20120919微生態(tài)制劑.溫都水城

1、楊祿良 研究員2012-09-21 飼用乳酸菌穩(wěn)定性和耐受性 新技術(shù)與應(yīng)用三、發(fā)酵前包被技術(shù)介紹二、乳酸菌使用過程中存在的問題一、飼用益生菌制劑的現(xiàn)狀四、前包被腸球菌的應(yīng)用舉例報(bào)告內(nèi)容一飼用益生菌制劑的現(xiàn)狀4益生菌是微生態(tài)制劑的主體微生態(tài)制劑：指在微生態(tài)學(xué)理論的指導(dǎo)下，利用能夠調(diào)整微生態(tài)失調(diào)、保持微生態(tài)平衡、提高宿主健康水平或增進(jìn)健康狀態(tài)的益生菌及其代謝產(chǎn)物和生長促進(jìn)物質(zhì)制成的制劑。微生態(tài)制劑益生菌（probiotics）益生元（prebiotics）合生素（synbiotics）4益生菌又稱益生素，是指飼用后通過改善宿主腸道菌群生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高宿主（人和動物）健康水平和健康佳

2、態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物。 益生菌（素）（probiotics) 可以直接飼喂動物，通過調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡，達(dá)到預(yù)防疾病、促進(jìn)動物生長和提高飼料利用率的活的微生物和（或）其培養(yǎng)物（ Parker 1974）。益生菌的定義 5根據(jù)制劑的用途及作用機(jī)制可分為益生菌生長促進(jìn)劑和益生菌治療劑依據(jù)微生物的種類可分為芽孢桿菌制劑、乳酸菌制劑、酵母菌制劑、光合菌制劑及放線菌制劑微生態(tài)制劑按菌種組成可分為單一制劑和復(fù)合制劑依據(jù)應(yīng)用范圍可將微生態(tài)制劑分為醫(yī)用益生菌制劑 、獸用益生菌制劑及農(nóng)用益生菌制劑益生菌的分類 6益生作用補(bǔ)充有益菌群改善消化道菌群平衡刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育參與菌群生存競爭補(bǔ)充機(jī)體營養(yǎng)成分促

3、進(jìn)動物生長優(yōu)勢種群學(xué)說菌種屏障學(xué)說微生物代謝學(xué)說免疫調(diào)節(jié)學(xué)說益生菌的作用機(jī)理 回腸遠(yuǎn)端/ 盲腸 /結(jié)腸近端 抑制病原菌：大腸桿菌，沙門氏菌,彎曲桿菌, 螺旋體 等抑制假單胞菌、葡萄球菌、變形假絲酵母 等.直接增強(qiáng)抑制微生物菌群中病原菌的能力競爭性抑制大腸桿菌選擇性刺激主要小腸菌群: 乳酸生產(chǎn)菌 產(chǎn)酸、乳酸菌素，維生素、酶等產(chǎn)生乳酸和短鏈脂肪酸益生菌（細(xì)菌、孢子、酵母）促進(jìn)胃腸粘膜再生和健康刺激機(jī)理營養(yǎng)增殖抑殺結(jié)腸遠(yuǎn)端益生菌的作用機(jī)理優(yōu)良益生菌的篩選來源安全性繁殖速度對膽鹽、胃腸液的耐受性抗生素耐受性對致病菌的抑菌活性 產(chǎn)生消化酶在宿主腸道內(nèi)的定殖“普遍認(rèn)為是安全的(GRAS)” 微生物9飼料添

4、加劑品種目錄（2010）微生物地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、羅伊氏乳桿菌、動物雙歧桿菌、黑曲霉、米曲霉、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、纖維二糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌養(yǎng)殖動物產(chǎn)丙酸丙酸桿菌、布氏乳桿菌青貯飼料、牛飼料副干酪乳桿菌青貯飼料凝結(jié)芽孢桿菌肉雞，生長育肥豬側(cè)孢芽孢桿菌肉雞、肉鴨、豬、蝦10中國2010（34種）美國2009（45種）歐盟2008（72種）1017

5、7341145共99種目前可研究：99種（1）菌種：歐盟72種，美國45種，中國34種芽孢桿菌；酵母；乳酸菌雙歧桿菌（2）工藝：?國外多是專業(yè)化的公司，均有幾十年積累的開發(fā)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，菌種經(jīng)過選育，液體純種發(fā)酵和菌體濃縮處理工藝，有效活菌含量比較高，雜菌率低，品質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)格比較貴。國內(nèi)活菌制劑專業(yè)化的公司比較少，15-20年開發(fā)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)幾乎沒有，菌種資源匱乏，發(fā)酵工藝出于初級探索階段，尤其缺少菌體濃縮和包被穩(wěn)定處理，雜菌率高，品質(zhì)不穩(wěn)，質(zhì)量參差不齊，價(jià)格較低。（3）配套應(yīng)用技術(shù)：養(yǎng)殖條件復(fù)雜有效性指標(biāo)行業(yè)情況目前，美國微生物飼料添加劑年使用量約在50,000 噸以上，年銷售額己超過2 億美元；日

6、本每年使用微生態(tài)添加劑己達(dá)5,000 噸以上，價(jià)值超過2,000萬美元。每年全球微生物飼料添加劑總銷售額已超過25 億美元。國內(nèi)從事微生物飼料添加劑開發(fā)應(yīng)用的企業(yè)很多，獲得農(nóng)業(yè)部生產(chǎn)許的約有100 家。國內(nèi)微生物飼料添加劑年銷售額大約在20 億元，銷售額在1億元以上的不足5 家，產(chǎn)品年銷售額在3,000 萬元以上不過幾十家，大多數(shù)企業(yè)的年銷售額在1,000 萬元以下。增強(qiáng)免疫力減輕糞便氨臭促進(jìn)動物生長提高飼料利用率降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益改善飼養(yǎng)環(huán)境，有利動物身體健康減少抗生素殘留，提高養(yǎng)殖產(chǎn)品的安全性改善動物健康狀況，降低發(fā)病率益生菌制劑的效果益生菌對動物應(yīng)用效果統(tǒng)計(jì)表應(yīng)用效果不穩(wěn)定二乳酸菌使

7、用中存在的問題基礎(chǔ)研究方面：動物腸道微生態(tài)理論的認(rèn)知EM系列；XP；發(fā)酵床宿主特異性生態(tài)平衡的緩沖能力專利生產(chǎn)菌株的保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)；發(fā)酵劑；營養(yǎng)缺陷型18產(chǎn)業(yè)發(fā)展方面生產(chǎn)菌株資源匱乏：特性降低；拷貝生產(chǎn)成本高產(chǎn)品功效不穩(wěn)定配套應(yīng)用技術(shù)不規(guī)范：養(yǎng)殖模式；配伍產(chǎn)品功能細(xì)分標(biāo)準(zhǔn)檢測方法：標(biāo)準(zhǔn)（少）19益生菌制劑應(yīng)用存在的主要問題應(yīng)用效果不穩(wěn)定胃酸、膽鹽飼料中的微量元素(銅、鋅等)飼料加工制粒過程中的高溫、高壓運(yùn)輸、貯存過程中的不良環(huán)境菌種的來源和遺傳穩(wěn)定性阻礙了益生菌制劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展采用保護(hù)措施，如改變生產(chǎn)工藝，溫和生產(chǎn)條件篩選耐高溫、抗酸抗膽鹽菌株解決措施微膠囊包被技術(shù)被認(rèn)為是解決這一問題的關(guān)鍵技術(shù)微

8、膠囊包被技術(shù)三發(fā)酵前包被技術(shù)介紹益生菌制劑未包被（第一代）后包被（第二代）：包埋率低、活菌含量低、成本高前包被（第三代）：穩(wěn)定性強(qiáng)、包埋率高、活菌含量高，易于工業(yè)化發(fā)酵前包被技術(shù)為解決益生菌制劑的穩(wěn)定性問題提供了一條適用的、低成本的工業(yè)化途徑微膠囊是利用天然或合成的高分子材料對固體、液體或氣體進(jìn)行包封，粒徑為5-1000m的中空膠囊，制備微膠囊的過程稱為微膠囊化。2022/7/624芯材Core material壁材 Wall material微囊化細(xì)胞的組成常用壁材：天然材料、半合成材料高分子材料微膠囊的功能 改變產(chǎn)品的形態(tài)使其具有良好的流動性和分散性 采用腸溶性壁材，實(shí)現(xiàn)腸道定點(diǎn)釋放 保護(hù)

9、活菌，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和有效性 25 微囊化效率高 產(chǎn)品穩(wěn)定性強(qiáng) 設(shè)備成本低、通用性強(qiáng)、兼容性好 有效活菌含量高發(fā)酵前包被技術(shù)的優(yōu)勢：26制備微膠囊1h、8h、10h時(shí)鏡檢照片 1 h8 h10 h 有效活菌含量高在相同的培養(yǎng)條件下，消耗相同的發(fā)酵原料，發(fā)酵前包被最終產(chǎn)品中單位活菌數(shù)是后包被的10-100倍不等發(fā)酵前包被微生物可通過后期培養(yǎng)在微膠囊微環(huán)境下大量增殖微膠囊產(chǎn)品活菌含量高（可達(dá)1011 CFU/g）發(fā)酵后包被（噴霧干燥法和流化床包被）包被過程中菌體分散不均勻及死亡率高微膠囊產(chǎn)品活菌含量低（通常為1091010 CFU/g） 有效活菌含量高109CFU/mL1010CFU/mL微囊化

10、前包被糞腸球菌代謝曲線對比包被前后乳酸代謝曲線比較包被前后葡萄糖代謝曲線比較 微囊化前包被糞腸球菌生長曲線對比 微囊化效率高 產(chǎn)品穩(wěn)定性強(qiáng) 設(shè)備成本低、通用性強(qiáng)、兼容性好 有效活菌含量高發(fā)酵前包被技術(shù)的優(yōu)勢：31微膠囊表面活菌數(shù)(CFU/ml）產(chǎn)品中活菌數(shù)(CFU/ml）微囊化效率平均值8.731058.6310899.90%99.82%3.831061.2510999.69%1.291069.6310899.87%發(fā)酵前包被工藝的微囊化效率注：微囊化效率= 【1 （微膠囊表面活菌數(shù)/產(chǎn)品中活菌數(shù)）】100% 微囊化效率高 微囊化效率高 產(chǎn)品穩(wěn)定性強(qiáng) 設(shè)備成本低、通用性強(qiáng)、兼容性好 有效活菌含

11、量高發(fā)酵前包被技術(shù)的優(yōu)勢：3380高溫處理10min，微膠囊包被產(chǎn)品的活菌數(shù)是未包被產(chǎn)品的100倍左右。微囊化腸球菌對高溫的耐受性強(qiáng)2.01-lgCFU/g0.27-lgCFU/g微囊化腸球菌對80高溫的耐受性微囊化腸球菌對膽鹽的耐受性強(qiáng)微囊化腸球菌對膽鹽（ 0.4% ）的耐受性微囊化腸球菌體外模擬胃（左）腸（右）液試驗(yàn)微囊化腸球菌對模擬胃液的耐受性強(qiáng)1.53-lgCFU/g在模擬胃液中處理4h，微膠囊包被產(chǎn)品的活菌數(shù)是未包被產(chǎn)品的50倍左右。微囊化腸球菌對高銅、高鋅的耐受性在高銅和高鋅的條件下培養(yǎng)10h，包被培養(yǎng)的活菌數(shù)比游離培養(yǎng)高兩個(gè)多數(shù)量級blank0.1%CuSO40.3%ZnO0.1

12、%CuSO4 and 0.3%ZnOFree cellsMicroencapsulated cells 微囊化效率高 產(chǎn)品穩(wěn)定性強(qiáng) 設(shè)備成本低、通用性強(qiáng)、兼容性好 有效活菌含量高發(fā)酵前包被技術(shù)的優(yōu)勢：解決了乳酸菌類飼料添加劑長期以來有效活菌含量低、抗逆性能差、成本高的“技術(shù)瓶頸”實(shí)現(xiàn)生物微膠囊制備和發(fā)酵一體化38干燥前（粒徑1-2mm） 干燥后（粒徑0.3-0.5mm）（新型前包被糞腸球菌）39蒸汽系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)空氣系統(tǒng)水軟化加熱變蒸汽分汽包分流原料等消毒空氣粗濾壓濾降溫除水儲氣罐精過濾斜面培養(yǎng)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)一級種子二級種子發(fā)酵前包被發(fā)酵離心產(chǎn)品低溫干燥微囊化菌體工藝流程高度嚴(yán)格和專業(yè)化的生產(chǎn)過程

13、產(chǎn)品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對照組：添加不包被糞腸球菌制劑100g/t試驗(yàn)組：添加微囊化前包被糞腸球菌制劑100g/t四種制粒條件-A：壓力0.1Mpa，溫度65； B：壓力0.2Mpa，溫度70； C：壓力0.3Mpa，溫度80； D：壓力0.4Mpa，溫度85。組別粉料中的活菌數(shù)(106cfu/g) 制粒后活菌數(shù)(106cfu/g)存活率(%)顆粒料儲存1個(gè)月(%)顆粒料儲存3個(gè)月(%)顆粒料儲存6個(gè)月(%)對照組A-11.220.3931.97 22.13 9.84 -B-11.110.2219.82 8.11 -C-11.020.8482.35 0.98 -D-11.210.0060.50 -試驗(yàn)

14、組A-21.261.1994.44 93.65 92.06 88.10 B-21.171.1295.73 92.31 90.60 87.18 C-20.980.8889.80 88.78 86.73 85.71 D-21.120.9886.50 86.39 84.61 80.87 四前包被腸球菌的應(yīng)用舉例肉雞飼喂-試驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）飼養(yǎng)數(shù)量：AA公肉雞180只飼養(yǎng)時(shí)間：共計(jì)42d 分組設(shè)計(jì)：將180只肉仔雞隨機(jī)分成3組，每組6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10只?？瞻讓φ战M： （飼喂不加抗生素的基礎(chǔ)日糧）發(fā)酵液添加組： （飼喂不加抗生素的基礎(chǔ)日糧+1109CFU腸球菌發(fā)酵液/kg飼料）微囊化前包被添加組：（飼喂不

15、加抗生素的基礎(chǔ)日糧+1109CFU腸球菌微膠囊/kg飼料）ASAGF1.0007表1 對肉仔雞生長性能的影響Table 1 Effects of microcapsulated ASAGF10-1 on growth performance of broilers結(jié)論：飼養(yǎng)全期（1-42 d），與空白對照組和發(fā)酵液添加組相比，微膠囊添加組肉仔雞平均日增重分別提高了16.94%（P0.05）和11.25%（P0.05）；料重比分別降低了16.13%(P0.05）。表2 對42日齡肉仔雞胸腺、脾臟、法氏囊相對重量的影響 Table2 Effects of microcapsulated ASAGF

16、10-1 on the relative weight of thymus, spleen and bursa of 42-day-old broilers結(jié)論：42日齡時(shí)微膠囊添加組與空白對照組和發(fā)酵液組相比較，肉仔雞的胸腺相對重量分別提高了46.56%（P0.05）和18.38%（P0.05），法氏囊相對重量分別提高了16.67%（P0.05）。表3 42日齡AA肉雞糞便中菌群數(shù)量結(jié)果Table3 quantitative data of bacterium in fecal samples結(jié)論：比較空白對照組和發(fā)酵液添加組，微囊添加組肉雞糞便中雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量顯著提高（P0.05）

17、。42日齡肉雞盲腸內(nèi)容物DGGE電泳圖對照組未包被腸球菌包被腸球菌乳酸菌條帶大腸桿菌條帶肉雞飼喂-試驗(yàn)設(shè)計(jì)（2）飼養(yǎng)數(shù)量：AA公肉雞180只飼養(yǎng)時(shí)間：共計(jì)42d 分組設(shè)計(jì)：將180只肉仔雞隨機(jī)分成6組，每組6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5只。對照組：（飼喂不加抗生素的基礎(chǔ)日糧+空微膠囊壁材按A組百分比添加）A組(高劑量)： （飼喂不加抗生素的基礎(chǔ)日糧+11010CFU腸球菌微膠囊/kg飼料）B組(中劑量)： （飼喂不加抗生素的基礎(chǔ)日糧+1 109CFU腸球菌微膠囊/kg飼料）C組(低劑量)： （飼喂不加抗生素的基礎(chǔ)日糧+2108CFU腸球菌微膠囊 /kg飼料）D組(抗生素)： （飼喂加抗生素的基礎(chǔ)日糧）E組

18、(國外產(chǎn)品)：（飼喂不加抗生素的基礎(chǔ)日糧+某進(jìn)口多層包被糞腸球菌 1-21d，0.75g/kg；22-42d，0.5g/kg飼料）對肉仔雞生長性能的影響結(jié)論（飼養(yǎng)全期142d）日增重與空白對照組比較，高劑量組和中劑量組日增重分別提高9.90%(P0.05)和9.50%(P0.05),且兩組日增重均顯著高于國外產(chǎn)品對照組(P0.05)。料重比與空白對照組比較，高劑量組和中劑量組料重比分別降低10.04%(P0.05)和9.62%(P0.05)。與抗生素組比較，高劑量組和中劑量組料肉比無顯著性差異。與國外產(chǎn)品對照組比較，高劑量組和中劑量組料肉比分別降低4.4%(P0.05)和4%(P0.05)。十

19、二指腸Duodenum 空腸Jejunum 回腸Ileum 十二指腸Duodenum 空腸Jejunum 回腸Ileum 21d42d對肉仔雞小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響左圖：空白對照； 右圖：中劑量組結(jié)論：對照組絨毛大多較短較粗，排列不規(guī)則，有缺損且脫落嚴(yán)重，單位面積上腸絨毛數(shù)量少。微囊化腸球菌組腸絨毛明顯變長，比例協(xié)調(diào)，排列整齊，高低均勻，單位面積上腸絨毛數(shù)量多。血液抗氧化指標(biāo)丙二醛含量總抗氧化能力（T-AOC）總超氧化物歧化酶（T-SOD）結(jié)論：相對對照組、抗生素組及國外產(chǎn)品對照組，微囊化腸球菌添加組（高劑量、中劑量、低劑量）表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化能力。肉雞攻毒-試驗(yàn)設(shè)計(jì)飼養(yǎng)數(shù)量：AA公肉雞90只

20、飼養(yǎng)時(shí)間：共計(jì)42d 分組設(shè)計(jì)：將90只肉仔雞隨機(jī)分成3組，每組6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5只。對照組： （基礎(chǔ)日糧）發(fā)酵液添加組： （基礎(chǔ)日糧+30g速大肥/t飼料）微囊化前包被添加組：（基礎(chǔ)日糧+1109CFU腸球菌微膠囊/kg飼料）糞腸球菌對肉仔雞21 d生長性能的影響糞腸球菌對肉仔雞攻毒后7 d生長性能的影響組別死亡率（%）對照1組對照2組40.008.94b26.676.67b試驗(yàn)組 3.333.33aP值0.005 糞腸球菌對肉仔雞攻毒7 d后死亡率的影響斷奶仔豬飼喂-試驗(yàn)設(shè)計(jì)飼養(yǎng)數(shù)量：斷奶仔豬204頭飼養(yǎng)時(shí)間：共計(jì)35d 試驗(yàn)地點(diǎn)：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場分組設(shè)計(jì)：處 理試驗(yàn)豬（頭）試驗(yàn)日糧空

21、白對照組317基礎(chǔ)日糧低劑量組317基礎(chǔ)日糧+5108CFU腸球菌微膠囊/kg飼料中劑量組317基礎(chǔ)日糧+1109CFU腸球菌微膠囊/kg飼料高劑量組317基礎(chǔ)日糧+5109CFU腸球菌微膠囊/kg飼料處 理腹瀉率，腹瀉指數(shù)，死淘率，空白對照組4.07a2.109a5.88低劑量組2.63b0.938b0中劑量組2.48b0.863b1.96高劑量組2.27b0.725b0SEM0.0010.0320.003 P0.0600.0060.152 表1 對仔豬腹瀉率的影響結(jié)論：與對照組相比，添加微囊化腸球菌組均可顯著降低仔豬的腹瀉率（P 0.05），降低腹瀉率分別為35.38、39.1、44.3。

22、處 理十二指腸空腸回腸空白組1.741.73c1.53低劑量組1.771.81bc1.82中劑量組1.882.13a1.82高劑量組1.842.07ab1.86SEM0.0250.0150.022P0.9520.0310.388表2 對斷奶仔豬各腸段絨腺比的影響結(jié)論：與對照組相比，中劑量組和高劑量組均顯著提高了仔豬空腸絨腺比（P 0.05）（分別提高22.6和19.4）。處 理非厭氧菌大腸桿菌乳酸菌空白組4.79b6.43a5.91低劑量組6.31a6.46a6.15中劑量組5.84ab5.67ab6.01高劑量組5.70ab4.65bc6.75SEM0.080.070.11p0.8690.1

23、960.023表3 對仔豬空腸微生物的影響， lg CFU / g結(jié)論：低劑量組可以顯著增加仔豬空腸非厭氧菌數(shù)量（P 0.05）。與對照組相比，高劑量組和抗生素組均顯著降低了仔豬空腸中大腸桿菌數(shù)量（P 0.05）。與對照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組有逐步增加回腸中乳酸菌數(shù)量的趨勢（4.1、1.6和14.2）處 理非厭氧菌大腸桿菌乳酸菌空白組6.397.21a6.01b低劑量組6.816.23ab6.81ab中劑量組6.636.51ab7.29a高劑量組6.674.89b7.37aSEM0.060.110.05p0.8690.1960.023表4 對仔豬回腸微生物的影響， lg CFU / g結(jié)論：低劑量組、中劑量組和高劑量組均有增加非厭氧菌總數(shù)的趨勢（6.70、3.79和4.52）。與對照組相比，高劑量組可顯著降低仔豬回腸中大腸桿菌數(shù)量32.2（P 0.05），低劑量組和中劑量組在數(shù)值上有降低仔豬回腸大腸桿菌數(shù)量的趨勢?？股亟M、中劑量組和高劑量組均顯著增加了仔豬回腸乳酸菌