九染色體工程

1、第九章第九章 染色體工程染色體工程23什么是染色體工程？什么是染色體工程？染色體工程（chromosome engineering）：是人們按照一定的設計，有計劃地消減、添加或代換同種或異種染色體，從而達到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。廣義上講它還應包括染色體內(nèi)部的部分遺傳操作技術(shù)，因此也稱為染色體操作。4第一節(jié)人工誘導多倍體第一節(jié)人工誘導多倍體第二節(jié)雌、雄核發(fā)育第二節(jié)雌、雄核發(fā)育第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)第五節(jié)人工染色體第五節(jié)人工染色體5第一節(jié)人工誘導多倍體第一節(jié)人工誘導多倍體一一技術(shù)方法技術(shù)方法二二倍性鑒定方法倍性鑒定

2、方法三三優(yōu)點與缺點優(yōu)點與缺點6n多倍體（polyploid）是指每個體細胞中含有三個或更多染色體組的個體而言。在自然界中，多倍體現(xiàn)象在高等植物中相當多，而動物界卻少得多。n1939年，F(xiàn)rankhauser和Griftiths首先在兩棲類中成功地誘發(fā)了三倍體。n由于多倍體動物具有生長速度快，成活率高及抗病能力強等特點，所以人工誘導多倍體、改善動物經(jīng)濟性狀倍受重視。7一、技術(shù)方法一、技術(shù)方法8多倍體是由于細胞內(nèi)染色體加倍而形成的，即通過抑制受精卵第二極體的放出產(chǎn)生三倍體，或抑制第一次卵裂產(chǎn)生四倍體，可以利用生物、物理和化學的方法得到多倍體。 91. 生物學方法n 生物學上主要通過雜交尤其是種間雜

3、交獲得異源多倍體。n Rasch等（1965）年首次證明了三倍體脊椎動物可以通過雜交產(chǎn)生，他們將雌核發(fā)育的二倍體帆鱂（Poecilia formosa）與P.Vittate雜交，得到三倍體后裔。n 例如用雌性草魚（2n48）與雄性三角魴（2n48）雜交可以獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體。 n 異育銀鯽與興國紅鯉雜交獲得的復合四倍體，通過細胞方法證明其產(chǎn)生的原因是受精卵發(fā)生了兩性融合。n 這種不同科、屬、種之間的遠源雜交，會導致第二極體不排出，而產(chǎn)生多倍體。10包括溫度激變（溫度休克法）、機械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水靜壓法和高鹽高堿法等。 溫度休克法：冷休克法（05）和熱休克法（30

4、）。 定義：用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導三倍體或四倍體的方法。 關鍵：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。要達到這一點，必須考慮溫度處理的開始時間（TA）、處理持續(xù)時間（D）和處理溫度（T）這三個因素。 目前對魚類使用溫度休克法誘導三倍體的工作報道較多。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應用熱休克法好，而溫水性魚類用冷休克效果較好。 優(yōu)點：廉價、易操作，是誘導動物細胞多倍體化的常用手段，也有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。2. 物理學方法11 水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）抑制第二極體的放出或第一次卵裂來產(chǎn)生多倍體。 優(yōu)點：誘導率高（一般在90100）、處理時間短（35

5、min），對受精卵損傷小、成活率高。 缺點：需要專門的設備水壓機，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。12有些化學物質(zhì)也可以用來阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體。 細胞松馳素B：能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細胞質(zhì)分裂。 秋水仙堿：可以抑制細胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。 其它藥物：N2O 、CHCIF2和聚乙二醇等。 缺點：化學藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時加上化學藥物誘導產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒有價值的鑲嵌體，所以化學方法在實際中的應用不及物理方法。3. 化學方法13二、倍性鑒定方法二、倍性

6、鑒定方法141. 間接法：核體積測量、蛋白質(zhì)電泳、系列化學分析、形態(tài)學檢查等；2. 直接法：染色體計數(shù)、DNA含量測定等。15I 核體積測量：核體積測量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。核體積測量法省時、簡單，在生產(chǎn)現(xiàn)場就能進行而廣為人們采用，但缺乏準確性，亦測不出嵌合體，往往需要校正；I生化分析：生化分析：如在關東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。16I 染色體計數(shù)：染色體計數(shù)：是鑒定多倍性倍性的一種最為準確、直接方法，但缺點是費時；I DNA含量測定：含量測定：流式細胞儀。是較為先進常用的方法，其測定快速準確，并能測出嵌

7、合體，但需要特殊的儀器設備。I 采用何種方法均有利有弊有利有弊，進行鑒定主要依賴于所測樣本的發(fā)育時期、實驗要求和所具備的儀器設備條件。17三、優(yōu)點與缺點三、優(yōu)點與缺點18 多倍體育種技術(shù)方法簡單、見效快，具有潛在的理論和應用價值。 許多誘導的多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類等都具有良好的生存力和生長率。 種間雜種生長快，可以同時具有兩個不同的種的優(yōu)良特性。 利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動物生長，可以避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時間或影響商品價值，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，這在鮑魚、昆蟲等方面已有應用。 某些多倍體動物肉質(zhì)量、含氧量、抗病性等經(jīng)濟性狀較二倍體好。 1

8、. 1. 優(yōu)點優(yōu)點19準確的處理時間；誘導率、成活率及孵化率的提高；準確可靠的倍性鑒定方法的確定。2. 2. 缺點缺點20第二節(jié)雌、雄核發(fā)育第二節(jié)雌、雄核發(fā)育一一人工誘導雌核發(fā)育的方法人工誘導雌核發(fā)育的方法二二雌核發(fā)育的鑒別雌核發(fā)育的鑒別三三雌核發(fā)育的意義雌核發(fā)育的意義四四人工誘導雄核發(fā)育人工誘導雄核發(fā)育21n 雌核發(fā)育雌核發(fā)育（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細胞核發(fā)育成個體的生殖行為。同種或異種精子進入卵內(nèi)只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質(zhì)，其子代的遺傳物質(zhì)完全來自雌核，只具有母本的性狀。n 自然界中自然界中一些無脊椎動物和魚類等存在。 n 人工

9、誘導人工誘導雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍體動物。22n 凡雌核發(fā)育雌核發(fā)育的個體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染色體組的二倍體化。n 1911年，赫特威氏赫特威氏就第一個成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應”。 n 赫特威氏效應赫特威氏效應指只有在適當?shù)母咻椛鋭┝肯?，才能導致精子染色體完全失活，屆時精子雖能穿入卵內(nèi)，卻只能起到激活卵球啟動發(fā)育的作用。23一、人工誘導雌核發(fā)育的方法一、人工誘導雌核發(fā)育的方法24F物理方法：物理方法：采用射線包括

10、射線、X射線（效果較好）和紫外線（效果較差）等處理精子使精子的遺傳物質(zhì)失活。 F 化學方法：化學方法：采用化學物質(zhì)如甲苯胺藍、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色體遺傳活性的方法。F 顯微手術(shù)法：顯微手術(shù)法：采用顯微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。1.1.精子遺傳物質(zhì)的失活精子遺傳物質(zhì)的失活25F阻止第一次有絲分裂或第二極體的外排；F利用溫度、壓力或化學方法，如冷休克、熱休克、流體靜水壓、細胞松馳素B、聚乙二醇處理等。2. 2. 雌核染色體數(shù)目減少的阻止雌核染色體數(shù)目減少的阻止26u首先將兩個不同品系的近交系進行雜交。u交配后，在精核與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵，并用極細

11、的吸管將精核去掉。u在細胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細胞。u二倍體細胞在體外培養(yǎng)到囊胚期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。27二、雌核發(fā)育的鑒別二、雌核發(fā)育的鑒別28n 鑒別雌核發(fā)育的個體，通常以顏色顏色、形態(tài)形態(tài)以及生化生化等方面的指標為依據(jù)。也可以通過細胞學的研究細胞學的研究，如若是雌核發(fā)育，其囊胚細胞中只出現(xiàn)一套來自雌核的染色體，否則雌核和雄核染色體各占一半，得到的是雜交種。 n 用遺傳標志遺傳標志的方法來鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜合雌性個體的子代應該都是純合型；而如果是通過阻止

12、第二極體的外排產(chǎn)生的雌核發(fā)育個體，則子代的情況取決于著絲點與基因間的距離。在著絲點與基因距離遠離時，將明顯增加雜合型子代的比例。29三、雌核發(fā)育的意義三、雌核發(fā)育的意義30n 為生產(chǎn)單性種群生產(chǎn)單性種群提供了可能。n 能迅速地產(chǎn)生同源型二倍體同源型二倍體。n 提供某些致死突變致死突變種的生物品質(zhì)。n 在農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)中，可人工控制性別繁殖人工控制性別繁殖。n 廣泛地用于進行基因基因-著絲點的定位研究著絲點的定位研究。n 可利用產(chǎn)生新的純系來篩選除去有害的等位基因篩選除去有害的等位基因。31四、人工誘導雄核發(fā)育四、人工誘導雄核發(fā)育32n 雄核發(fā)育雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過紫外線

13、、X射線或射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當時間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。n 雄核發(fā)育的個體的生存率非常低生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因造成的。 n 但是仍舊在遺傳學基礎理論和育種中都有一定的價值有一定的價值，利用雄核生殖的精子可用于冷凍基因庫，保存種質(zhì)資源，對基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。33第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)一一染色體分離染色體分離二二染色體微切割染色體微切割341.1.原

14、理：原理：由于熒光染料Hoechst 只對A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結(jié)合的量和比例是不同的。結(jié)合這些染料后，再經(jīng)激光照射，染色體就會呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出的熒光波長輸入計算機，通過計算機控制就可將發(fā)出同一波長的染色體收集在一起，從而實現(xiàn)染色體的分離。一、一、 染色體分離染色體分離35細胞分裂同步處理染色體的熒光色素染色染色體分離2.2.染色體分離的染色體分離的具體步驟具體步驟36371. 微細玻璃針切割法：微細玻璃針切割法：采用特細的玻璃針（尖端直徑約為0.17m）在倒

15、置顯微鏡下對目的基因所在染色體區(qū)段進行切割與分離。2. 顯微激光切割法：顯微激光切割法：將染色體標本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，利用激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)，依靠高能量激光照射非選擇細胞或染色體，使其受熱蒸發(fā)，最后只留下目的染色體。二、二、 染色體微切割染色體微切割38第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)一一微細胞介導的基因轉(zhuǎn)移法微細胞介導的基因轉(zhuǎn)移法二二染色體介導轉(zhuǎn)移法染色體介導轉(zhuǎn)移法39n將同特定基因表達有關的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細胞，使該基因得以表達，并能在細胞分裂中一代又一代地傳遞下去。該技術(shù)稱為染色體轉(zhuǎn)移（或染色體轉(zhuǎn)導）。微細胞介導的基因轉(zhuǎn)移法（Microcell me

16、diated gene transfer，MMGT）染色體介導的基因轉(zhuǎn)移法（Chromosome mediated gene transfer，CMGT）40一、微細胞介導的基因轉(zhuǎn)移法n 微細胞微細胞（或（或微核體微核體）：）：是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。n 供體：供體：微細胞n 優(yōu)點：優(yōu)點：簡化供體基因的表達、對受體細胞影響小、微核染色體穩(wěn)定411.微細胞制備2.微細胞融合421. 微細胞的制備用化學藥劑和（如秋水仙素秋水仙素）阻斷供體細胞的有絲分裂，使染色體停滯在有絲分裂中期，從而在染色體周圍逐漸形成核膜而成為眾多的微核。然后在細胞細胞松弛素松弛素B的

17、作用下使微核逐漸突出細胞膜外。最后經(jīng)過離心離心獲得含有一個微核、四周有一薄層細胞質(zhì)和質(zhì)膜界限的微細胞。432. 微細胞的融合q制備的微細胞只能存活幾個小時，但經(jīng)融合可使其成為能夠存活的整體細胞。q常采用PEG作為細胞融合劑。q最好選用帶有營養(yǎng)缺陷標志營養(yǎng)缺陷標志的受體細胞。q由于微細胞的染色體含有互補的原養(yǎng)型基因，微細胞與受體細胞形成的雜合細胞即可在特定的選擇性選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)基中生長而被篩選出來。44n染色體介導轉(zhuǎn)移法：染色體介導轉(zhuǎn)移法：是指分離得到相應的染色體后轉(zhuǎn)入受體細胞的一種技術(shù)。n 基本步驟：基本步驟：誘發(fā)細胞同步分裂；阻斷細胞分裂于中期；破碎細胞；離心收集中期染色體；通過適當?shù)姆诸?/p>

18、轉(zhuǎn)移到受體細胞中去。二、染色體介導轉(zhuǎn)移法451. 細胞同步化與染色體的分離2. 染色體的轉(zhuǎn)移3. 受體細胞的分離與鑒定染色體介導轉(zhuǎn)移的過程染色體介導轉(zhuǎn)移的過程461. 1. 細胞同步化與染色體的分離細胞同步化與染色體的分離q用秋水仙素及合適的酶處理對數(shù)生長期的細胞q離心收集中期相細胞沉淀q洗滌數(shù)次q在中性緩沖液中培育q用注射針噴射細胞，使染色體釋放q離心收集染色體沉淀q蔗糖梯度離心或用流式細胞測量儀分離單條染色體472. 2. 染色體的轉(zhuǎn)移染色體的轉(zhuǎn)移染色體可以通過細胞的吞噬作用細胞的吞噬作用而進入受體細胞。一般先采用磷酸鈣和染色體一起沉淀，再用二甲基亞砜處理受體細胞，或采用卵磷脂與膽固醇制成

19、的脂質(zhì)體將染色體轉(zhuǎn)入受體細胞。48n分離：利用選擇性培養(yǎng)基進行篩選n鑒定：染色體組型分析同工酶分析其他方法3. 3. 導入基因的受體細胞的分離與鑒定導入基因的受體細胞的分離與鑒定49第五節(jié)人工染色體第五節(jié)人工染色體50n染色體要確保在細胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復制和向子細胞中平均分配。它需要3個關鍵序列個關鍵序列，包括自主復制自主復制DNA序列序列（autonomously replicating sequence，ARS）、著絲粒著絲粒DNA序列序列（centromere DNA sequence，CEN）和端粒端粒DNA序列序列（ telomere DNA sequence, TEL）。 51 將3個關鍵序列用分子生物學方法拼接起來就得到人造微人造微小染色體小染色體（artificial minichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結(jié)構(gòu)與功能關系等研究中得到了廣泛的應用，具有極為重要的價值。目前，正在研究或應用的有：n 酵母