武漢大學(xué)天然產(chǎn)物的提取茯苓

1、天然產(chǎn)物茯苓提取研究進(jìn)展武漢大學(xué)化學(xué)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系(200622030137) 1.研究意義 2.研究對象簡介 3.主要成分 4.主要成分提取流程 5.分析方法 6.研究新進(jìn)展 7.參考文獻(xiàn) 茯苓Poria cocos (Schw. )Wolf 為常用中藥, 性味甘淡,平,具有祛濕利水、健脾和胃、寧心安神的作用,用于治療小便不利,水腫脹滿,痰飲咳逆,嘔穢,泄瀉,遺精,淋濁,驚悸,健忘等。茯苓單用或與其他藥物配伍廣泛應(yīng)用于臨床,名醫(yī)洪竹書先生茯苓、甘草每方必用。茯苓在中醫(yī)臨床及人民生活中有著廣泛的使用價值。近些年來,國內(nèi)外對茯苓多糖、三萜類等成份及其藥理作用、生物活性方面作了較多的研究,并且有了

2、較大的進(jìn)展。從茯苓的藥理作用與社會、經(jīng)濟(jì)發(fā)展的眼光看, 其開發(fā)的前景會越來越受世人的廣泛關(guān)注。 我國食用茯苓的歷史已有兩千多年。神農(nóng)本草經(jīng)將茯苓列為“上品”，稱其“久服安魂養(yǎng)神，不饑延年”。南朝醫(yī)學(xué)家陶弘景辭官隱退后，梁武帝即令“每月賜茯苓五斤，白蜜二斤，以供服餌”?？梢姰?dāng)時茯苓被視為延壽珍品。唐宋時服食茯苓更加普遍，唐詩人賈島就有“二十年中餌茯苓，致書半是老君經(jīng)”之詩句。 常見者為其菌核體。多為不規(guī)則的塊狀，球形、扁形、長圓形或長橢圓形等，大小不一，小者如拳，大者直徑達(dá)2030厘米，或更大。表皮淡灰棕色或黑褐色，呈瘤狀皺縮，內(nèi)部白色稍帶粉紅，由無數(shù)菌絲組成。子實(shí)體傘形，直徑0.52毫米，口緣

3、稍有齒；有性世代不易見到，蜂窩狀，通常附菌核的外皮而生，初白色，后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈厣?，孔作多角形，?dān)子棒狀，擔(dān)孢子橢圓形至圓柱形，稍屈曲，一端尖，平滑，無色。有特殊臭氣。 寄生于松科植物赤松或馬尾松等樹根上，深入地下2030厘米。 加工:茯苓出土后洗凈泥土，堆置于屋角不通風(fēng)處，使其“發(fā)汗”，析出水分。然后取出，將水珠擦去，攤放陰涼處，待表面干燥后再行發(fā)汗。切制:于發(fā)汗后趁濕切制，亦可取干燥茯苓以水浸潤后切制。將茯苓菌核內(nèi)部的白色部分切成薄片或小方塊，即為白茯苓；削下來的黑色外皮部即為茯苓皮；茯苓皮層下的赤色部分，即為赤茯苓；帶有松根的白色部分，切成正方形的薄片，即為茯神。切制后的各種成品，均需陰

4、干，不可炕曬，并宜放置陰涼處，不 能 過 于 干 燥 或 通 風(fēng) . 以 免 失 去 粘 性 。 茯苓的主要化學(xué)成分為:多糖、三萜、脂肪酸、甾醇、酶等。 茯苓主含-茯苓聚糖(-pachyman)約占干燥品的93%,是具有-(1 6)吡喃葡萄糖為支鏈的(13)葡萄糖聚糖。另外還有茯苓次聚糖(pachymaran),木聚糖(xylam),-茯苓多糖f(-pachyman f),羧甲基茯苓多糖(Carboxymethyl pachymaran, CMPA)。 從茯苓中分離出39種三萜,主要分為以下幾類:羊毛甾-8-烯型三萜類化合物(Lanosta-8-ene type triterpenes) 羊毛

5、甾-7,9(11)-二烯型三萜類化合物(Lanosta-7,9(11)- diene type triterpenes) 3,4-開環(huán)-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜(3,4-seco-lanostan -7,9(11)-diene type triterpenes)該類化合物僅存在于茯 苓皮中 甾醇類主要存在于茯苓的石油醚、乙醚提取部位,其中主要含有 Ergosterol , Ergost - 7 - en - 3- ol , (22E) Er- gosta - 5 , 7 , 9 (11) , 22 - tetraen - 3- ol , Ergosta - 5 , 7 di-en -

6、 3- ol , (22E) - Ergosta - 6 , 8 (14) , 22 - trien - 3- ol ,(22E) - Ergosta - 7 , 22 - dien - 3- ol , (22E) - Ergosta - 8(14) , 22 - dien - 3- ol 辛酸( Caprylic acid) , 十一酸( Undecanoicacid) , 月桂酸(Lauric acid) , 十二酸(Dodecanoic acid) , 棕櫚 酸(Palmitic acid) 等 ; 組氨酸, 甲殼素, 蛋白質(zhì), 卵磷脂, 左旋葡萄糖, 腺嘌呤, 膽堿, 樹膠, 脂肪及酶

7、等; 無機(jī)元 素鈣, 鎂, 鐵, 鉀, 鈉, 錳, 磷, 硫, 硅, 鉻, 鎘, 銅, 鉛及 氯 。 茯苓多糖的提取主要是使用溶劑提取法,如下: 準(zhǔn)確稱取茯苓500g ,切成碎片,加入46 倍量的水,回流提取3 次,時 間分別是3 ,2 和1h。合并3 次提取液濾過,除去不溶性雜質(zhì),得2000ml 濾液。取600ml減壓蒸餾濃縮76ml ,在攪拌下加入乙醇,使含醇量達(dá)到80 % ,靜置12h ,離心,收集沉淀,加蒸餾水60ml 溶解煮沸,趁熱濾除不溶物,濾液在攪拌下再加入乙醇,使含醇量達(dá)到80 % ,放置,析出褐色沉淀后,低溫干燥,即得茯苓多糖粗品。再經(jīng)過一定處理制得精品。 用稀堿(1.0mo

8、l/ l的NaOH)分別處理水提后的茯苓渣。把用水提后的茯苓渣分別用5倍量的堿液置于不同的溫度下泡4小時,此時溶液呈粘稠狀,離心得上清液,把渣再用3倍量的堿液提取一次,所得上清液與合并,抽濾,濾液以10%的醋酸液中和至pH=6,再加3倍量的95%的乙醇,于4 放置過夜,離心沉淀,Smith降解,流水透析兩天,再依次用蒸餾水,無水乙醇,丙酮,乙醚洗滌后,真空干燥。 白茯苓1 000 g ,用無水乙醇浸泡20 h ,過濾,濾液濃縮至干,得濃縮物8.17 g ,取8 g 用適量硅膠H 吸附,加在裝有80 g 硅膠H 的真空快速色譜柱(VLC) 上,依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯( v v = 7 3

9、) 和乙酸乙酯洗脫,得到不同極性的三部分,其中石油醚2乙酸乙酯部分濃縮后用20 cm 20 cm 的硅膠GF254薄層板,在環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸 ( v v v = 6 4 0.5) 中進(jìn)行分離,甲醇重結(jié)晶得到晶( ) 3.4 mg ,晶( ) 14 mg ,晶( ) 25 mg. 取由真空快速層析柱上收集到的主含茯苓四環(huán)三萜( ) , ( ) , ( ) 的樣品500 mg 用150 mL 丙酮溶解,加入1 g 無水碳酸鉀和1 mL 1 ,2-二溴乙烷,回流4 h 后,熒光檢測. 反應(yīng)液過濾,濃縮后用20 cm 20 cm 的硅膠GF254薄層板, 在苯2石油醚2乙酸乙酯( v v v

10、= 3 2 1)溶劑系統(tǒng)中分離,甲醇重結(jié)晶,得目標(biāo)物: ( 1) 2.1 mg , ( 1) 4.8 mg , ( 1) 12 mg. 用同樣方法與1-溴-3-氯丙烷、1-碘丙烷反應(yīng)得目標(biāo)物( 2) , ( 2) , ( 5) , ( 2) . 取( 2) 200 mg ,加入2 mL 吡啶和1 mL 醋酸酐,室溫攪拌24 h 后,用6 mol/ L鹽酸將反應(yīng)液調(diào)pH 3 左右,用乙酸乙酯提取,熒光檢測,將乙酸乙酯液濃縮,用20 cm 20 cm 硅膠GF254薄層板,在苯-石油醚-乙酸乙酯( v v v = 2 2 015) 中進(jìn)行分離,甲醇重結(jié)晶,得目標(biāo)化合物( 3) 60 mg ,用同樣

11、方法制得目標(biāo)物( 4) , ( 3) , ( 4) . 取( 2) 250 mg 溶于20 mL 二氯甲烷中,加入吡啶嗡氯鉻酸鹽( PCC) 600 mg ,室溫攪拌10 h后,用20 cm 20 cm 的硅膠GF254薄層板,在苯-石油醚-乙酸乙酯( v v v = 3 2 1) 中進(jìn)行分離,甲醇重結(jié)晶,得目標(biāo)物( 5) 100 mg. 取( 2) 400 mg 溶于8 mL 無水乙醇中,加120 mg 鹽酸羥胺8 mL 吡啶,回流10 h 后,用6 mol/ L鹽酸將反應(yīng)液調(diào)pH 3 左右,用乙酸乙酯提取,熒光檢測,將乙酸乙酯液濃縮后,用20 cm 20 cm硅膠GF254薄層板,在苯-石

12、油醚-乙酸乙酯( v v v = 3 2 1) 中進(jìn)行分離,甲醇重結(jié)晶,得目標(biāo)物( 3) ,用同樣方法制得目標(biāo)物( 6) . 晶( ) 、晶( ) 和晶( ) 經(jīng)元素分析、紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜、核磁共振氫譜及碳譜等分析以及與文獻(xiàn)對照,確定結(jié)構(gòu)如圖 1所示. 所制備的14 個茯苓四環(huán)三萜衍生物均未見文獻(xiàn)報道,其結(jié)構(gòu)經(jīng)元素分析、紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜及核磁共振譜等確證無誤(見圖2 ,圖3) . 多糖在強(qiáng)酸作用下水解生成單糖,并迅速脫水生成糠醛,糠醛與酚性物質(zhì)如苯酚縮合成有色化合物,反應(yīng)迅速,完全,有色物質(zhì)穩(wěn)定,并且有色物生成量與多糖濃度存在定量關(guān)系,這樣用分光光度法在適當(dāng)波長處可以得到多糖含

13、量。本法簡便快速,易行。 精密吸取對照品溶液1. 0ml ,和供試品溶液1. 0ml ,分別置于20ml 的試管中,各精密加入5 %的苯酚液1. 0ml ,然后緩慢精密加入5. 0ml 濃硫酸,搖勻,放置30min后,在分光光度儀上測定波長從400524nm 之間的吸收度,兩者均在490nm 處有最大吸收,故選擇490nm 波長測定。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)測得最佳反應(yīng)條件是:5 %苯酚2. 0ml ,濃硫酸6. 0ml ,加酸后 放置 30min ,反應(yīng)溫度為室溫。 精密量取葡萄糖對照品溶液0 ,0. 1 ,0. 2 ,0. 4 ,0. 5 ,0. 6 ,0. 7 和0. 8ml 置于20ml 試管中,分

14、別加水至1. 0ml 再分別加入5 %苯酚溶液2. 0ml ,等充分混合后,然后加入濃硫酸6. 0ml ,再充分混合, 放置室溫, 在490nm處測得吸收度分別為0. 121 , 0. 249 , 0. 495 ,0. 614 ,0. 730 ,0. 815 和0. 913 。求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程: A = 0. 02282 c + 0. 02453 ( r = 0. 9994 , n = 7) 。 吸取供試品溶液1. 0ml 3 份,分別置于20ml 試管中,加入5 %苯酚溶液2. 0ml ,混合后加入濃硫酸6. 0ml ,放置30min ,在490nm 處分別測得其吸收度A 值:A1 =

15、0. 871 ,A2 = 0. 872 ,A3 = 0. 876 ,根據(jù)回歸方程求出百分含量為74. 16 % , 74. 27 % 和74. 62 % , 平均含量74. 35 %。 紅外光譜用于三萜類化合物的結(jié)構(gòu)測定, 主要根據(jù)區(qū)域A (1355 1692 cm - 1 ) 和區(qū)域B(1245 1330 cm - 1) 的碳?xì)湮諄韰^(qū)別四環(huán)三萜型和其它類型. 四環(huán)三萜的A ,B 區(qū)各有一個峰, 而齊墩果烷型和烏索烷型在A 區(qū)或B 區(qū)都有2 個或3 個峰. 茯苓中羊毛脂甾烷型和3, 4 開環(huán)羊毛脂甾烷型三萜化合物的21 個成分中, 只有化合物(1) , (3) , (8) 和(10) 的環(huán)上

16、雙鍵為8 位雙鍵, 其它17 個均為7, 9 (11) 異環(huán)雙烯, 這在茯苓三萜化學(xué)成分的紫外光譜分析中極為有用, 且在紫外光譜的242 (或243, 244) nm 處有最大吸收, 吸光系數(shù)一般在10000 以上. 在三萜類化合物的結(jié)構(gòu)測定中, 質(zhì)譜分析具有重要地位. 不同母核的三萜類化合物均有各自的裂解特征, 并遵循一定的規(guī)律, 產(chǎn)生一系列特征的碎片離子峰. 1HNMR 譜中主要信號來自雙鍵質(zhì)子, 連氧碳質(zhì)子和甲基質(zhì)子, 而13CNMR 譜中信號一般來源于環(huán)內(nèi)和環(huán)外雙鍵碳原子, 且所處位置不同, 其碳原子化學(xué)位移亦有明顯差別, 一般不受取代基團(tuán)的影響, 以此判斷其母核骨架類型、雙鍵位置和解

17、決某些立體化學(xué)問題. 茯苓多糖體具有增強(qiáng)免疫功能的作用。它具有抗胸腺萎縮及抗脾臟增大和抑瘤生長的功能。羧甲基茯苓多糖還是免疫調(diào)節(jié)、保肝降酶、間接抗病毒、誘生和促誘生干擾素、減輕放射副反應(yīng)、誘生和促誘生白細(xì)胞調(diào)節(jié)素等多種生理活性,無不良毒副作用。有實(shí)驗(yàn)證明,茯苓多糖確有針對性地保護(hù)免疫器官,增加細(xì)胞免疫功能,從而改善機(jī)體狀況,增加抗感染能力,尤其對老年人免疫功能有較強(qiáng)作用。另外茯苓聚糖還具有抗腫瘤作用和防石作用。最近有實(shí)驗(yàn)證實(shí),茯苓多糖能有效抑制大鼠腎內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的形成和沉積,具有較好的防石作用。Roberton 等認(rèn)為,尿液中主要抑制結(jié)石形成的物質(zhì)是酸性粘多糖。但茯苓多糖的防石作用機(jī)制是否與酸

18、性粘多糖一致,有待進(jìn)一步研究證實(shí)。 茯苓多糖及其衍生物(羧甲基茯苓多糖、羧甲基茯苓聚糖等) 的開發(fā)應(yīng)用, 目前還處于研究階段, 以茯苓多糖衍生物作添加劑制成茯苓飲料的工作, 目前已有人開始進(jìn)行。由于羧甲基茯苓多糖、羧甲基茯苓聚糖同羧甲基淀粉鈉(CM S) 一樣具有水溶性和增稠性, 由此可配制成茯苓系列保健食品。如茯苓冰淇淋、茯苓奶油蛋糕、茯苓果醬等。還可同固體飲料如豆?jié){晶、菊花晶、麥乳晶、果汁晶配伍制成茯苓系列飲料。在醫(yī)學(xué)上, 茯苓多糖對肝炎、鼻咽癌和胃癌等患者有一定的療效, 能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能, 特別引人注目的是羧甲茯苓多糖不僅是低濃度干擾素的誘生劑, 而且是理想的干擾素促生劑, 可提高單

19、位細(xì)胞干擾素的產(chǎn)量。據(jù)近期的研究報道, 發(fā)現(xiàn)茯苓中含有微量抗癌元素有機(jī)鍺。湖北省化學(xué)研究所與海南應(yīng)用技術(shù)研究所合作, 正在開發(fā)一種茯苓花生奶茶, 試制研究表明, 該飲料酸甜適口、營養(yǎng)豐富、性能穩(wěn)定, 是一種新型的天然飲品, 已引起不少廠家的興趣。 茯苓素體外對小鼠白血病L210細(xì)胞的DNA 合成有明顯不可逆的抑制作用,可顯著抑制L1210C 的核苷轉(zhuǎn)運(yùn),抑制L1210DNA 合成的補(bǔ)償途徑的各個環(huán)節(jié),對胸苷激酶有一定抑制作用。且茯苓素對抗癌藥有一定增效作用。茯苓素在體內(nèi)外均有明顯增強(qiáng)巨噬C 產(chǎn)生誘生腫瘤壞死因子的能力 。 茯苓由三萜1 和12 作為蛇毒液的磷脂酶A2 (PLA2) 的抑制劑,P

20、LA2 可抑制多種炎癥過程。 茯苓三萜及其衍生物抑制蛙口服五水CuSO4 引起的嘔吐。實(shí)驗(yàn)證明,側(cè)鏈上C -24 位具有末端雙鍵基團(tuán)的三萜顯示對蛙有止吐作用。 茯苓三萜類成分除了具有上述功效外還具有增強(qiáng)免疫功能,利尿等作用。近年來, 國內(nèi)學(xué)者對傳統(tǒng)中藥茯苓應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究與臨床觀察方法和手段進(jìn)行了深入廣泛的研究, 進(jìn)一步探明了茯苓許多與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相關(guān)而原來未知的功效。 其發(fā)展也相當(dāng)迅猛,很早以前, 我國食用茯苓就有“南糕北餅”的傳統(tǒng)習(xí)慣。茯苓食品的一些品種在我國曾一度失傳。近年來隨著食品療法的重新興起, 茯苓食品也得到了發(fā)展, 許多茯苓食品相繼問世。在北京可以買到茯苓夾餅, 崇文門外的應(yīng)市早點(diǎn)中還有“茯苓豆沙