件載體都能攜帶外源載體都能攜帶外源DNADNA片段片段( (基因基因)

15、)進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體DNADNA上，隨著染色體上，隨著染色體DNADNA的復(fù)制而同步復(fù)制的復(fù)制而同步復(fù)制。載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點，即多克隆位點位點，即多克隆位點。載體都具有合適的遺傳標(biāo)記基因載體都具有合適的遺傳標(biāo)記基因。載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)胞有害載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。

16、載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。源基因片段。載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。代而不易丟失。載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。苷酸序列。 表達(dá)載體： 在克隆載體基礎(chǔ)上，為使插入的外源DNA片段有效轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽，裝有強化外源基因表達(dá)的強啟動子以及利于表達(dá)產(chǎn)物分泌、分離和純化的元件，這種載體稱為表達(dá)載體。表達(dá)載體構(gòu)建的一般步驟：酶切 連接 轉(zhuǎn)大腸桿菌 PCR檢測 重組質(zhì)粒的提取 酶切檢測 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 PCR檢測 保菌 酶切：1、確定酶切位點；2、確定體系、緩沖液和酶的最佳反應(yīng)溫度；3、配制反應(yīng)液： buffer : 2 酶 ： 0.5 DNA ： 3 ddH2O : 補足20連接：T4buffer ：1DNA片段 ：6Vector ： 2T4連接酶 ： 1配制好之后放連接儀