熒光光譜的原理及應(yīng)用

1、熒光光譜的原理及應(yīng)用熒光光譜的原理及應(yīng)用2熒光熒光是指一種是指一種光致發(fā)光光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線）照射，吸收光能后（通常是紫外線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光（通常比入射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）；而且一旦停止波長在可見光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。光。 3磷光磷光是一種緩慢發(fā)光的光致冷

2、發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種是一種緩慢發(fā)光的光致冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線）照常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)（具有和基態(tài)不同的自射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)（具有和基態(tài)不同的自旋多重度），然后緩慢地退激發(fā)并發(fā)出比入射光的旋多重度），然后緩慢地退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光，而且與熒光過程不同，當(dāng)入射的波長長的出射光，而且與熒光過程不同，當(dāng)入射光停止后，發(fā)光現(xiàn)象持續(xù)存在。發(fā)出磷光的退激發(fā)光停止后，發(fā)光現(xiàn)象持續(xù)存在。發(fā)出磷光的退激發(fā)過程是被量子力學(xué)的躍遷選擇規(guī)則禁戒的，因此這過程是被量子力學(xué)的躍遷選擇規(guī)則禁戒的，因此這個過程很緩慢。個過

3、程很緩慢。456主要內(nèi)容主要內(nèi)容熒光光譜的基本原理熒光光譜的基本原理1熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理2熒光光譜的應(yīng)用熒光光譜的應(yīng)用3參考資料參考資料47熒光光譜的基本原理熒光光譜的基本原理8分子能級比原子能級復(fù)雜；分子能級比原子能級復(fù)雜； 在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級；在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級； 一、分子能級與躍遷一、分子能級與躍遷激發(fā)激發(fā)： 基態(tài)基態(tài)( (S S0 0)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)( (S S1 1、S S2 2激發(fā)態(tài)振動能級激發(fā)態(tài)振動能級) )：吸收：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；失

4、活失活： 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài) 基態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式：多種途徑和方式( (見能級圖見能級圖) )；速；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢； 第一、第二、第一、第二、電子激發(fā)電子激發(fā)單重態(tài)單重態(tài) S S1 1 、S S2 2 ； 第一、第二、第一、第二、電子激發(fā)電子激發(fā)三重態(tài)三重態(tài) T T1 1 、T T2 2 ；9 電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度： M = 2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或或1)； 電子激發(fā)態(tài)的多重度電子激發(fā)態(tài)的多重度單重態(tài)：單重態(tài)： 一個分子中所有電子自旋都配對的電子狀態(tài)。一個分子中所有電子自旋都配對的

5、電子狀態(tài)。三重態(tài)：三重態(tài)： 有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。有兩個電子的自旋不配對而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。較激發(fā)單重態(tài)低。1011躍遷規(guī)則躍遷規(guī)則 躍遷前后躍遷前后原子核的構(gòu)型原子核的構(gòu)型沒有發(fā)生改變、躍遷過程中沒有發(fā)生改變、躍遷過程中電子自旋電子自旋沒有改變、躍遷前后沒有改變、躍遷前后電子的軌道電子的軌道在空間有較大的在空間有較大的重疊重疊和和軌道的對軌道的對映性映性發(fā)生了改變的躍遷是允許的；（發(fā)生了改變的躍遷是允許的；（S S0 0 S1允許躍遷）允許躍遷） 躍遷過程中躍遷過程中電子自旋電子自旋發(fā)生了改變、躍遷前后發(fā)生了改變、躍遷前后電子的軌道電子的軌

6、道在空在空間不間不重疊重疊或或軌道的對映性軌道的對映性未發(fā)生改變的躍遷是禁阻的。未發(fā)生改變的躍遷是禁阻的。（S S0 0 T T1 1禁阻躍遷）禁阻躍遷）Franck-Condon原理原理： 在電子躍遷完成的瞬間，分子中在電子躍遷完成的瞬間，分子中原子核的構(gòu)型原子核的構(gòu)型是來不及改是來不及改變的。變的。12v 單重態(tài)能級間的躍遷符合光譜選律，躍遷概率大。分單重態(tài)能級間的躍遷符合光譜選律，躍遷概率大。分子通過吸收輻射而直接被激發(fā)到三重態(tài)的躍遷是子通過吸收輻射而直接被激發(fā)到三重態(tài)的躍遷是禁阻禁阻的，的，概率很小。概率很小。13雅布隆斯基分子能級圖雅布隆斯基分子能級圖S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒

7、光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫S 214 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，容易返回基態(tài)，在這個過程中通過電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，容易返回基態(tài)，在這個過程中通過輻射躍遷輻射躍遷( (發(fā)光發(fā)光) )和和無輻射躍遷無輻射躍遷等方式失去能量，這個過程就稱為等方式失去能量，這個過程就稱為失活失活。失活途徑失活途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間竄越振動弛豫無輻射躍遷 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的的途徑，發(fā)生的幾率大幾率大。失活的途徑失活的途徑15 振動弛豫振動弛豫：同一：同一電子能

8、級內(nèi)以熱量交換形式由高振動電子能級內(nèi)以熱量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間一般為一般為10-12 s。 激發(fā)態(tài)分子常常首先發(fā)生振動馳豫。激發(fā)態(tài)分子常常首先發(fā)生振動馳豫。 無輻射躍遷失活的途徑無輻射躍遷失活的途徑通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：多重度相同的電子能級中等能級間的無輻射：多重度相同的電子能級中等能級間的無輻射能級躍遷。能級躍遷。 16無輻射躍遷失活的途徑無輻射躍遷失活的途徑系

9、間竄越系間竄越：不同多重態(tài)，有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。：不同多重態(tài)，有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進(jìn)行軌道耦合進(jìn)行。含含有重原子的分子中（如有重原子的分子中（如I、Br等），系間竄躍最常見。等），系間竄躍最常見。 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；移能量的非輻射躍遷； 外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅猝滅”。17熒光發(fā)射熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)

10、（基態(tài)（ 多為多為 S S1 1 S S0 0躍遷），發(fā)射波長為躍遷），發(fā)射波長為 l l2 2的熒光；的熒光； 1010-7-71010-9-9 s s 。 輻射躍遷失活的途徑輻射躍遷失活的途徑磷光發(fā)射磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（基態(tài)（ 多為多為 T T1 1 S S0 0躍遷）；發(fā)射波長為躍遷）；發(fā)射波長為 l l3 3 的磷光；的磷光； 1010-4-4100 s 100 s 。 電子由電子由 S S0 0 進(jìn)入進(jìn)入 T T1 1 的可能過程：（的可能過程：（ S S0 0 T T1 1禁阻躍遷）禁阻躍遷） S S0 0 激發(fā)激發(fā)

11、振動弛豫振動弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換系間竄越系間竄越振動弛豫振動弛豫T T1 1 發(fā)光速度很慢，光照停止后，可持續(xù)一段時間發(fā)光速度很慢，光照停止后，可持續(xù)一段時間。 磷光僅在很低的溫度或黏性介質(zhì)中才能觀測到，因此磷光很少應(yīng)用于分析磷光僅在很低的溫度或黏性介質(zhì)中才能觀測到，因此磷光很少應(yīng)用于分析 由圖可見，由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長； l l2 2 l l 2 2 l l 1 1 ； 18 熒光產(chǎn)生的過程：熒光產(chǎn)生的過程：（1 1）處于基態(tài)最低振動能級的熒光物質(zhì)分子受到紫外線的照）處于基態(tài)最低振動能級的熒光物質(zhì)分子受到紫外線的照射，吸收了和

12、它所具有的特征頻率相一致的光線，躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振射，吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線，躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級；動能級；（2 2）被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級的分子通過）被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級的分子通過無輻射躍遷降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級；無輻射躍遷降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級；（3 3）降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的分子繼續(xù)降）降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的分子繼續(xù)降落到基態(tài)的各個不同振動能級，同時發(fā)射出相應(yīng)的光量子，這就是熒光：落到基態(tài)的各個不同振動能級，同時發(fā)射出相應(yīng)的光量子，這就是熒光：（4 4）到達(dá)基態(tài)的各個

13、不同振動能級的分子再通過無輻射躍遷最后回到基態(tài)的最低振）到達(dá)基態(tài)的各個不同振動能級的分子再通過無輻射躍遷最后回到基態(tài)的最低振動能級動能級19熒光光譜熒光光譜 固定激發(fā)光波長物質(zhì)發(fā)射的熒光強度與發(fā)固定激發(fā)光波長物質(zhì)發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線，如右圖中曲線射光波長關(guān)系曲線，如右圖中曲線II。 熒光本身則是由電子在兩能級間不發(fā)生自熒光本身則是由電子在兩能級間不發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。磷光光譜磷光光譜 固定激發(fā)光波長物質(zhì)發(fā)射的磷光強度與固定激發(fā)光波長物質(zhì)發(fā)射的磷光強度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線，如右圖中曲線發(fā)射光波長關(guān)系曲線，如右圖中曲線III。 磷

14、光本身則是由電子在兩能級間發(fā)生自旋磷光本身則是由電子在兩能級間發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。熒光光譜與磷光光譜熒光光譜與磷光光譜20200260320380440500560620熒熒光光激激發(fā)發(fā)光光譜譜熒熒光光發(fā)發(fā)射射光光譜譜磷磷光光光光譜譜室室溫溫下下菲菲的的乙乙醇醇溶溶液液熒熒（磷磷）光光光光譜譜光譜圖光譜圖21激發(fā)光譜激發(fā)光譜 固定發(fā)射波長固定發(fā)射波長(一般將其固定于發(fā)射波段中感興趣的峰位一般將其固定于發(fā)射波段中感興趣的峰位)，掃描，掃描出的化合物的出的化合物的發(fā)射光強度發(fā)射光強度(熒光熒光/磷光磷光) 與與入射光波長入射光波長的關(guān)系曲線。的關(guān)

15、系曲線。 二、主要光譜參量二、主要光譜參量發(fā)射光譜發(fā)射光譜 固定激發(fā)波長固定激發(fā)波長(一般將其固定于激發(fā)波段中感興趣的峰位一般將其固定于激發(fā)波段中感興趣的峰位)，掃描，掃描出的化合物的出的化合物的發(fā)射光強度發(fā)射光強度(熒光熒光/磷光磷光) 與與入射光波長入射光波長的關(guān)系曲線。的關(guān)系曲線。吸收光譜吸收光譜 化合物的化合物的吸收光強度吸收光強度與與入射光波長入射光波長的關(guān)系曲線的關(guān)系曲線 。 22主要光譜參量主要光譜參量 吸收光譜吸收光譜反映出的是物質(zhì)的基態(tài)能級與激發(fā)態(tài)能級之間所有的允許躍遷。反映出的是物質(zhì)的基態(tài)能級與激發(fā)態(tài)能級之間所有的允許躍遷。 通常狀態(tài)下的物質(zhì)的通常狀態(tài)下的物質(zhì)的表觀顏色表觀

16、顏色大部分時候取決于其大部分時候取決于其吸收特性吸收特性。 激發(fā)光譜激發(fā)光譜則反映的是基態(tài)與所有與該熒光發(fā)射有關(guān)的能級之間的躍遷。其則反映的是基態(tài)與所有與該熒光發(fā)射有關(guān)的能級之間的躍遷。其所呈現(xiàn)的關(guān)系比吸收光譜要有選擇性，但有時候又不如吸收光譜來的直接。所呈現(xiàn)的關(guān)系比吸收光譜要有選擇性，但有時候又不如吸收光譜來的直接。23激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。熒光的波長總是大熒光的波長總是大于激發(fā)光的波長。于激發(fā)光的波長。這是由于發(fā)射熒光之前的振動馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)這是由于發(fā)射熒光

17、之前的振動馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換過程損失了一定的能量。換過程損失了一定的能量。 b. .發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量( (如能級如能級圖圖l l 2 ,l l 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如如l l 2 )。 c. . 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成

18、鏡像對稱關(guān)系。樣）成鏡像對稱關(guān)系。 24產(chǎn)生斯托克位移的主要原因：產(chǎn)生斯托克位移的主要原因：1.1.躍遷到激發(fā)態(tài)高振動能級的激發(fā)態(tài)分子，首先以更快的速躍遷到激發(fā)態(tài)高振動能級的激發(fā)態(tài)分子，首先以更快的速率發(fā)生振動弛豫（其速率在率發(fā)生振動弛豫（其速率在10101313/s/s數(shù)量級），散失部分能量，數(shù)量級），散失部分能量，達(dá)到零振動能級，一般從零振動能級發(fā)射熒光；達(dá)到零振動能級，一般從零振動能級發(fā)射熒光；2.2.激發(fā)態(tài)形成后，其分子的構(gòu)型將很快進(jìn)一步調(diào)整，以達(dá)到激發(fā)態(tài)形成后，其分子的構(gòu)型將很快進(jìn)一步調(diào)整，以達(dá)到激發(fā)態(tài)的穩(wěn)定構(gòu)型，這又損失了部分能量；激發(fā)態(tài)的穩(wěn)定構(gòu)型，這又損失了部分能量；3.3.發(fā)射

19、熒光的激發(fā)態(tài)多為（發(fā)射熒光的激發(fā)態(tài)多為（，*）態(tài)，這種激發(fā)態(tài)較基態(tài)）態(tài)，這種激發(fā)態(tài)較基態(tài)時有更大的極性，因此將在更大程度上為極性溶劑所穩(wěn)定，使時有更大的極性，因此將在更大程度上為極性溶劑所穩(wěn)定，使激發(fā)態(tài)的能量進(jìn)一步降低。激發(fā)態(tài)的能量進(jìn)一步降低。斯托克位移斯托克位移25v 關(guān)于激發(fā)光的波長關(guān)于激發(fā)光的波長1 1：決定熒光物質(zhì)是否能夠產(chǎn)生吸收并發(fā)射出熒光；決定熒光物質(zhì)是否能夠產(chǎn)生吸收并發(fā)射出熒光；能夠使熒光物質(zhì)產(chǎn)生吸收并發(fā)射出熒光的激發(fā)光的波長并不具能夠使熒光物質(zhì)產(chǎn)生吸收并發(fā)射出熒光的激發(fā)光的波長并不具有唯一性；有唯一性；在保證激發(fā)的前提下，不同激發(fā)波長處的熒光發(fā)射光譜相同，在保證激發(fā)的前提下，不

20、同激發(fā)波長處的熒光發(fā)射光譜相同，但熒光強度不同。但熒光強度不同。在進(jìn)行熒光測定時，須選擇激發(fā)光波長以保證熒光強度最大。在進(jìn)行熒光測定時，須選擇激發(fā)光波長以保證熒光強度最大。26 熒光發(fā)射是光吸收的逆過程。熒光發(fā)射光譜與吸收光譜有類似鏡熒光發(fā)射是光吸收的逆過程。熒光發(fā)射光譜與吸收光譜有類似鏡影的關(guān)系。但當(dāng)激發(fā)態(tài)的構(gòu)型與基態(tài)的構(gòu)型相差很大時，熒光發(fā)射光影的關(guān)系。但當(dāng)激發(fā)態(tài)的構(gòu)型與基態(tài)的構(gòu)型相差很大時，熒光發(fā)射光譜將明顯不同于該化合物的吸收光譜。譜將明顯不同于該化合物的吸收光譜。鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則27鏡像規(guī)則的解釋鏡像規(guī)則的解釋 基態(tài)上的各振動能級分布基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級與

21、第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；分布類似； 基態(tài)上的零振基態(tài)上的零振動能級與第一激動能級與第一激發(fā)態(tài)的零振動能發(fā)態(tài)的零振動能級之間的躍遷幾級之間的躍遷幾率最大，相反躍率最大，相反躍遷也然。遷也然。 28三、三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1.1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 291.1.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：）躍遷類型： * 的熒光效率高，系間跨越過程的速的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；率常數(shù)小

22、，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。用，故具有很強的熒光。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增上有供電基，使熒光增強。強。30化合物化合物 相對熒光強度相對熒光強度 熒光波長熒光波長/nm/nm C6H6（苯）（苯）10 10 270310 C6H5COOH C6H5NO230310390 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H

23、5CN1718202020270320285365285345310405280360 C6H5Cl C6H5BrC6H5I75027534529038031v 物質(zhì)分子發(fā)射熒光的能力用熒光量子產(chǎn)率（物質(zhì)分子發(fā)射熒光的能力用熒光量子產(chǎn)率（）表示：）表示：v 與失活過程的速率常數(shù)與失活過程的速率常數(shù)k k有關(guān)：有關(guān)： 凡是使熒光速率常數(shù)凡是使熒光速率常數(shù)k kf f增大而使其他失活過程（系間竄越、外轉(zhuǎn)增大而使其他失活過程（系間竄越、外轉(zhuǎn)換、內(nèi)轉(zhuǎn)換）的速率常數(shù)減小的因素（環(huán)境因素和結(jié)構(gòu)因素）都可使換、內(nèi)轉(zhuǎn)換）的速率常數(shù)減小的因素（環(huán)境因素和結(jié)構(gòu)因素）都可使熒光增強。熒光增強。吸收的光子數(shù)發(fā)射的光子

24、數(shù)激發(fā)態(tài)的分子數(shù)發(fā)射熒光的分子數(shù)=iceciffkkkkk2 2 熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率32四、影響熒光強度的外部因素 1.溶劑的影響溶劑的影響 溶劑極性增加，有時會使熒光強度增加，熒光波長紅移。溶劑極性增加，有時會使熒光強度增加，熒光波長紅移。 若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或使熒光物質(zhì)電離狀態(tài)改變，會使熒光若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或使熒光物質(zhì)電離狀態(tài)改變，會使熒光強度、熒光波長改變。強度、熒光波長改變。 含重原子的溶劑（碘乙烷、四溴化碳）使熒光減弱，磷光增強。含重原子的溶劑（碘乙烷、四溴化碳）使熒光減弱，磷光增強。 溶劑溶劑粘度粘度減小時，可以增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而減小時，可以

25、增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光減弱。故熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對溶劑的。由于溫度對溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光溫度上升，熒光強度下降。強度下降。332.溫度的影響溫度的影響 熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，分子運動速度加熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，分子運動速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在

26、0以下，溫度每降以下，溫度每降低低10， f增加增加3，在，在 80時，時， f為為1。343 pH值的影響 含有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與pH有關(guān)。pH的變化影響了熒光基團的電荷狀態(tài)，從而使其熒光發(fā)生變化?；衔锘衔?相對熒光強度相對熒光強度 C6H5OH 18 C6H5O 0C6H5NH2 20C6H5NH3 +0354.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象 自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收 光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。 內(nèi)濾光作用內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光

27、物質(zhì)發(fā)：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā) 射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；365.熒光熄滅劑 熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑熒光熄滅劑(quenching medium)。如如鹵素離子鹵素離子、重金屬離子重金屬離子、氧分子氧分子以及以及硝基化合物硝基化合物、重氮化合物重氮化合物、羰基羰基和和羧基化合羧基化合物物均為常見的熒光熄滅劑。均為常見的熒光熄滅劑。376、散射光、散射光 小部分光子

28、和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運動方向發(fā)生小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射。改變而向不同角度散射。瑞利光：瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運動方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。是光子運動方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。 散射

29、光對熒光測定有干擾，散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光長的拉曼光，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須采取，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須采取措施消除。措施消除。拉曼光的干擾主要來自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與拉曼光的干擾主要來自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波長長38a:320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm。 b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測定熒光，激發(fā)光波長為320nm時，拉曼光波長是360nm，360nm的

30、拉曼光對熒光無影響；當(dāng)激發(fā)光波長為350nm時，拉曼光波長是400nm，400nm的拉曼光對熒光有干擾，因而影響測定結(jié)果。 硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜 39熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理40熒光光譜儀的基本原理熒光光譜儀的基本原理特殊點：有兩個單色器，特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直光源與檢測器通常成直角。角。41 光源：光源： 高壓氙燈發(fā)出的光線強度大，而且是連續(xù)光譜，通用性較好，但高壓氙燈發(fā)出的光線強度大，而且是連續(xù)光譜，通用性較好，但氙弧燈熱效應(yīng)大，穩(wěn)定性較差，對電壓穩(wěn)定性要求較高。氙弧燈熱

31、效應(yīng)大，穩(wěn)定性較差，對電壓穩(wěn)定性要求較高。 高功率連續(xù)可調(diào)激光光源是一種新型熒光激發(fā)光源。激光的單色高功率連續(xù)可調(diào)激光光源是一種新型熒光激發(fā)光源。激光的單色性好、強度大。激光光源近年來應(yīng)用日益普遍。性好、強度大。激光光源近年來應(yīng)用日益普遍。 42v單色器：單色器： 第一單色器第一單色器選擇激發(fā)光波長選擇激發(fā)光波長1 （250nm的紫外光），的紫外光），稱為激發(fā)單色器。稱為激發(fā)單色器。 第二單色器第二單色器選擇選擇(測量測量)發(fā)射光（熒光）波長發(fā)射光（熒光）波長2 ，與激發(fā)光與激發(fā)光入射方向垂直，稱為熒光單色器。入射方向垂直，稱為熒光單色器。v樣品池：樣品池： 采用低熒光材料，通常為四面透光的石

32、英池。v檢測器：檢測器： 光電倍增管。光電倍增管。43液體液體樣品準(zhǔn)備樣品準(zhǔn)備1. 1. 溶液樣品盡量使用溶液樣品盡量使用透明的玻璃化溶液透明的玻璃化溶液，避免在這種匯聚式光路中，避免在這種匯聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均導(dǎo)致的光譜失真問題。由于比色皿中溶液的前后吸收不均導(dǎo)致的光譜失真問題。 2. 2. 為安全起見，對于使用揮為安全起見，對于使用揮發(fā)性劇毒溶劑發(fā)性劇毒溶劑的測試，一定要有合適的的測試，一定要有合適的防護防護。 3. 3. 易揮發(fā)、易變質(zhì)易揮發(fā)、易變質(zhì)的溶液最好的溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)測現(xiàn)配現(xiàn)測。4. 4. 液體樣品一般放在液體樣品一般放在帶蓋石英比色皿帶蓋石英比色皿（與紫外測

33、試所用比色皿不同，（與紫外測試所用比色皿不同，為側(cè)面全透明型）為側(cè)面全透明型）中進(jìn)行測試。中進(jìn)行測試。44測試準(zhǔn)備測試準(zhǔn)備 由于物質(zhì)的發(fā)射特性和吸收特性是緊密相關(guān)的，所以提前做好由于物質(zhì)的發(fā)射特性和吸收特性是緊密相關(guān)的，所以提前做好吸收譜可以有效縮短熒光測試的摸索時間。吸收譜可以有效縮短熒光測試的摸索時間。 對于不知道相關(guān)特性的樣品，吸收譜的測試比熒光光譜的測試對于不知道相關(guān)特性的樣品，吸收譜的測試比熒光光譜的測試要容易很多。要容易很多。所以，建議大家所以，建議大家先測一下樣品的吸收譜，并從中找出感興先測一下樣品的吸收譜，并從中找出感興趣的吸收峰和特性趣的吸收峰和特性，在熒光測試時以便參考。，

34、在熒光測試時以便參考。45光譜測試光譜測試1.1.開機開機 電源電源燈源燈源2.2.熒光光譜熒光光譜 固定激發(fā)光的波長，固定激發(fā)光的波長，選擇合適的熒光光譜波長范圍、濾光片、光選擇合適的熒光光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等路狹縫、掃描速度等測量不同熒光波長處熒光的強度，得到熒光測量不同熒光波長處熒光的強度，得到熒光光譜，即光譜，即熒光強度熒光強度熒光波長圖熒光波長圖。 3.3.激發(fā)光譜激發(fā)光譜 在熒光最強的波長處固定熒光波長，在熒光最強的波長處固定熒光波長，選擇合適的激發(fā)光譜波長范選擇合適的激發(fā)光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等測量隨激發(fā)光波長

35、的改變而測量隨激發(fā)光波長的改變而變化的熒光強度，得到熒光激發(fā)光譜。即變化的熒光強度，得到熒光激發(fā)光譜。即熒光強度熒光強度- -激發(fā)光波長圖。激發(fā)光波長圖。464.4.熒光光譜熒光光譜 在熒光最強的波長處固定激發(fā)波長，在熒光最強的波長處固定激發(fā)波長，選擇合適的熒光光譜波長范選擇合適的熒光光譜波長范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進(jìn)行發(fā)射譜的掃描。圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進(jìn)行發(fā)射譜的掃描。5.5.重復(fù)重復(fù)3 3、4 4步循環(huán)掃描得到理想的光譜圖。步循環(huán)掃描得到理想的光譜圖。7.7.關(guān)機關(guān)機 光源光源電源電源6.6.保存數(shù)據(jù)保存數(shù)據(jù)光譜測試光譜測試激發(fā)波長一定要小于發(fā)射波長激發(fā)波長一定要小于

36、發(fā)射波長。47光路狹縫和掃描速度的選擇光路狹縫和掃描速度的選擇如果光路狹縫太大，熒光信號太強，容易超出儀器檢測范圍，如果光路狹縫太大，熒光信號太強，容易超出儀器檢測范圍，損傷儀器；如果狹縫開的太小，熒光信號又太弱，檢測比較困損傷儀器；如果狹縫開的太小，熒光信號又太弱，檢測比較困難，所以要選擇大小合適的狹縫。難，所以要選擇大小合適的狹縫。如果掃描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信號；掃描太慢則如果掃描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信號；掃描太慢則浪費時間。所以只要能掃描得到平滑的光譜曲線就可以了。浪費時間。所以只要能掃描得到平滑的光譜曲線就可以了。48熒光光譜的應(yīng)用熒光光譜的應(yīng)用491.1.定量依

37、據(jù)與方法定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)定量依據(jù) 熒光強度熒光強度 If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率和熒光量子效率 ： If = Ia 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低時，將括號項近似處理后：濃度很低時，將括號項近似處理后： If = 2.3 I0 l c = Kc50（2 2）定量方法）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強度，繪制配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強標(biāo)準(zhǔn)

38、曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法：比較法： 在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強度，在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強度，比較；比較；512 、熒光光譜的應(yīng)用、熒光光譜的應(yīng)用熒光探針熒光探針金屬金屬-有機配合物（有機配合物（MOF）發(fā)光材料發(fā)光材料分子傳感器分子傳感器物質(zhì)的檢測物質(zhì)的檢測稀土摻雜發(fā)光材料稀土摻雜發(fā)光材料發(fā)光器件發(fā)光器件光譜光譜52(1)(1)無機化合物的分析無機化合物的分析 與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；

39、 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定； 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y定； 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定(2)(2)生物與有機化合物的分析生物與有機化合物的分析 見表 535455與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)構(gòu)非共價相互作用非共價相互作用而使一種或幾而使一種或幾種種熒光性質(zhì)發(fā)生改變熒光性質(zhì)發(fā)生改變的小分子物質(zhì)?？捎糜谘芯看蠓肿游锏男》肿游镔|(zhì)。可用于研究大分子物質(zhì)的性質(zhì)和行為。質(zhì)的性質(zhì)和行為。 熒光探針熒光探針目前常用的熒光探針有熒光素類探針、無機離子熒光探針、熒光量子目前常用的熒光探針有熒光素類探針、無機離子熒光探針、熒光量子點、分子信標(biāo)等。點、分子信標(biāo)等

40、。熒光探針除應(yīng)用于核酸和蛋白質(zhì)的定量分析外，在核酸染色、熒光探針除應(yīng)用于核酸和蛋白質(zhì)的定量分析外，在核酸染色、DNADNA電泳、電泳、核酸分子雜交、定量核酸分子雜交、定量PCRPCR技術(shù)以及技術(shù)以及DNADNA測序上都有著廣泛的應(yīng)用。測序上都有著廣泛的應(yīng)用。 熒光探針：熒光探針：56熒光探針熒光探針過渡金屬配合物過渡金屬配合物很多能實現(xiàn)較強的紅外波段寬帶發(fā)射，很多能實現(xiàn)較強的紅外波段寬帶發(fā)射，可以有效避開組織體的吸收，可以穿透組織體實現(xiàn)紅外可以有效避開組織體的吸收，可以穿透組織體實現(xiàn)紅外成像，克服同位素原子示蹤對人體的傷害；壽命處于成像，克服同位素原子示蹤對人體的傷害；壽命處于s s 量級，可

41、以用于較大分子的形變和轉(zhuǎn)動擴散研究，量級，可以用于較大分子的形變和轉(zhuǎn)動擴散研究，當(dāng)然，結(jié)合其特有的發(fā)射波段也能對活體環(huán)境中的許多當(dāng)然，結(jié)合其特有的發(fā)射波段也能對活體環(huán)境中的許多擴散和轉(zhuǎn)變過程進(jìn)行研究。擴散和轉(zhuǎn)變過程進(jìn)行研究。57稀土離子稀土離子是一類核酸探針的檢測試劑。是一類核酸探針的檢測試劑。在水溶液中僅有在水溶液中僅有Tb()和和Eu()發(fā)出熒光，與發(fā)出熒光，與DNA配合后仍保留熒配合后仍保留熒光性能，可特異識別核苷酸。光性能，可特異識別核苷酸。Tb()和和Eu()與一些小分子配體配合，由于配體本身性質(zhì)、中心與一些小分子配體配合，由于配體本身性質(zhì)、中心離子離子-配體成鍵及溶劑等因素影響，使配合物的激發(fā)態(tài)壽命達(dá)到配體成鍵及溶劑等因素影響，使配合物的激發(fā)態(tài)壽命達(dá)到ms 級，并發(fā)出窄而強的熒光。級，并發(fā)出窄而強的熒光。Tb()和和Eu()與小分子的配合物探針通過共價鍵與靶與小分子的配合物探針通過共價鍵與靶DNA 共價共價結(jié)合后多用于實時定量熒光結(jié)合后多用于實時定量熒光PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的分析及雜交