DB53∕T 1073-2021 甘蔗雜交育種獨(dú)立親本系統(tǒng)的創(chuàng)制及培育技術(shù)規(guī)程

1、 ICS65.020CCS B0553云南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB53/T10732021甘蔗雜交育種獨(dú)立親本系統(tǒng)的創(chuàng)制及培育技術(shù)規(guī)程2021-12-10發(fā)布2022-03-10實(shí)施 DB53/T10732021前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。I DB53/T10732021甘蔗雜交育種獨(dú)立親本系統(tǒng)的創(chuàng)制及培育技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了甘蔗雜交育種獨(dú)立親本系統(tǒng)創(chuàng)制中涉及的優(yōu)良性狀界定、獨(dú)立親本系統(tǒng)創(chuàng)制及獨(dú)立親本系統(tǒng)培育等技術(shù)要求。本文件適用于甘蔗雜交育種新獨(dú)立親本系統(tǒng)的創(chuàng)制與培育。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)

2、成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB53/T 734甘蔗實(shí)生苗培育技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1甘蔗屬原種 original ancestor of Saccharum L.甘蔗屬內(nèi)未經(jīng)過人工雜交及馴化，保持原有種性的栽培原種及野生種簡稱甘蔗屬原種。本規(guī)程甘蔗屬栽培原種包括熱帶種（S. officinarum）、中國種（S. sinense）和印度種（S. barberi）3個(gè)種，甘蔗屬野生種包括割手密（S. spontaneum）和大莖野生種（S. robu

3、stum）2個(gè)種。3.2新原種 new original ancestor of Saccharum L.不包含在世界公認(rèn)的POJ2878和Co290親本系統(tǒng)中的甘蔗屬栽培原種9個(gè)無性系（B.Hitan、B.Cheribon、Chunnee、Crystalina、Lahaina、Loethers、FiJi、K.Boothan、W.Transparent）和野生種2個(gè)無性系（S.spont/Co、S.spont/G），其余所有原種個(gè)體均稱為新原種。3.3異質(zhì)率 heterogeneity rate新獨(dú)立親本系統(tǒng)與現(xiàn)有POJ2878和Co290系統(tǒng)比較，采用系譜法計(jì)算使用的新原種的數(shù)量占系統(tǒng)中甘蔗

4、屬原種數(shù)的百分率。3.4雜交伴侶 partner不同無性系個(gè)體之間進(jìn)行的雜交，雜交的雙方互為雜交伴侶。3.5性狀互補(bǔ) character complementation指親本一方的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)在很大程度上彌補(bǔ)另一親本的缺點(diǎn)，便于創(chuàng)制出具有雙親優(yōu)良性狀的子代，如高產(chǎn)與高糖、中大莖與多莖、大莖與多莖、抗病與抗蟲等。1 DB53/T107320214優(yōu)良性狀界定早熟、高產(chǎn)、高糖、中大莖、大莖、有效莖中等以上，抗病、抗蟲和抗逆等達(dá)中抗以上，具體要求見表1。表 1優(yōu)良性狀早熟高產(chǎn)高糖莖徑（cm）莖數(shù)（莖）抗性主要病蟲害（黑穗病、銹病、花葉病、稍腐病等，蚜蟲、螟蟲、粘蟲、薊馬等）及逆境（旱害、凍害及寒害等）達(dá)中

5、抗及以上。成熟初期 11月12月甘蔗平均糖分達(dá)13.5%甘蔗蔗糖分比對照增加0.5個(gè)百分點(diǎn)及以上單位面積比對照種2.5中大莖3.0大莖3.03中等4多莖5增產(chǎn) 5%及以上5獨(dú)立親本系統(tǒng)創(chuàng)制5.1新原種的選擇選擇至少具有一個(gè)優(yōu)良性狀的新原種。5.2雜交伴侶的選配5.2.1母本與父本栽培原種間雜交，以優(yōu)良性狀多的為母本，優(yōu)良性狀較少的為父本。甘蔗屬內(nèi)栽培原種與野生種雜交，以栽培原種為母本，以性狀互補(bǔ)性好的野生種為父本。5.2.2親本血緣比例提供生產(chǎn)親本，野生血緣比例不超過25 %。如提供生產(chǎn)利用的親本為F2代種時(shí)，其4個(gè)原種中最多有1個(gè)為野生種；若提供生產(chǎn)利用的親本為F3代種時(shí)，其8個(gè)原種中最多有

6、2個(gè)為野生種。5.3對等雜交雜交伴侶各自所含原種數(shù)量及其遺傳代數(shù)完全相等的雜交，方法如下：a)原種與原種間雜交產(chǎn)生的高貴化F1代種；b)高貴化F1代相互雜交（F1F1），獲得更高貴化的F2代種；c)以此類推，獲得F3代或更高代種的雜交方式。5.4獨(dú)立親本系統(tǒng)確定2 DB53/T10732021對等雜交培育產(chǎn)生的新獨(dú)立親本系統(tǒng)所含新原種與傳統(tǒng)的POJ2878和Co290系統(tǒng)沒有或極少重復(fù)，異質(zhì)率達(dá)80 %及以上，遺傳性穩(wěn)定、優(yōu)良性狀多的F2及以上代數(shù)的親本系統(tǒng)。6獨(dú)立親本系統(tǒng)培育6.1母本殺雄50水浴3 min 5 min殺雄，不應(yīng)自交。6.2隔離遮蔽或罩住雜交伴侶整個(gè)花穗（1.5 m2.0 m

7、高），不應(yīng)串粉。6.3雜交在隔離罩中將父本花穗置于母本上方，母本花穗頂部置于父本花穗下半部約1/3處1/2處，每日輕搖父本2次3次授粉。6.4實(shí)生苗培育參照DB53/T 734執(zhí)行。6.5后代選擇對各級雜交獲得的種子培育實(shí)生苗，經(jīng)田間試驗(yàn)評價(jià)，在含有親本主要特性的前提下，選擇優(yōu)良性狀多的個(gè)體。6.6真實(shí)性鑒定采用簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat, SSR）分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行真實(shí)性鑒定，方法參見附錄A。6.7利用已經(jīng)通過真實(shí)性鑒定，達(dá)到遺傳性穩(wěn)定、工農(nóng)藝性狀和抗性性狀要求指標(biāo)的材料，F(xiàn)2代就可用于選配雜交組合，提供甘蔗育種單位培育新品種利用。3 DB53/T107320

8、21附錄A（資料性）甘蔗雜交后代SSR真實(shí)性鑒定方法A.1儀器、耗材A.1.1儀器主要儀器包含電子天平、酸度計(jì)、可調(diào)微量移液器、恒溫水浴鍋、高速臺式冷凍離心機(jī)、蛋白/核酸分析儀、PCR擴(kuò)增儀、渦旋混勻器、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像儀、研缽等。A.1.2試劑主要試劑包括十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇、異戊醇、乙二胺四乙酸二鈉、瓊脂糖、- 巰基乙醇（-Mercaptoethanol）、丙烯酰胺、雙甲叉丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、dNTP混合液、Ex-Taq DNA聚合酶、10Ex-B

9、uffer、SSR引物等。A.2真實(shí)性鑒定方法A.2.1參試樣本采集每份親本和雜種后代材料取400mg幼嫩葉片組織，放入2mL離心管中，樣品直接提取DNA或保存于-80冰箱備用。A.2.2CTAB法提取樣本DNACTAB提取樣本DNA方法如下：a)將甘蔗葉片剪成 1 cm左右碎片，放入預(yù)冷的研缽中。加入液氮速冷，研磨成粉末，將凍粉轉(zhuǎn)移至 2 mL離心管中；b)向裝有凍粉的離心管中加入等體積(w/v) 2CTAB提取緩沖液抽提緩沖液，65水浴 20 min，間隔 4 min顛倒混勻。c)將樣品于 12 000 rpm下離心 5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的 2 mL離心管中；d)加入等體積的氯仿-

10、異戊醇，輕緩顛倒離心管，充分混勻，12 000 rpm離心 10 min；e)吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入 2/3倍體積的預(yù)冷異丙醇,輕緩顛倒混勻后置-20冰箱20 min；f)取樣品管，此時(shí)可見有絮狀 DNA沉淀，12 000 rpm離心 10 min，棄上清液。DNA沉淀用 75乙醇漂洗 2次，12 000 rpm離心 1 min后棄上清液，于室溫下干燥 5 min；g)加入 60 L 1TE緩沖液溶解 DNA，可取 2 L DNA溶液用 1%瓊脂糖電泳檢測。提取的 DNA溶液置于-20冰箱保存?zhèn)溆?。A.2.3建立SSR-PCR反應(yīng)體系和電泳檢測按下列方法建立SSR-PCR反應(yīng)體系和電

11、泳檢測：a)利用現(xiàn)代甘蔗商業(yè)品種、中國種、印度種、割手密、大莖野生種等 DNA做為模板，對選擇的70對 SSR引物進(jìn)行多態(tài)性分析，選擇多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的 4對引物，詳見表 A.1。4 DB53/T10732021表A.1SSR真實(shí)性鑒定引物的序列信息序號SSR MarkerSMC334BSSMC336BSmSSCIR74mSSCIR3Forward (5 to 3)Reverse (5 to 3)1234CAATT CTGAC CGTGC AAAGA TATTCT AGTGC CAATC CATCT CAGCGCAAGCCA CACTG AGAATAGC TCCCA CACCAAATGCCG

12、ATG AGCTT GATTG CGAAT GCATGC CAACT TCCAAACAGA CACGCAACGCAAAACAACGGGACT ACTCC ACAAT GATGCb)PCR反應(yīng)體系和條件:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（總體積20 L）中各組分的終濃度和體積參照表A.2進(jìn)行配制，可以依據(jù)試驗(yàn)條件不同做相應(yīng)調(diào)整；表A.2SSR-PCR反應(yīng)體系試劑終濃度體積(L)2.010Ex-Buffer1dNTP（2.5 mmol/L）上游引物（4 mol/L）下游引物（4 mol/L）DNA模板0.25 mmol/L0.2 mol/L0.2 mol/L約 20 ng/L0.05 U/L2.01.01.01

13、.0Ex-Taq酶(5 U/L)ddH2O0.212.8PCR的反應(yīng)程序參照表A.3，其中退火溫度依據(jù)不同引物的Tm值作相應(yīng)調(diào)整，PCR程序結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物于4保存。表A.3SSR-PCR反應(yīng)條件程序終濃度94體積(L)3 min30 s預(yù)變性變性退火延伸9452657230 s擴(kuò)增（35 cycle）40 s終延伸725 minA.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測5 DB53/T10732021按以下方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測：a)制備 8非變性聚丙烯酰胺（PAGE）溶液（見附件 B），緩慢混合均勻后倒入制膠板，插入樣品梳子后靜置 30 min左右；b)向電泳槽中加 1TBE緩沖液，液面超過樣

14、品孔 1 cm左右，拔出樣品梳子，向樣品孔中加入 2L的 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳條件 110V恒定電壓電泳時(shí)間 2 h；c)PCR產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后采用銀染方法進(jìn)行染色。先用 ddH2O漂洗兩次，每次 2 min，用 0 .1硝酸銀溶液染色 10 min，再用 ddH2O漂洗 2 min，然后將膠轉(zhuǎn)移到顯影液中顯色 10 min，直至條帶清晰，最后用 ddH2O漂洗兩次。A.3檢測結(jié)果分析與鑒定A.3.1針對每一對SSR引物，將其擴(kuò)增出來所有條帶根據(jù)分子量的大小依次編號為1、2、3、4。A.3.2然后對每個(gè)泳道依據(jù)條帶編號進(jìn)行標(biāo)志，圖中有清晰條帶的記為1，同一位置無帶的記為0，統(tǒng)計(jì)條帶的結(jié)果建立原始數(shù)據(jù)矩陣。A.3.3利用Excel將數(shù)據(jù)矩陣中1轉(zhuǎn)換為黑色方塊，將0轉(zhuǎn)換為白色方塊，統(tǒng)計(jì)雜交后代的帶型與父母本帶型差異性，結(jié)合4對引物的結(jié)果作為判定甘蔗后代真實(shí)性的重要依據(jù)。A.3.4依SMC334BS引物鑒定熱帶種（母本）與割手密（父本）的雜交后代為例，詳見圖A.1。A.3.5按照表格統(tǒng)計(jì)各參試材料的DNA帶型，其中條帶1、2、3、4和5是母本特有DNA條帶， 8、9、10和11為父本特有條帶，6為