RNA的提取,瓊脂糖電泳及RTPCR

1、實驗二實驗二 RNA提取、提取、 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR（8：008：05） 實驗回顧實驗回顧實驗一、基因組實驗一、基因組DNA的提取、的提取、 酶切及電泳酶切及電泳目的目的 DNA片段片段 質(zhì)粒質(zhì)粒 TA載體載體連接連接 重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒目的目的 DNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化無質(zhì)粒的無質(zhì)粒的E.Coli 死亡死亡有質(zhì)粒的有質(zhì)粒的E.Coli 存活存活含抗生素培養(yǎng)基中生長含抗生素培養(yǎng)基中生長PCR 2-3min平板篩選平板篩選 實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容1、小鼠肝臟組織總、小鼠肝臟組織總RNA的提?。坏奶崛?；2、RNA的瓊脂糖凝膠電泳；的瓊脂糖凝膠電泳；3、以總、以總RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄反應；為模板的逆轉(zhuǎn)錄反應；4、以、

2、以cDNA為模板的特定基因的為模板的特定基因的RT-PCR: 注：本次實驗擴增注：本次實驗擴增GAPDH基因基因(746bp)5、 PCR產(chǎn)物的電泳及回收產(chǎn)物的電泳及回收（8：058：15）教師要有下午電泳時教師要有下午電泳時 播放的多媒體播放的多媒體 PCR Flash 動畫動畫 PCR在法醫(yī)學上的應用在法醫(yī)學上的應用RNA提取操作注意事項提取操作注意事項 RNA RNA分離的關(guān)鍵因素是減少分離的關(guān)鍵因素是減少RNARNA酶污染。酶污染。 RNA酶是一類自然界中廣泛存在、生物活性非常穩(wěn)定的酶類。酶是一類自然界中廣泛存在、生物活性非常穩(wěn)定的酶類。環(huán)境中的灰塵、人體汗液、唾液、實驗器材表面。環(huán)境

3、中的灰塵、人體汗液、唾液、實驗器材表面。RNase耐熱、耐耐熱、耐酸、耐堿，不需要輔助因子就具有活性作用。酸、耐堿，不需要輔助因子就具有活性作用。 1、盡量避免外源性、盡量避免外源性RNase 污染污染 a. 操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。 b. 用新開封的化學試劑。（試劑應該專用）用新開封的化學試劑。（試劑應該專用） c.一次性塑料器材最好是新開封并經(jīng)過一次性塑料器材最好是新開封并經(jīng)過DEPC水處理及高壓滅水處理及高壓滅菌。菌。 d.玻璃器材、水都應該經(jīng)過去玻璃器材、水都應該經(jīng)過去RNase 處理。對玻處理。對玻 璃器材還應該進行高溫烘烤。璃器材還應該進行高

4、溫烘烤。 2、應用、應用RNase 抑制劑抑制內(nèi)源性抑制劑抑制內(nèi)源性RNase 活性活性。 總總RNA 真核細胞的真核細胞的RNA主要分為：主要分為： 1、mRNA: 1-5% 起始密碼：起始密碼：AUG 終止密碼：終止密碼：UAA,UAG,UGA。 5鳥嘌呤鳥嘌呤7位甲基化位甲基化CH3修飾。修飾。 1）免受核酸酶破壞，）免受核酸酶破壞， 2）起始、促進蛋白質(zhì)合成。）起始、促進蛋白質(zhì)合成。 3poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)尾巴結(jié)構(gòu) 20-200個個A. 翻譯所必需。翻譯所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亞基大亞基60S: 28S=4718nt 5S=120nt

5、5.8S=160nt 小亞基小亞基40S: 18S=1874nt1 1）將）將1 ml Trizol1 ml Trizol 試劑分裝到試劑分裝到EppendorfEppendorf 管中備用。管中備用。2 2）實驗教師操作實驗教師操作: : 取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過大大, ,放在玻片上立即研磨放在玻片上立即研磨, ,研磨研磨要徹底要徹底。 3 3）將研磨后的組織（）將研磨后的組織（小米粒大小小米粒大?。┺D(zhuǎn)移至）轉(zhuǎn)移至1 ml Trizol1 ml Trizol 試劑中，蓋緊蓋，上下顛倒混合試劑中，蓋緊蓋，上下顛倒混合2 min2 min以上，使組織細胞以

6、上，使組織細胞充分裂解。肉眼觀察可見液體變成均勻渾濁狀。充分裂解。肉眼觀察可見液體變成均勻渾濁狀。 4 4）室溫孵育）室溫孵育10 min10 min。（8：159：05）發(fā)放口罩，帽子，每個組來一個人領(lǐng)取。發(fā)放口罩，帽子，每個組來一個人領(lǐng)取。強調(diào)肝臟組織塊不宜過大強調(diào)肝臟組織塊不宜過大,研磨要徹底。研磨要徹底。第一部分：提取小鼠肝臟組織的總第一部分：提取小鼠肝臟組織的總RNA1、異硫氰酸胍法：、異硫氰酸胍法： GuSCN 是一種強的蛋白質(zhì)變性劑，能夠裂解細胞的同時，是一種強的蛋白質(zhì)變性劑，能夠裂解細胞的同時，還能有效地抑制內(nèi)源性還能有效地抑制內(nèi)源性 Rnase的活性，通過有機溶劑的分步抽的活

7、性，通過有機溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細胞總提，可獲得純度較高的細胞總RNA。 特點：需低溫操作，但價格經(jīng)濟。特點：需低溫操作，但價格經(jīng)濟。2、Trizol 試劑試劑（商品化產(chǎn)品）（商品化產(chǎn)品） 特點：在室溫下可以提取細胞總特點：在室溫下可以提取細胞總RNA， 具有簡單、快速、提取量大、純度高的優(yōu)點。具有簡單、快速、提取量大、純度高的優(yōu)點。3、mRNA提取試劑盒提取試劑盒 真核細胞真核細胞mRNA的的3末端有末端有ploy(A)尾，利用寡聚尾，利用寡聚 dT纖維素纖維素結(jié)合結(jié)合mRNA，將其從細胞總，將其從細胞總RNA中分離出來。中分離出來。課間介紹課間介紹 RNA提取的幾種方法提取的幾

8、種方法室溫孵育室溫孵育10 minRNase抑制劑介紹抑制劑介紹1、DEPC, 二乙基焦炭酸鹽二乙基焦炭酸鹽 RNA操作時最常用的操作時最常用的RNase抑制劑，對核酸酶有抑制劑，對核酸酶有 很強的抑制很強的抑制作用。作用機制是與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。作用。作用機制是與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。 使用方法：用來去除溶液中的使用方法：用來去除溶液中的RNase 。RNA提取中提取中 所有液體試劑都應該用所有液體試劑都應該用DEPC處理。處理。 有效濃度：有效濃度：0.05%-0.1%，室溫磁力攪拌，室溫磁力攪拌20分鐘。分鐘。 滅活條件：高壓消毒，或滅活條件：高壓消毒，或

9、70 C 1 h。 在在Tris溶液中半衰期為溶液中半衰期為1.25min。 儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。，或液氮中。2、肝素、肝素 使用濃度：使用濃度：0.110mg/ml 效效 果果: 37 C 時，可抑制時，可抑制95%的的RNase 活力?；盍?。 如果與如果與DEPC聯(lián)合應用，聯(lián)合應用， 具有極強的抑制具有極強的抑制 效果。效果。 室溫孵育室溫孵育10 min 結(jié)束結(jié)束5 5）加入）加入200 200 l l氯仿，震蕩混勻氯仿，震蕩混勻20-30 s20-30 s，室溫放置，室溫放置5 min5 min （此期間液體開始分層，不要輕易

10、攪動液體）（此期間液體開始分層，不要輕易攪動液體） 10, 000 rpm10, 000 rpm，離心，離心 5 min (5 min (統(tǒng)一離心統(tǒng)一離心) ) 7 7）將清澈透明的）將清澈透明的上層水相上層水相 轉(zhuǎn)移至另一離心管中。轉(zhuǎn)移至另一離心管中。9：0510：05RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein第一部分：提取小鼠肝臟組織的總第一部分：提取小鼠肝臟組織的總RNA RNA提取提取:RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein8 8）沉淀）沉淀RNARNA：加：加0.5 ml0.5 ml異丙醇異丙醇，上下顛倒混勻，室溫，上下顛倒混勻，室溫10 min10 min。 10,

11、 00010, 000 rpmrpm，4 4 C C，( (統(tǒng)一統(tǒng)一) ) 離心離心10 min10 min，棄上清。，棄上清。1010）加）加1ml 75%1ml 75%乙醇乙醇洗滌。洗滌。1111）7500rpm7500rpm，4 4 C C 離心離心 1 min1 min，棄上清，棄上清 再離心幾秒鐘，將管壁液體完全移凈。再離心幾秒鐘，將管壁液體完全移凈。在用在用TriZol試劑提取總試劑提取總RNA時，全程均在室溫進行，當時，全程均在室溫進行，當RNA沉淀用水溶解后，沉淀用水溶解后，應該注意在冰上操作，而且盡可能快地進入下一個環(huán)節(jié)。應該注意在冰上操作，而且盡可能快地進入下一個環(huán)節(jié)。離心

12、離心10分鐘時分鐘時課間休息課間休息注意：注意：75%乙醇的作用：不起沉淀作用，只是為了清洗管壁加入方法一定是貼管壁在沉淀的對側(cè)貼管壁在沉淀的對側(cè)緩慢加入，不要攪動沉淀緩慢加入，不要攪動沉淀12）室溫干燥）室溫干燥35 min（根據(jù)（根據(jù)RNA沉淀大小決定，干燥后的沉淀沉淀大小決定，干燥后的沉淀應該是無色膠樣透明狀，避免過分干燥應該是無色膠樣透明狀，避免過分干燥,此此步驟非常關(guān)鍵步驟非常關(guān)鍵。）注意事項注意事項：RNA:自然室溫干燥避免放在37oC孵箱中過度干燥以防無法溶解。RNA沉淀必須絕對干燥，微量乙醇殘留，容易造沉淀必須絕對干燥，微量乙醇殘留，容易造成成RT的失敗，但過分干燥又是造成的失

13、敗，但過分干燥又是造成RNA不溶解不溶解的主要原因的主要原因 。判斷。判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。干燥后的是過分干燥是逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。干燥后的沉淀應該是無色膠樣透明狀。沉淀應該是無色膠樣透明狀。RNA pellet：乳白色，透明膠樣乳白色，透明膠樣干燥后無色透明干燥后無色透明13）用加樣器吸取冰冷）用加樣器吸取冰冷DEPC-H2O 18 l，加到，加到RNA上，進行吹打上，進行吹打溶解溶解RNA 沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNA應置冰上保存應置冰上保存。14) 14) 吸出吸出 9 9 l l溶液放到冰上備用溶液放到冰上備用( (

14、將用于電泳將用于電泳).).15) 15) 剩余剩余 9 9 l l溶液溶液, ,放到冰上備用（用于放到冰上備用（用于RTRTPCRPCR）. .RNA的溶解：的溶解：v注意：注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心沉淀的溶解一定要耐心充分，充分，一定一定要用加樣器要用加樣器反復反復多次吹打方多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出可。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響現(xiàn)氣泡影響RNA的溶解。的溶解。避免氣泡的方法：避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋用加樣器的第一擋每次吹打都不要打出氣體每次吹打都不要打出氣體判斷溶解程度：判斷溶解程度：吹打時液體流動不拐彎吹打時液體流動不拐彎為止。為止。 逆

15、轉(zhuǎn)錄酶：逆轉(zhuǎn)錄酶： 存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)。 常見有哺乳動物型37oC，禽類型42oC 。 以mRNA為模板的DNA聚合酶，形成與RNA堿基相互補DNA鏈，后者稱為互補DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA雜合鏈上的RNA。 RT第二部分：逆轉(zhuǎn)錄反應第二部分：逆轉(zhuǎn)錄反應 (RT)AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h RT 按照下列配方進行按照下列配方進行RNA的的RT反應：反應：第一步：第

16、一步：總總RNA 9 l Oligo dT (0.05 g/ml) 1 l (終：終：2.5 ng/ml) 輕彈管底混合，輕彈管底混合， 置置65水浴水浴10min后后， 立即冰浴立即冰浴2min。在水浴在水浴10分鐘時，開始分鐘時，開始RNA電泳。電泳。RT引物的用量非常引物的用量非常少，因為模板量是固少，因為模板量是固定的，而且只進行一定的，而且只進行一次反應。次反應。關(guān)鍵點：關(guān)鍵點：RNA是否充分溶解是否充分溶解根據(jù)組織或細胞的量確定逆轉(zhuǎn)錄反根據(jù)組織或細胞的量確定逆轉(zhuǎn)錄反應的體積，通常利用應的體積，通常利用1ml Trizol試試劑提取出來的總劑提取出來的總RNA適合于適合于20 l體體

17、積的逆轉(zhuǎn)錄反應體系。積的逆轉(zhuǎn)錄反應體系。引物的量是否合適引物的量是否合適高溫退火避免高溫退火避免Oligo dT錨錠點錯錨錠點錯誤，同時，打開誤，同時，打開RNA鏈之間的二級鏈之間的二級結(jié)構(gòu)，利于結(jié)構(gòu)，利于RT。 退火后一定迅速放在冰上退火后一定迅速放在冰上在水浴在水浴10分鐘時，開始分鐘時，開始RNA電泳。電泳。 將將 RNA 進行進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 9 l RNA 樣品樣品 23 l 上樣液輕輕混勻，上樣液輕輕混勻， 上樣上樣 電泳電泳: 120伏，伏，1020分鐘分鐘 注意注意: 電泳槽的清潔及新的電泳液！電泳槽的清潔及新的電泳液！ 瓊脂糖凝膠要新鮮配制！瓊脂糖凝膠

18、要新鮮配制！ 紫外透射儀觀察電泳結(jié)果紫外透射儀觀察電泳結(jié)果RNA電泳結(jié)果電泳結(jié)果 rRNA可以作為內(nèi)部可以作為內(nèi)部Marker分分子，通過觀察子，通過觀察rRNA的兩條帶的兩條帶（28S和和18S）的比例，可以判）的比例，可以判斷所提取斷所提取mRNA是否存在降解。是否存在降解。 RNA電泳并不能判斷電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因為為在電泳過程中在電泳過程中RNA可能發(fā)生可能發(fā)生降解降解。重點講解重點講解28S、 18S和和5S的比例。的比例。 分析本次實驗結(jié)果：分析本次實驗結(jié)果：28S、 18S和和

19、5S的比例。的比例。RNA電泳結(jié)果分析電泳結(jié)果分析第二步：向上述反應溶液中依次加入下列試劑：第二步：向上述反應溶液中依次加入下列試劑： 5 RT-buffer 4 l RNasin (40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV 1 l輕彈管底混合，可用離心機甩一下。輕彈管底混合，可用離心機甩一下。置置42 oC 水浴水浴1h。將上述反應移至將上述反應移至68 oC水浴水浴10min以滅活以滅活 RTase，并冰浴，保存?zhèn)溆?。，并冰浴，保存?zhèn)溆?。?0：3011：30 由老師結(jié)束實驗，放由老師結(jié)束實驗，放-20 oC，下午使用，下午使用 ）cDNA 4 l10PCR

20、 buffer（含MgCl2） 5 ldNTPs (10mmol/L) 1 l5引物 (10mol/L) 1 l3引物 (10mol/L) 1 l去離子水（補足反應體系） 39 l Taq DNA pol. (2U/l) 1 l 輕彈管底混合（用離心機甩一下）輕彈管底混合（用離心機甩一下）注意：最后加入注意：最后加入Taq 酶。酶。 PCR 操作操作 50l在一微量離心管中在一微量離心管中依次依次加入下列試劑：加入下列試劑：PCR儀設定的反應條件：儀設定的反應條件：94oC 45 S DNA變性變性55 oC 45 S DNA復性復性72 oC 1 min 產(chǎn)物鏈延伸產(chǎn)物鏈延伸 25-30個循

21、環(huán)后個循環(huán)后 72 oC 10 min 根據(jù)待擴增基因片段的長短確定具體反應條件，一般情況下，根據(jù)待擴增基因片段的長短確定具體反應條件，一般情況下，基因片段在基因片段在500-1000bp左右時，可按下列條件進行左右時，可按下列條件進行PCR。PCR儀介紹：儀介紹：如果上蓋加熱的如果上蓋加熱的PCR儀，可以直接放儀，可以直接放入儀器中進行入儀器中進行PCR；如果下面加熱的如果下面加熱的PCR儀，加入儀，加入2滴滴礦物油后，加入儀器中，不過這礦物油后，加入儀器中，不過這種儀器現(xiàn)在已經(jīng)很少用到。種儀器現(xiàn)在已經(jīng)很少用到。PCR反應期間講解：反應期間講解： 1：203：00PCR儀內(nèi)發(fā)生的反應儀內(nèi)發(fā)生

22、的反應1）對于定性分析特定基因在不同樣本中的表達情）對于定性分析特定基因在不同樣本中的表達情 況時，一定要防止污染，尤其是況時，一定要防止污染，尤其是PCR產(chǎn)物的污產(chǎn)物的污 染，為了排除假陽性結(jié)果，各種對照是必不可染，為了排除假陽性結(jié)果，各種對照是必不可 少的。少的。2）模板不是越多越好，模板過多，當引物與模板）模板不是越多越好，模板過多，當引物與模板 退火時會發(fā)生模板先互補結(jié)合，引物無法與模退火時會發(fā)生模板先互補結(jié)合，引物無法與模 板結(jié)合，因此，適量模板量是非常重要的。板結(jié)合，因此，適量模板量是非常重要的。 模板過多還能大量消耗鎂離子。模板過多還能大量消耗鎂離子。PCR反應注意事項：反應注意

23、事項： 根據(jù)待擴增基因片段的大小確定根據(jù)待擴增基因片段的大小確定延伸延伸時間，小時間，小于于500bp，一般采用，一般采用1分鐘即可，大于分鐘即可，大于500bp，可采，可采用用2分鐘，但一般超過分鐘，但一般超過2000bp，一般可適當延長延，一般可適當延長延伸時間伸時間2-3分鐘。分鐘。 變性變性 溫度一般選用溫度一般選用94 1oC，變性時間可根據(jù)，變性時間可根據(jù)模板大小和濃度確定，一般采用模板大小和濃度確定，一般采用30秒。秒。 退火退火 溫度與引物序列關(guān)系非常密切，退火時溫度與引物序列關(guān)系非常密切，退火時間與引物長度和間與引物長度和GC含量有關(guān)。含量有關(guān)。 引物長度一般在引物長度一般在

24、15-25bp之間。之間。 Tm=4(G+C)+2(A+T)如何確定如何確定PCRPCR的變性、退火和延伸溫度和時間？的變性、退火和延伸溫度和時間？RT的引物選擇：的引物選擇： Oligo (dT)15-18 Specific anti-sense primer Random primer因為基因序列與因為基因序列與mRNA序列是一序列是一致的。致的。病毒病毒RNA作為作為RT模板模板時，一定要知道病毒時，一定要知道病毒是屬于哪一種病毒：是屬于哪一種病毒：正鏈正鏈RNA病毒？負鏈病毒？負鏈RNA病毒？病毒？正鏈正鏈RNA病毒：病毒：RT引物用引物用anti-sense primer；負鏈負鏈R

25、NA病毒：病毒：RT引物用引物用sense primer。 1.為什么要加入鎂離子？為什么要加入鎂離子？ 鎂離子是鎂離子是Taq DNA聚合酶的輔酶，聚合酶的輔酶，2.0mM的濃度時酶活性的濃度時酶活性最高。鎂離子能夠和負離子集團結(jié)合，在最高。鎂離子能夠和負離子集團結(jié)合，在PCR反應中，模板反應中，模板DNA、引物、引物DNA、dNTP均可和鎂離子結(jié)合，尤以均可和鎂離子結(jié)合，尤以dNTP影響影響最大。一般鎂離子應比最大。一般鎂離子應比dNTP高高0.5-1.0mM。 2.dNTP的濃度對的濃度對PCR有什么影響？有什么影響？ dNTP濃度過高，除容易引起堿基錯配外，還可結(jié)合鎂離子。濃度過高，除

26、容易引起堿基錯配外，還可結(jié)合鎂離子。 3.3.為什么有時候需要進行熱啟動？為什么有時候需要進行熱啟動？ 熱啟動就是讓熱啟動就是讓DNA在變性溫度下開始，在變性溫度下開始，Taq DNA聚合酶在聚合酶在DNA雙鏈充分打開之后再加入雙鏈充分打開之后再加入PCR反應體系中，這樣可以保反應體系中，這樣可以保證模板證模板DNA變性充分，引物結(jié)合順利并特異。變性充分，引物結(jié)合順利并特異。 PCRPCR反應相關(guān)問題：反應相關(guān)問題：4、DNA聚合酶：聚合酶：1）Taq DNA聚合酶的特性聚合酶的特性:半衰期：半衰期：95oC ，40分鐘分鐘活活 性：性：5-3方向的聚合酶活性。方向的聚合酶活性。 5-3外切酶

27、活性。外切酶活性。 缺乏缺乏3-5外切酶活性。外切酶活性。 因此沒有校正功能。因此沒有校正功能。2）Vent-TM DNA聚合酶：聚合酶：半衰期：半衰期：100 oC ，95分鐘分鐘活活 性：還具有性：還具有3-5外切酶活性。外切酶活性。引物設計引物設計 1、GC比值：堿基對中的比值：堿基對中的GC之間有三條氫鍵，之間有三條氫鍵，AT之間有兩條之間有兩條 氫鍵，氫鍵，GC和和AT在引物序列中的合理比例是設定在引物序列中的合理比例是設定PCR退火溫度的退火溫度的 重要依據(jù)。通常在一個引物中重要依據(jù)。通常在一個引物中GC和和AT各半。各半。 2、引物特異序列的長度至少為、引物特異序列的長度至少為1

28、5-18bp。 3、引物的方向：引物的方向永遠是、引物的方向：引物的方向永遠是53方向，正向（方向，正向（Sense）引物是與一股模板引物是與一股模板DNA序列相一致的，而反向（序列相一致的，而反向（Antisense）引物）引物則與這股模板則與這股模板DNA序列相互補。序列相互補。 4、 引物的酶切位點：通常在引物的引物的酶切位點：通常在引物的5-端設計適當?shù)南拗贫嗽O計適當?shù)南拗?性酶切位點。兩種酶切位點使克隆具有方向性。性酶切位點。兩種酶切位點使克隆具有方向性。 5、引物上啟始和終止密碼：如果想表達、引物上啟始和終止密碼：如果想表達DNA片段，所片段，所 用的載體又不含啟始密碼和終止密碼，應將其設計在用的載體又不含啟始密碼和終止密碼，應將其設計在 引物的酶切位點之后、特異性引物的酶切位點之后、特異性DNA序列之前。序列之前。 6、如果表達的蛋白用親合層析方法純化，可將必要、如果表達的蛋白用親合層析方法純化，可將必要 的序列設計在引物中以使所表達的融合蛋白易于純化。的序列設計在引物中以使所表達的融合蛋白易于純化。引物設計方法例：引物設計方法例：通常在引物的通常在引物的5-端設計適當?shù)南拗菩悦盖形稽c端設計適當?shù)南拗菩悦盖形稽c凝膠成像系統(tǒng)：凝膠成像系統(tǒng)：凝膠成像系統(tǒng)：凝膠成像系統(tǒng)： 播放播放 PCR Flash 動畫動畫 PCR在法醫(yī)學上的應用在法醫(yī)學上的應用引物的配制：引物的