形態(tài)觀察方法

1、第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察進(jìn)行初步觀察形成可驗證的假說形成可驗證的假說設(shè)計對照試驗設(shè)計對照試驗收集資料收集資料解釋結(jié)果解釋結(jié)果作出合理結(jié)論作出合理結(jié)論查閱已查閱已有知識有知識生物學(xué)研究模式生物生物學(xué)研究模式生物第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法v細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù) 電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù) 掃描遂道顯微鏡掃描遂道顯微鏡v細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法v細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)light microsco

2、py 普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù) 熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù) p53 激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)激光共焦掃描顯微鏡技術(shù) p53 相差顯微鏡相差顯微鏡 p51 微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡 p51 錄像增差顯微鏡技術(shù)錄像增差顯微鏡技術(shù) 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡 顯微鏡發(fā)展趨勢顯微鏡發(fā)展趨勢重要的光學(xué)技術(shù)參數(shù)重要的光學(xué)技術(shù)參數(shù)光鏡樣本制作光鏡樣本制作 采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野DIC、攝影裝置于一體。自動化與電子化。電子顯微鏡電子顯微鏡的基本知識的基本知識主要電鏡制樣技術(shù)主要電鏡制樣技術(shù)掃描電鏡掃描電鏡二、二、電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù) e

3、lectron microscopy電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本構(gòu)造 1940年，英國劍橋大學(xué)首先試制成功掃描電子顯微鏡。年，英國劍橋大學(xué)首先試制成功掃描電子顯微鏡。直到直到1965年，才有英國劍橋科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)出實用年，才有英國劍橋科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)出實用性強(qiáng)的商品掃描電鏡。由于掃描電鏡具有顯著的優(yōu)點性強(qiáng)的商品掃描電鏡。由于掃描電鏡具有顯著的優(yōu)點，廣泛廣泛應(yīng)用于應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、古生物學(xué)、地質(zhì)學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、古生物學(xué)、地質(zhì)學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)以及勘察、冶金，機(jī)械與輕工業(yè)等領(lǐng)域，電子學(xué)

4、以及勘察、冶金，機(jī)械與輕工業(yè)等領(lǐng)域，成為十分有成為十分有用的研究工具。用的研究工具。三、掃描遂道顯微鏡三、掃描遂道顯微鏡 （ scanning tunneling microscope ，STM）原理原理：量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)，量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)，原子間作用力、磁力、摩擦力等原子間作用力、磁力、摩擦力等裝置：裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù) 采集、處理、顯示系統(tǒng)。采集、處理、顯示系統(tǒng)。特點：特點：1 1、可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計算，分辨本領(lǐng)高、可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計算，分辨本領(lǐng)高 （側(cè)分辨率為（側(cè)分辨

5、率為0.10.10.2nm0.2nm，縱分辨率可達(dá)，縱分辨率可達(dá)0.001nm0.001nm） 2 2、可在真空、大氣、液體等多種條件下進(jìn)行、可在真空、大氣、液體等多種條件下進(jìn)行非破壞性非破壞性測量測量 3 3、可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息、可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息 4 4、可連續(xù)成像，進(jìn)行動態(tài)觀察、可連續(xù)成像，進(jìn)行動態(tài)觀察用途：用途：納米生物學(xué)納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具研究領(lǐng)域中的重要工具 熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)（Fluorescence Microscopy）v原理與應(yīng)用原理與應(yīng)用直接熒光標(biāo)記技術(shù)直接熒光標(biāo)記技術(shù)間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)間接免疫熒光標(biāo)記

6、技術(shù)在光鏡水平用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。在光鏡水平用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。免疫免疫熒光觀察、疾病診斷、特異蛋白質(zhì)熒光觀察、疾病診斷、特異蛋白質(zhì)等生物大分子等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白的定性定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用的應(yīng)用 激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（Laser Confocal Microscopy） 原理原理 應(yīng)用應(yīng)用： 用激光作光源，用激光作光源，排除焦平面以外光的干擾，排除焦平面以外光的干擾，逐點、逐點、 逐行、逐面快速掃描，逐行、逐面快速掃描，增強(qiáng)圖像反差增強(qiáng)圖像反差。 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 分辨力是普通光學(xué)顯

7、微鏡的分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。倍。 用途類似熒光顯微鏡，能掃描不同層次，形成用途類似熒光顯微鏡，能掃描不同層次，形成 立體圖像。立體圖像。微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡 （differential-interference microscope）偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感?；擅靼祬^(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器錄像增差顯微鏡技術(shù)錄像增差顯微鏡技術(shù) （video-enhance microscopy） 計算機(jī)輔助的微分干涉顯微鏡可在高分

8、辨率下計算機(jī)輔助的微分干涉顯微鏡可在高分辨率下 研究活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動研究活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動p51 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別光鏡與電鏡的主要區(qū)別光鏡與電鏡的主要區(qū)別（1）光源不同）光源不同 光鏡為可見光或紫外線；電鏡為電子束光鏡為可見光或紫外線；電鏡為電子束（2）透鏡不同）透鏡不同 光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡（3）真空）真空 （4）顯示記錄系統(tǒng)）顯示記錄系統(tǒng)電鏡與光鏡光路圖比較電鏡與光鏡光路圖比較終像（眼或底片）終像（眼或底片）目鏡目鏡投影鏡投影鏡物鏡物鏡樣品樣品聚光鏡聚光鏡熒光屏成像熒光屏成像中間像中間像電

9、子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本構(gòu)造主要電鏡制樣技術(shù)主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù) 用于電鏡觀察的樣本制備用于電鏡觀察的樣本制備示意圖示意圖 負(fù)染色技術(shù)負(fù)染色技術(shù)（Negative staining）重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上樣品染色，干燥后襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)樣品染色，干燥后襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)金屬投影金屬投影冰凍蝕刻技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)（Freeze etching） （技術(shù)示意圖技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。 快速冷凍快速冷凍深度蝕刻技術(shù)深度蝕刻技

10、術(shù)（quick freeze deep etchingquick freeze deep etching）電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)整裝細(xì)胞電鏡技術(shù)整裝細(xì)胞電鏡技術(shù) 是觀察細(xì)胞骨架的處理技術(shù)。是觀察細(xì)胞骨架的處理技術(shù)。掃描電鏡掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）原理與應(yīng)用原理與應(yīng)用：電子電子“探針探針”掃描掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。器收集二次電子成象。特點特點：引起樣品變形的表面張力問題引起樣品變形的表面張力問題- CO 2臨界點干燥法臨界點干燥法 核酸大分子制樣技術(shù)核酸大分子制樣技術(shù)

11、電鏡顯微放射自顯影電鏡顯微放射自顯影 電鏡整裝細(xì)胞制片技術(shù)電鏡整裝細(xì)胞制片技術(shù)p63石石蠟蠟切切片片技技術(shù)術(shù)步驟：步驟： 基本構(gòu)造：光學(xué)放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、機(jī)械和支架系統(tǒng)基本構(gòu)造：光學(xué)放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、機(jī)械和支架系統(tǒng) 光學(xué)顯微鏡成像原理光學(xué)顯微鏡成像原理激發(fā)樣本熒光激發(fā)樣本熒光保護(hù)眼睛保護(hù)眼睛特點：特點：1 1、光源為紫外線，波長、光源為紫外線，波長 較短，分辨力高于普較短，分辨力高于普 通顯微鏡；通顯微鏡； 2 2、有兩個特殊的濾光片；、有兩個特殊的濾光片； 照明方式常為落射式。照明方式常為落射式。天然物質(zhì)經(jīng)天然物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后紫外線照射后發(fā)熒光的物質(zhì)發(fā)熒光的物質(zhì)，如葉綠素能發(fā)如葉綠素能

12、發(fā)出血紅色熒光。出血紅色熒光。 激光作掃描光源激光作掃描光源 掃描焦平面上樣品，得樣品切面像掃描焦平面上樣品，得樣品切面像 載物臺上微量步進(jìn)馬達(dá)使載物臺載物臺上微量步進(jìn)馬達(dá)使載物臺 上下移動上下移動, ,改變焦平面改變焦平面 得不同層次的切面圖像得不同層次的切面圖像計算機(jī)圖像三維重組獲樣品立體圖像計算機(jī)圖像三維重組獲樣品立體圖像 顯微顯微CT 細(xì)胞內(nèi)的各結(jié)構(gòu)可因密度不同而產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的各結(jié)構(gòu)可因密度不同而產(chǎn)生相位差相位差(即光程差即光程差)，不過人眼無法鑒別，不過人眼無法鑒別這種微小的變化。相差顯微鏡能夠這種微小的變化。相差顯微鏡能夠把透過標(biāo)本的把透過標(biāo)本的可見光的光程差或可見光的光程差或相位差

13、，變成振幅差，相位差，變成振幅差，提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。種結(jié)構(gòu)變得清晰可見?？捎糜诳捎糜谟^察活細(xì)胞觀察活細(xì)胞 。相差顯微鏡相差顯微鏡 （phase-contrast microscope）環(huán)形光闌環(huán)形光闌(annular (annular diaphragm) diaphragm)：位于：位于 光源與聚光器之間。光源與聚光器之間。2. 2. 相位板相位板(annular (annular phaseplate) phaseplate)： 物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的直射光或衍射光的

14、相位推遲相位推遲1/41/4，將直射光與折射光分開。，將直射光與折射光分開。在構(gòu)造上，特殊在構(gòu)造上，特殊: :1953年諾貝爾物理獎年諾貝爾物理獎通過致密部分通過致密部分( (如細(xì)胞核如細(xì)胞核), ),速度慢速度慢通過疏松部位通過疏松部位( (如細(xì)胞質(zhì)如細(xì)胞質(zhì)), ),速度快速度快相位差相位差( (光程差光程差) )振幅差振幅差( (明暗差明暗差) )相差顯微鏡相差顯微鏡刀鋒刀鋒樣品樣品液態(tài)氟利昂液態(tài)氟利昂液氮液氮低溫刀低溫刀樣品樣品斷裂示意圖斷裂示意圖升華升華蝕刻蝕刻碳碳鉑鉑用金屬和碳噴鍍，消化樣品用金屬和碳噴鍍，消化樣品收集復(fù)型膜于載網(wǎng)收集復(fù)型膜于載網(wǎng)上，置電鏡下觀察上，置電鏡下觀察快速冷

15、凍快速冷凍低溫斷裂低溫斷裂蝕刻蝕刻復(fù)型復(fù)型 20世紀(jì)世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。 分辨力為分辨力為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。掃描電鏡工作原理：掃描電鏡工作原理： 電子槍電子槍電子束（電子束（20203030 m）第一、二聚光鏡第一、二聚光鏡物鏡（匯聚作物鏡（匯聚作用）用）電子探針（電子探針（幾十埃）幾十埃）在樣品表面掃描，激發(fā)出多種電子信在樣品表面掃描，激發(fā)

16、出多種電子信號（次級電子，電壓信號）號（次級電子，電壓信號）檢測器（捕獲信號，經(jīng)放大、轉(zhuǎn)換）檢測器（捕獲信號，經(jīng)放大、轉(zhuǎn)換）電壓信號電壓信號調(diào)制顯象管亮度調(diào)制顯象管亮度顯示圖像顯示圖像照相記錄。照相記錄。 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。原理：原理：掃描探針與樣品掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離接觸或達(dá)到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間時，即產(chǎn)生彼此間相相互作用力互作用力，電流強(qiáng)度，電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距與針

17、尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，離有函數(shù)關(guān)系，將掃將掃描過程中電流的變化描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像轉(zhuǎn)換為圖像，從而反，從而反映出樣品表面形貌信映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性息、電特性或磁特性等。等。如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，力、磁力、摩擦力等， 電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-X-射線晶體衍射技術(shù)及射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，

18、是當(dāng)前核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)。 是研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系是研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實驗手段。的主要實驗手段。Drosophila melanogasterArabidopsis thaliana植株小植株小 -15 cm種子多種子多- up to 10,000 seeds in a plant周期短周期短- 4 weeks for a cycle基因組小基因組小 -5 chromosomes 140，000 kb（基因組測序完成）（基因組測序完成） 紫外線紫外線為光源，為光源，照射照射被檢物體發(fā)出熒光，被檢物體發(fā)出熒光，在在顯微鏡下觀察形

19、狀及所顯微鏡下觀察形狀及所在位置。在位置。 首先汞燈發(fā)出紫外線，首先汞燈發(fā)出紫外線，經(jīng)第一次濾光片除去較經(jīng)第一次濾光片除去較長的波，使紫外線照到長的波，使紫外線照到樣品上。目鏡下方濾光樣品上。目鏡下方濾光片除去紫外線，使可見片除去紫外線，使可見光通過，以保護(hù)眼睛光通過，以保護(hù)眼睛。電子顯微鏡電子顯微鏡原理原理以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓且波長與加速電壓( (通常通常50-120KV)50-120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。 由由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系

20、統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等等5 5部分構(gòu)成。部分構(gòu)成。 分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。 用于觀察超微結(jié)構(gòu)（用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructureultrastructure），即小于），即小于0.20.2m m、光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)，光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)， 又稱又稱亞顯微結(jié)構(gòu)亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structuressubmicroscopic structures）。）。1. 1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡玻玻璃璃透透鏡鏡的的工工作作原原理理原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放

21、大成像。原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。1 數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑（鏡口率）（鏡口率）NA：指光鏡的匯聚能力，：指光鏡的匯聚能力， N.A = n sin/2 注：注： -鏡口角，鏡口角， n-介質(zhì)折射率。介質(zhì)折射率。 空氣-1、水-133、香柏油-1515、溴萘-16 鏡口角鏡口角是指從物鏡光軸上的物點發(fā)出的光線，與物鏡前是指從物鏡光軸上的物點發(fā)出的光線，與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度。透鏡有效直徑的邊緣所張的角度。 角小于角小于180，/2小于小于90，sin/2最大值不超過最大值不超過1，因，因此此NA不會超過不會超過1。目前最好的顯微鏡。目前最好的顯微鏡=140 一般的

22、顯微鏡上標(biāo)明一般的顯微鏡上標(biāo)明10 /0.65、0.75、0.8等，就是指數(shù)值孔等，就是指數(shù)值孔徑，其大小代表了光鏡匯聚光線的能力，徑，其大小代表了光鏡匯聚光線的能力，大，張角大，光通大，張角大，光通過的多、亮，透性好清晰過的多、亮，透性好清晰光學(xué)顯微鏡物鏡的特性光學(xué)顯微鏡物鏡的特性 人眼的分辨能力在人眼的分辨能力在0.2 mm左右，因此光學(xué)顯微鏡的左右，因此光學(xué)顯微鏡的最大有效放大倍數(shù)（使用油鏡）是最大有效放大倍數(shù)（使用油鏡）是1,000到到1,400。2 分辨力分辨力/率率（resdving power）：）：R， 指指25cm明視距離處，明視距離處，能分辨清楚盡可能靠近的兩個質(zhì)點的能力。

23、能分辨清楚盡可能靠近的兩個質(zhì)點的能力。辨認(rèn)兩點之間辨認(rèn)兩點之間的距離越小，則分辨本領(lǐng)愈高。人裸眼的分辨力約為的距離越小，則分辨本領(lǐng)愈高。人裸眼的分辨力約為100m，（，（實際上實際上200m才是理想的才是理想的）。而顯微鏡分辨力）。而顯微鏡分辨力則以下公式計算：則以下公式計算： R =061/N.A -光源的波長光源的波長 可見光波長可見光波長=0.45m， /2=70， sin/2=0.94 空氣折射率空氣折射率n=1，香柏油，香柏油n=1.5 空氣空氣 R = 0.61 /N.A =0.61*0.45m / （1 *0.94）=0.3m 香柏油香柏油R = 0.61*0.45m / （1.

24、5 *0.94）= 0.2m 光鏡分辨率的最小數(shù)值為光鏡分辨率的最小數(shù)值為0.2m。波長是定值（波長是定值（400nm700nm），后者情況如何呢？），后者情況如何呢？如何提高顯微鏡的分辨率？如何提高顯微鏡的分辨率？R =061/N.A高的分辨力（高的分辨力（R值?。┲敌。?波長，波長， 鏡口率。鏡口率。 NA 也不能隨意增大，一般在也不能隨意增大，一般在005095，用香柏油（油，用香柏油（油鏡）可達(dá)鏡）可達(dá)15，用溴萘可近，用溴萘可近16。這樣，光鏡的最大分辨力。這樣，光鏡的最大分辨力R=（061550）/16=209（nm）（約為可見光最短波長的一）（約為可見光最短波長的一半）。半）。

25、所以，所以，R=02m是光鏡的極限是光鏡的極限，顯微鏡無論制作的如何，顯微鏡無論制作的如何精密，都無法突破這一極限。精密，都無法突破這一極限。 0.61 0.61 R R n sinn sin n: n: 聚光鏡和物鏡之間聚光鏡和物鏡之間 介質(zhì)的折射率介質(zhì)的折射率. . 空氣為空氣為1, 1,油為油為1.51.5 : : 標(biāo)本對物鏡鏡口標(biāo)本對物鏡鏡口 張角的半角張角的半角. . sinsin的最大值為的最大值為1 1 :照明光源的波長照明光源的波長. . 白光為白光為0.5 m0.5 m3 放大倍數(shù)放大倍數(shù)/率率（magnification）：）：M 是最終成像的大小是最終成像的大小 與原物體

26、大小的比值（指長度）與原物體大小的比值（指長度）目鏡放大倍數(shù)目鏡放大倍數(shù)MF目目= 250mm （明視距離）（明視距離）/F目目（目鏡焦距）（目鏡焦距）物鏡放大倍數(shù)物鏡放大倍數(shù)MF物物= 160mm ( 標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)筒長標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)筒長) /F物物(物鏡焦距物鏡焦距)總放大倍數(shù)總放大倍數(shù)MF總總= 標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)筒長標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)筒長/F物物 250/F目目 = 物鏡放大率物鏡放大率目鏡放大率目鏡放大率 M 是否越大越好？怎樣提高是否越大越好？怎樣提高M(jìn) ？最大放大倍數(shù)最大放大倍數(shù) 人眼的分辨率人眼的分辨率( ( 200 200 m )m )光鏡的分辨率光鏡的分辨率( ( 0.2 0.2 m )m ) = =10

27、001000倍倍F目不能太短，因人眼瞳孔要與出射光孔重合，在10 mm以上，放大率不高，約在（250/10）25，光學(xué)筒長（A）不能無限長，所以只有靠減小F物來提高總放大倍數(shù)。光鏡有效放大倍數(shù)受到分辨力限制，只要將R=0.2m，放大到人眼分辨力（0.2 mm）大小，便能觀察該物體。0.2 mm 103/0.2m=103（倍），超過此界限繼續(xù)放大，人眼就看不清其細(xì)節(jié)，是模糊的空放大，無意義。 一般一般 光學(xué)顯微鏡的最大放大率只能是光學(xué)顯微鏡的最大放大率只能是透鏡的數(shù)值孔徑的透鏡的數(shù)值孔徑的1000倍。倍。透鏡的數(shù)值孔徑的范圍是透鏡的數(shù)值孔徑的范圍是1.01.4，所以光學(xué)顯微鏡在用空氣作介，所以光

28、學(xué)顯微鏡在用空氣作介質(zhì)時最大放大倍數(shù)為質(zhì)時最大放大倍數(shù)為1000倍，用油鏡則為倍，用油鏡則為1400倍。倍。 有效放大：有效放大： 上限：物鏡鏡口率上限：物鏡鏡口率1000 ； 下限：物鏡鏡口率下限：物鏡鏡口率250； 可變光闌（光圈）可調(diào)節(jié)開孔大小使聚光鏡的可變光闌（光圈）可調(diào)節(jié)開孔大小使聚光鏡的N.A適應(yīng)于物鏡的適應(yīng)于物鏡的N.A，如果聚光鏡的如果聚光鏡的N.A小于物鏡小于物鏡N.A，則造成物鏡，則造成物鏡NA不能充分發(fā)揮。不能充分發(fā)揮。正確匹配目、物鏡，以保證物象清晰度。正確匹配目、物鏡，以保證物象清晰度。顯微鏡適合的放大倍數(shù)顯微鏡適合的放大倍數(shù) 決定于物鏡的數(shù)值孔徑，一般應(yīng)為決定于物鏡

29、的數(shù)值孔徑，一般應(yīng)為NA的的 500-1000倍，倍，M=NA（500-1000）。）。 在選擇放大倍數(shù)時，一定注意鏡頭的匹配，在物鏡與目鏡的組合中，在選擇放大倍數(shù)時，一定注意鏡頭的匹配，在物鏡與目鏡的組合中， 目鏡有效放大倍數(shù)為：目鏡有效放大倍數(shù)為： M=目鏡倍數(shù)（目鏡倍數(shù)（O）物鏡倍數(shù)（物鏡倍數(shù)（B） OB=NA（500-1000） O=NA（500-1000）/B。4 焦點深度焦點深度 在視野中垂直范圍內(nèi)能觀察到的界限。也就是調(diào)焦看清在視野中垂直范圍內(nèi)能觀察到的界限。也就是調(diào)焦看清楚某一物點時，不僅這一點清楚，此點的上下兩側(cè)也能看清楚，能看清楚某一物點時，不僅這一點清楚，此點的上下兩側(cè)也

30、能看清楚，能看清楚的厚度稱為焦點深度。以下式表示：楚的厚度稱為焦點深度。以下式表示： d=Kn/MNA K常數(shù)，約常數(shù)，約0.24mm； M為總放大倍數(shù)；為總放大倍數(shù)； n為介質(zhì)折射率為介質(zhì)折射率 從上式看出，放大倍數(shù)愈高，數(shù)值孔徑愈大，則焦點深度愈淺從上式看出，放大倍數(shù)愈高，數(shù)值孔徑愈大，則焦點深度愈淺5 工作距離工作距離 指從物鏡鏡面表面到蓋玻片上表面之間的距離指從物鏡鏡面表面到蓋玻片上表面之間的距離。在物鏡孔。在物鏡孔徑一定的條件下，工作距離越小，孔徑角就愈大，數(shù)值孔徑也越大，所徑一定的條件下，工作距離越小，孔徑角就愈大，數(shù)值孔徑也越大，所以高倍鏡工作距離很小。以高倍鏡工作距離很小。6

31、鏡像亮度和視場亮度鏡像亮度和視場亮度 鏡像亮度鏡像亮度：指鏡下圖像的亮度。：指鏡下圖像的亮度。 視場亮度視場亮度：鏡下整個視場的明暗程度。除與目、物鏡有關(guān)外，還與：鏡下整個視場的明暗程度。除與目、物鏡有關(guān)外，還與 聚光鏡、光闌、反光鏡和光源有關(guān)。聚光鏡、光闌、反光鏡和光源有關(guān)。7 反差（反差（contrast） 指觀察物與背景的對比程度。在光鏡和電指觀察物與背景的對比程度。在光鏡和電鏡有所不同。鏡有所不同。在光鏡（光學(xué)像）：在光鏡（光學(xué)像）： 由于被檢物各部分結(jié)構(gòu)不同，因而吸收由于被檢物各部分結(jié)構(gòu)不同，因而吸收或反射光線強(qiáng)弱程度差異而引起或反射光線強(qiáng)弱程度差異而引起“亮度差亮度差”或或“色度差

32、色度差”。 在電鏡（電子像）：在電鏡（電子像）： 由于被檢物各不同部位對入射電子具有由于被檢物各不同部位對入射電子具有不同散射度而引起不同散射度而引起“濃淡差濃淡差”。（電子束基本上是單色光，。（電子束基本上是單色光，它與被檢物之間不產(chǎn)生色的反應(yīng)，在像中顯示出來的僅是濃它與被檢物之間不產(chǎn)生色的反應(yīng)，在像中顯示出來的僅是濃淡差別）。淡差別）。從整個生命科學(xué)的發(fā)展趨勢看細(xì)胞從整個生命科學(xué)的發(fā)展趨勢看細(xì)胞 生物學(xué)方法生物學(xué)方法 分子水平 細(xì)胞水平 結(jié)構(gòu)功能 細(xì)胞生命活動 分析 綜合 功能基因組學(xué)研究是細(xì)胞生物學(xué)研究的基礎(chǔ)與歸宿（生命科學(xué)研究的核心問題）取材與取材與固定固定：保持材料新鮮保持材料新鮮，

33、使活細(xì)胞組成成分、物質(zhì)固定，使活細(xì)胞組成成分、物質(zhì)固定，代代謝停止，謝停止，常用的有鮑威氏法、福爾馬林固定常用的有鮑威氏法、福爾馬林固定脫水與透明脫水與透明：先用蒸餾水洗滌沖洗后，再脫水，用先用蒸餾水洗滌沖洗后，再脫水，用30%30%的酒精沖的酒精沖洗，把胞內(nèi)水分逐漸替換出來，并防止萎縮；洗，把胞內(nèi)水分逐漸替換出來，并防止萎縮；透明劑透明劑的作用是的作用是下一步順利進(jìn)蠟，二甲苯能把材料組織細(xì)胞中酒精替換出來下一步順利進(jìn)蠟，二甲苯能把材料組織細(xì)胞中酒精替換出來進(jìn)蠟與進(jìn)蠟與包埋包埋：用石蠟溶液進(jìn)入細(xì)胞代替二甲苯，一般在溫箱石蠟用石蠟溶液進(jìn)入細(xì)胞代替二甲苯，一般在溫箱石蠟溶液中；溶液中；包埋包埋就是

34、放在冷水環(huán)境中很快使石蠟?zāi)蹋褪欠旁诶渌h(huán)境中很快使石蠟?zāi)?，使組織變使組織變得堅硬，便于切片得堅硬，便于切片 切片切片： 切片機(jī)上進(jìn)行切片機(jī)上進(jìn)行脫蠟脫蠟: : 10-1510-15分鐘；分鐘；1/21/2二甲苯和二甲苯和1/21/2酒精酒精純酒精純酒精95%95%酒精酒精- - 85% - 70%85% - 70%各各2323分鐘分鐘染色染色：番紅、醋酸洋紅，染色番紅、醋酸洋紅，染色424424小時小時封固封固：中性塑膠，蓋片風(fēng)干中性塑膠，蓋片風(fēng)干Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in

35、green 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。觀察、基因定位、疾病診斷。用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本倒置顯微鏡倒置顯微鏡 物鏡物鏡與與照明系統(tǒng)照明系統(tǒng)顛倒，顛倒，前者在載物臺之下，后者前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有，通常具有相差物鏡，有的還具有熒相差物鏡，有的還具有熒光裝置。光裝置。暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡 dark field microscope 聚光鏡中央有擋光片，照明聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允

36、光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而進(jìn)入物鏡，因而視野的背景視野的背景是黑的是黑的，物體的邊緣是亮的物體的邊緣是亮的 可觀察可觀察 4200nm的微粒子，的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高分辨率比普通顯微鏡高50倍倍 觀察物體輪廓觀察物體輪廓透射式電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)透射式電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu) 1 電子束照明系統(tǒng)電子束照明系統(tǒng) 包括電子槍和聚光鏡。有高頻電流加熱鎢絲發(fā)包括電子槍和聚光鏡。有高頻電流加熱鎢絲發(fā)出電子，經(jīng)高電壓使電子加速，經(jīng)聚光鏡匯聚成電子束出電子，經(jīng)高電壓使電子加速，經(jīng)聚光鏡匯聚成電子束2 成像系統(tǒng)成像系統(tǒng) 包括物鏡、中間鏡及投影鏡組

37、成。物鏡直接將樣品放包括物鏡、中間鏡及投影鏡組成。物鏡直接將樣品放大，中間鏡和投影鏡進(jìn)一步把物鏡的像放大。大，中間鏡和投影鏡進(jìn)一步把物鏡的像放大。 物鏡、中間鏡、投影鏡均為電子透鏡（磁透鏡），它是沿一光物鏡、中間鏡、投影鏡均為電子透鏡（磁透鏡），它是沿一光軸呈旋轉(zhuǎn)對稱的電磁場，可使從軸上一點發(fā)出的電子，重新會聚在軸呈旋轉(zhuǎn)對稱的電磁場，可使從軸上一點發(fā)出的電子，重新會聚在中心軸的另一點上。中心軸的另一點上。 磁透鏡是由一只大的電磁圈組成，好像一個螺旋管，當(dāng)電流通磁透鏡是由一只大的電磁圈組成，好像一個螺旋管，當(dāng)電流通過時便可產(chǎn)生磁場，磁場對電子來說是折射介質(zhì)。過時便可產(chǎn)生磁場，磁場對電子來說是折射

38、介質(zhì)。4 觀察記錄系統(tǒng)：觀察記錄系統(tǒng)： 投影鏡下面的觀察室中裝有熒光屏，顯現(xiàn)出標(biāo)本的電子顯微投影鏡下面的觀察室中裝有熒光屏，顯現(xiàn)出標(biāo)本的電子顯微像，便于觀察。同時裝有自動拍攝系統(tǒng)，以便把顯示圖像拍攝像，便于觀察。同時裝有自動拍攝系統(tǒng)，以便把顯示圖像拍攝下來供觀察分析。下來供觀察分析。3 真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 鏡筒中的高速電子和氣體分子間的相互作用，與氣體分子間鏡筒中的高速電子和氣體分子間的相互作用，與氣體分子間的相互作用一樣，會使高速電子散射而偏離直線；此外，電子的相互作用一樣，會使高速電子散射而偏離直線；此外，電子槍中存在氣體會產(chǎn)生電離和放電，引起電子束的不穩(wěn)定或閃爍，槍中存在氣體會產(chǎn)生電離和放

39、電，引起電子束的不穩(wěn)定或閃爍，還會腐蝕燈絲；再者，真空可保護(hù)透鏡和防止標(biāo)本污染。所以，還會腐蝕燈絲；再者，真空可保護(hù)透鏡和防止標(biāo)本污染。所以，電子顯微鏡的真空度越高越好，一般采用電子顯微鏡的真空度越高越好，一般采用104乇（乇（torr）相當(dāng)于）相當(dāng)于107大氣壓。大氣壓。 基本要求基本要求 1 1 細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好，不產(chǎn)生明顯的物質(zhì)凝聚、丟失細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好，不產(chǎn)生明顯的物質(zhì)凝聚、丟失或添加人工效應(yīng)等；或添加人工效應(yīng)等； 2 2 切片厚度在切片厚度在500500埃左右，最大不超過埃左右，最大不超過10001000埃埃（1mm1mm厚的樣品厚的樣品切成切成2000020000片；一個一

40、般大小的細(xì)胞要切成片；一個一般大小的細(xì)胞要切成300300片）片） 顏色顏色 厚度（埃）厚度（埃） 暗灰色暗灰色 400 灰色灰色 400500 銀色銀色 500700 金黃色金黃色 700900 紫色紫色 900以上以上 3 切片應(yīng)耐受電子束的轟擊，包埋介質(zhì)不發(fā)生變形；切片應(yīng)耐受電子束的轟擊，包埋介質(zhì)不發(fā)生變形； 4 切片應(yīng)具有良好的反差；切片應(yīng)具有良好的反差； 5 切片需均勻，沒有皺褶、刀痕及染色劑沉淀等缺陷切片需均勻，沒有皺褶、刀痕及染色劑沉淀等缺陷一、超薄切片技術(shù)一、超薄切片技術(shù) 1 緩沖液緩沖液 1）磷酸緩沖液）磷酸緩沖液 2）二甲砷酸鈉緩沖液）二甲砷酸鈉緩沖液 2 固定液固定液 1

41、）戊二醛固定液）戊二醛固定液 2）2%鋨酸貯存液鋨酸貯存液 3）高錳酸鉀液）高錳酸鉀液 4）多聚甲醛液）多聚甲醛液 3 支持膜（液）支持膜（液） 4 染色液染色液 1 緩沖液緩沖液 維持細(xì)胞與固定液之間的平衡，消除細(xì)胞內(nèi)釋出的氫、氧離子，保持維持細(xì)胞與固定液之間的平衡，消除細(xì)胞內(nèi)釋出的氫、氧離子，保持固定液的固定液的PH值在正常生理值范圍內(nèi)。常用磷酸鹽、檸檬酸鹽、砷酸鈉液值在正常生理值范圍內(nèi)。常用磷酸鹽、檸檬酸鹽、砷酸鈉液 1）磷酸緩沖液）磷酸緩沖液 配制固定液用，該緩沖液對組織無毒害，不易產(chǎn)生配制固定液用，該緩沖液對組織無毒害，不易產(chǎn)生假象，對細(xì)胞膜、核保存好，使細(xì)胞基質(zhì)致密均一。假象，對細(xì)

42、胞膜、核保存好，使細(xì)胞基質(zhì)致密均一。（一）各種試劑制備（一）各種試劑制備配配 法法 甲液：甲液：0.2M磷酸二氫鈉溶液磷酸二氫鈉溶液 NaH2PO42H2O 31.2g 蒸餾水加至蒸餾水加至 100ml 乙液：乙液：0.2M磷酸氫二鈉溶液磷酸氫二鈉溶液 Na2HPO42H2O 53.61g 或或 ( Na2HPO47H2O 53.65g Na2HPO412H2O 71.64g ) 蒸餾水加至蒸餾水加至 1000 ml 將甲、乙兩液按下表混合，則成不同將甲、乙兩液按下表混合，則成不同pH的的0.2M磷酸緩磷酸緩沖液。沖液。 pH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液甲液 13.3

43、 18.8 24.5 30.5 36 40.5 乙液乙液 30.7 31.2 26.5 19.5 14 9.5有些實驗有些實驗要避免磷的干擾，則選用二甲砷酸鈉緩沖液要避免磷的干擾，則選用二甲砷酸鈉緩沖液，即：，即：配制配制0.2M的二甲砷酸鈉緩沖液。的二甲砷酸鈉緩沖液。 甲液：甲液： 二甲砷酸鈉二甲砷酸鈉 21.4 g 蒸餾水加至蒸餾水加至 250 ml。 乙液：乙液： 0.2N HCL 按下表混合，并加蒸餾水至按下表混合，并加蒸餾水至100ml，便得不同，便得不同PH 的的0.2M緩緩沖液，沖液， pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 甲液甲液 50 50 50 50 50 乙液乙液

44、 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7 本液穩(wěn)定，可長期存放使用本液穩(wěn)定，可長期存放使用2）二甲砷酸鈉緩沖液）二甲砷酸鈉緩沖液2 固定液固定液 1）戊二醛固定液）戊二醛固定液 常用濃度常用濃度2.5% 2）2%鋨酸貯存液鋨酸貯存液 鋨酸，即四氧化鋨（鋨酸，即四氧化鋨（OsO4）是一種）是一種 淡黃色結(jié)晶，具有強(qiáng)烈的刺激味，其水溶液是中性的。淡黃色結(jié)晶，具有強(qiáng)烈的刺激味，其水溶液是中性的。 配方：配方： OsO4 2g 加雙蒸水溶解成加雙蒸水溶解成100ml 配法：配法：一定在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。鋨酸有強(qiáng)烈毒性，對粘膜和角膜有固定作一定在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。鋨酸有強(qiáng)烈毒性，對粘膜和角膜有固定作用。使用前

45、幾天，先將成品鋨酸安瓶上標(biāo)簽洗去，用洗液浸泡用。使用前幾天，先將成品鋨酸安瓶上標(biāo)簽洗去，用洗液浸泡12hr12hr，再，再將安瓶固定在玻棒一端，（以避免用手接觸安瓶）放入燒杯中自來水沖洗將安瓶固定在玻棒一端，（以避免用手接觸安瓶）放入燒杯中自來水沖洗干凈，后用蒸餾水徹底沖洗，衛(wèi)生紙吸干水分，放入通風(fēng)櫥，戴上橡膠手干凈，后用蒸餾水徹底沖洗，衛(wèi)生紙吸干水分，放入通風(fēng)櫥，戴上橡膠手套，用沙磚在安瓶頸部劃一痕，插入棕色磨口瓶中折斷，連同安瓶一并放套，用沙磚在安瓶頸部劃一痕，插入棕色磨口瓶中折斷，連同安瓶一并放入，瓶內(nèi)預(yù)先放好所需蒸餾水，仔細(xì)搖勻后用指套套住存放備用。用時與入，瓶內(nèi)預(yù)先放好所需蒸餾水，仔

46、細(xì)搖勻后用指套套住存放備用。用時與等量等量0.1mol/L0.1mol/L的磷酸沖液（的磷酸沖液（pH7.4pH7.4）混合即可。）混合即可。3）高錳酸鉀液）高錳酸鉀液 4）多聚甲醛液）多聚甲醛液3 支持膜（液）支持膜（液） 1 1）火棉膠膜；）火棉膠膜； 2 2）碳膜；）碳膜； 3 3）0.25%Formvar0.25%Formvar聚乙烯醇縮甲醛聚乙烯醇縮甲醛氯仿液氯仿液 將市售氯傷將市售氯傷( (分析純分析純) )在在6060電熱套上重蒸餾電熱套上重蒸餾( (通風(fēng)櫥中進(jìn)行通風(fēng)櫥中進(jìn)行) ) Formvar 250mg 經(jīng)蒸餾的氯仿經(jīng)蒸餾的氯仿 100ml 密閉后保存干燥器備用密閉后保存干

47、燥器備用4 染色液染色液 醋酸雙氧鈾染液醋酸雙氧鈾染液 50%（或（或70%）乙醇（或丙酮）乙醇（或丙酮） 100ml 醋酸雙氧鈾醋酸雙氧鈾 2g 在棕色磨口瓶中混勻溶解，低溫暗處在棕色磨口瓶中混勻溶解，低溫暗處23天后取用上清液天后取用上清液5 包埋劑包埋劑目的：包埋使組織變得堅硬目的：包埋使組織變得堅硬, ,便于切片。便于切片。機(jī)理：可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，起支持作用。機(jī)理：可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，起支持作用。 1）國產(chǎn)環(huán)氧樹脂配方）國產(chǎn)環(huán)氧樹脂配方 618#環(huán)氧樹脂環(huán)氧樹脂 5ml 順丁烯二酸酐順丁烯二酸酐 2g 鄰苯二甲酸二丁脂（鄰苯二甲酸二丁脂（DBP） 1.52ml 二乙基苯胺二乙基苯胺 0.4ml

48、依次加入溶解均勻，備用依次加入溶解均勻，備用 2）進(jìn)口環(huán)氧樹脂）進(jìn)口環(huán)氧樹脂EPON812配方配方 甲液（較軟）：甲液（較軟）：EPON812 10ml DDSA（十二烷基濾酸酐）（十二烷基濾酸酐） 16ml 乙液（較硬）：乙液（較硬）：EPON812 10ml MNA（六甲酸酐）（六甲酸酐） 9.8ml 存于冰箱，用時混勻。冬季：甲乙存于冰箱，用時混勻。冬季：甲乙=46 夏季：甲乙夏季：甲乙=37 用注射器將甲、乙兩液混合，再以總體積的用注射器將甲、乙兩液混合，再以總體積的1.52%之比加入之比加入DMP30（二甲氨基甲苯酚）充分?jǐn)嚢杈鶆?，封好備用。（二甲氨基甲苯酚）充分?jǐn)嚢杈鶆?，封好備用?/p>

49、5 5 包埋劑包埋劑1 取材取材 2 初固定初固定3 漂洗漂洗 4 再固定再固定（二）制片過程（二）制片過程要求：要求： a .a .動作迅速；動作迅速；b. b. 材料體積小于材料體積小于1mm1mm3 3；c.c. 機(jī)機(jī)械損傷要?。ǖ朵h利動作輕巧）；械損傷要?。ǖ朵h利動作輕巧）；d.d. 取材部位準(zhǔn)確；取材部位準(zhǔn)確；e e . .操作最好在低溫（操作最好在低溫（0404）處進(jìn)行。）處進(jìn)行。迅速解剖動、植物組織，將其放在滴有戊二醛（冷）迅速解剖動、植物組織，將其放在滴有戊二醛（冷）的卡片紙上，用鋒利刀片切成的卡片紙上，用鋒利刀片切成0.51mm0.51mm3 3小塊，放入盛小塊，放入盛有冷戊

50、二醛的小稱量瓶中固定有冷戊二醛的小稱量瓶中固定3 3小時以上（低溫小時以上（低溫44）用用PH7.0PH7.0（植物）、（植物）、7.27.2（動物）（動物）磷酸緩沖液沖洗磷酸緩沖液沖洗3 3次次以上以上(12hr)(12hr)，以除去游離的與組織結(jié)合不牢的固定，以除去游離的與組織結(jié)合不牢的固定液液( (游離醛游離醛) )；戊二醛易與鋨酸形成一種細(xì)小顆粒而污；戊二醛易與鋨酸形成一種細(xì)小顆粒而污染整個切片。染整個切片。 在通風(fēng)櫥內(nèi)棄去漂洗液，加入適量配好的鋨酸，塞在通風(fēng)櫥內(nèi)棄去漂洗液，加入適量配好的鋨酸，塞上瓶塞，固定上瓶塞，固定2hr2hr，使材料變黑。，使材料變黑。目的：使大分子交聯(lián)而保持固

51、定，不至在后面過程中移位或丟失。機(jī)理：可與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價鍵，將鄰近蛋白分子交聯(lián)。雙重固定法：單用鋨酸不能很好的保護(hù)糖元及其它碳水化合物；戊二醛與鋨酸相互取長補(bǔ)短，固定效果更好。較好地保存胞內(nèi)主要化學(xué)成分5 再漂洗再漂洗 棄鋨酸于廢液瓶中，加適量緩沖液漂洗棄鋨酸于廢液瓶中，加適量緩沖液漂洗3次，每次次，每次15，以后移，以后移出通風(fēng)櫥。出通風(fēng)櫥。漂洗的目的是洗凈多余的鋨酸漂洗的目的是洗凈多余的鋨酸，以免與下步脫水時所用乙醇作，以免與下步脫水時所用乙醇作用發(fā)生沉淀。用發(fā)生沉淀。6 脫水脫水 組織塊分別經(jīng)過組織塊分別經(jīng)過50%、70%、80%、90%、95%上行上行梯度酒精梯度酒精各各20

52、，再經(jīng)過三次，再經(jīng)過三次100%酒精各酒精各10，當(dāng)天完不成脫水過程時，可停在，當(dāng)天完不成脫水過程時，可停在70%酒酒精中存放。精中存放。脫水？脫水？ 常用包埋劑是非水溶性的，只有將細(xì)胞中的游離水分徹底常用包埋劑是非水溶性的，只有將細(xì)胞中的游離水分徹底清除之后，非水溶性的包埋劑才能滲入清除之后，非水溶性的包埋劑才能滲入7 浸透浸透 用包埋劑逐漸取代組織中的脫水劑，使細(xì)胞內(nèi)外所有的空隙都被用包埋劑逐漸取代組織中的脫水劑，使細(xì)胞內(nèi)外所有的空隙都被包埋劑充填。包埋劑充填。 1/2脫水劑（脫水劑（100%Alo）+1/2稀釋劑（環(huán)氧丙烷）稀釋劑（環(huán)氧丙烷）2040 稀釋劑稀釋劑環(huán)氧丙烷環(huán)氧丙烷 20

53、1/2稀釋劑（環(huán)氧丙烷）稀釋劑（環(huán)氧丙烷）+1/2包埋劑包埋劑 1hr 包埋劑包埋劑過夜或過夜或12天，溫度天，溫度20。梯度酒精脫水？梯度酒精脫水？ 急劇的脫水會引起細(xì)胞收縮急劇的脫水會引起細(xì)胞收縮8 包埋包埋9 固化固化 包埋好的膠囊，在包埋好的膠囊，在60溫箱中加溫固化溫箱中加溫固化2436hr，使完全聚合，使完全聚合硬化，制成包埋塊。硬化，制成包埋塊。10 切片切片 在超薄切片機(jī)上進(jìn)行。在著手進(jìn)行超薄切片前，尚需完成制在超薄切片機(jī)上進(jìn)行。在著手進(jìn)行超薄切片前，尚需完成制備支持膜、修整包埋塊及制作玻璃刀等工作。備支持膜、修整包埋塊及制作玻璃刀等工作。 熱脹式超薄切片機(jī)：熱脹式超薄切片機(jī)：

54、 LKB型型(瑞典瑞典)常用常用; Reichert OmV2型型(奧地利奧地利) 機(jī)械式超薄切片機(jī)：機(jī)械式超薄切片機(jī)： Perter-Blum型；型； Sotvall MT/5000型型(美國美國)； Huxley型（英國劍橋）；型（英國劍橋）； UM-3型（日本）。型（日本）。 1）支持膜的制備）支持膜的制備 最常使用最常使用200目（目（3 mm）的銅網(wǎng)。用前需經(jīng)丙酮清洗幾遍，然后）的銅網(wǎng)。用前需經(jīng)丙酮清洗幾遍，然后再用無水酒精洗幾次，以徹底去除油污。挑選清洗好的銅網(wǎng)，尚需在再用無水酒精洗幾次，以徹底去除油污。挑選清洗好的銅網(wǎng)，尚需在其上覆蓋一層薄膜（小于其上覆蓋一層薄膜（小于200埃）

55、，即支持膜。埃），即支持膜。常用碳膜、火棉膠膜或常用碳膜、火棉膠膜或Formvar膜（孚爾膜），即聚乙烯醇縮甲醛。膜（孚爾膜），即聚乙烯醇縮甲醛。 支持膜的制備支持膜的制備 修塊修塊 制作玻璃刀制作玻璃刀 制作水槽制作水槽 撈片撈片11 染色染色 目的目的：增強(qiáng)樣品中各種結(jié)構(gòu)圖象之間的反差或選擇性地增強(qiáng)樣品中各種結(jié)構(gòu)圖象之間的反差或選擇性地顯示某些結(jié)構(gòu)或成分。顯示某些結(jié)構(gòu)或成分。 方法方法：采用醋酸雙氧鈾（細(xì)胞核、結(jié)締組織）采用醋酸雙氧鈾（細(xì)胞核、結(jié)締組織）檸檬檸檬酸鉛（細(xì)胞質(zhì)）雙染法。酸鉛（細(xì)胞質(zhì)）雙染法。A.A.選擇性染色選擇性染色蘇木精細(xì)胞內(nèi)核酸的分布蘇木精細(xì)胞內(nèi)核酸的分布 伊伊 紅細(xì)胞

56、質(zhì)染色紅細(xì)胞質(zhì)染色B.B.特異性染色特異性染色 酶酶 + + 底物底物 抗原抗原 + + 抗體抗體基本原理基本原理 又稱冷凍蝕刻，冷凍復(fù)型（又稱冷凍蝕刻，冷凍復(fù)型（freeze-replica）、冷）、冷凍斷裂（凍斷裂（freeze-fracture）是一種由冷凍斷裂與復(fù)型相結(jié)合）是一種由冷凍斷裂與復(fù)型相結(jié)合的樣品制備技術(shù)。最早由的樣品制備技術(shù)。最早由Hall，G. E.（1950）首先提出，直）首先提出，直到到1957年才由年才由Steere用于生物樣品的制備?，F(xiàn)已成為電子顯用于生物樣品的制備。現(xiàn)已成為電子顯微鏡技術(shù)中一個獨(dú)具特色的分支，并得到廣泛的應(yīng)用。微鏡技術(shù)中一個獨(dú)具特色的分支，并得到

57、廣泛的應(yīng)用。 該技術(shù)是該技術(shù)是采用冷凍的方法使樣品迅速固定硬化，然后在采用冷凍的方法使樣品迅速固定硬化，然后在真空中切斷，升溫使冰升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)（蝕刻）。再真空中切斷，升溫使冰升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)（蝕刻）。再在切面上噴鍍一層鉑在切面上噴鍍一層鉑碳投影膜，碳投影膜，然后將組織溶掉，把碳和然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replicareplica），），撈至鋼網(wǎng)上在撈至鋼網(wǎng)上在電鏡下觀察。電鏡下觀察。冰凍蝕刻技術(shù)（冰凍蝕刻技術(shù)（freeze etching）4 基本步驟基本步驟 樣品固定樣品固定冷凍冷凍斷裂斷裂蝕刻蝕刻復(fù)型復(fù)型剝離剝離撈膜撈膜觀

58、察。觀察。下面以動物材料為例，說明操作過程。下面以動物材料為例，說明操作過程。 1）樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理 切成小條（長切成小條（長3mm，寬，寬1-1.5 mm）；）； 2）削制碳棒及燒制鉑珠削制碳棒及燒制鉑珠; 3）樣品冷凍樣品冷凍 a、斷裂裝置組裝好，入液氮冷凍。、斷裂裝置組裝好，入液氮冷凍。b、將樣品修整好裝入、將樣品修整好裝入樣品杯的孔中，用自制小鋁提勺入液氮中冷凍。冷凍結(jié)束后（停止沸騰）迅樣品杯的孔中，用自制小鋁提勺入液氮中冷凍。冷凍結(jié)束后（停止沸騰）迅速將樣品杯放入樣品座的凹槽內(nèi)，再一塊入液氮。速將樣品杯放入樣品座的凹槽內(nèi)，再一塊入液氮。 4）斷裂）斷裂 冷凍結(jié)束，迅速將提藍(lán)移到真

59、空噴鍍儀中開機(jī)抽真空，使冷凍結(jié)束，迅速將提藍(lán)移到真空噴鍍儀中開機(jī)抽真空，使真空度達(dá)到真空度達(dá)到310-5托，此時溫度約在托，此時溫度約在-100110。速板動拉桿使支撐。速板動拉桿使支撐塊滑脫，刀座即下滑將樣品切斷。塊滑脫，刀座即下滑將樣品切斷。5）蝕刻）蝕刻 加溫使其保持在加溫使其保持在-96100，真空度在，真空度在110-5310-6托，托，斷面上的冰即開始升華，持續(xù)約斷面上的冰即開始升華，持續(xù)約60秒左右。秒左右。 6）制作復(fù)型）制作復(fù)型 首先以斷面首先以斷面45度度角噴鉑角噴鉑碳，有必要的反差，約需碳，有必要的反差，約需23秒。然后再以秒。然后再以90度度角噴碳，以加固復(fù)型。每次角噴

60、碳，以加固復(fù)型。每次1秒，間隔秒，間隔34秒，秒，共噴共噴45次。次。 7）剝離）剝離 將樣品小心取出放在次氯酸鈉溶液中腐蝕。將樣品小心取出放在次氯酸鈉溶液中腐蝕。 8）撈取觀察）撈取觀察將復(fù)型膜小心撈至銅網(wǎng)上，染色后在將復(fù)型膜小心撈至銅網(wǎng)上，染色后在TEM觀察分析。觀察分析。5 復(fù)型電鏡圖象的辨認(rèn)復(fù)型電鏡圖象的辨認(rèn)（Branton命名法）E半膜半膜（extra-cellular half）：指與細(xì)胞外間隙或細(xì)胞內(nèi)間隙（相）：指與細(xì)胞外間隙或細(xì)胞內(nèi)間隙（相鄰的半膜。鄰的半膜。P半膜半膜（protplasmic half）：指與細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)及線粒體基質(zhì)相）：指與細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)及線粒體基質(zhì)相鄰的半膜