第34章 DNA的復制和修復(2015-5-11) 3

1、第34章 DNA的復制和修復DNA Replication and RepairDNA Replication DNA復制 DNA修復合成 反轉錄DNA的體外復制：分子克隆（PCR）。 DNA生物合成第一節(jié) DNA的生物合成DNA生物合成的方式：（一）（一）. DNA半保留復制半保留復制 1953年，Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結構模型時，就推測DNA可能按照半保留機制進行自我復制。 1、半保留復制半保留復制(semiconservative replication)：定義定義：DNA復制的一種方式，每條鏈都可用作合成互補鏈的模板，合成出兩分子的雙鏈DNA，每個分子都是由一條親代

2、鏈和一條新合成的鏈組成。 P408DNA復制具有兩個特點：（復制具有兩個特點：（半保留復制半保留復制）和（和（半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制） 一、一、DNA復制復制彌散式彌散式 possible copying mechanism OF DNA DNA復制方式有三種可能性復制方式有三種可能性：全保留、半保留和分散全保留、半保留和分散式。式。 2. DNA半保留復制的證明(兩個)( (1) ) 密度梯度離心密度梯度離心 ( (重同位素標記重同位素標記）1958年Meselson和Stahl采用重同位素重同位素15N作DNA標記，同時可以否定另外兩種復制方式 密度梯度離心(2) 放射性同位素自顯影 1

3、963年，Cairns設計了一個更為嚴謹?shù)膶嶒灧派浞派渥燥@影自顯影的方法，進一步證實了DNA的半保留復制； 1957年，Taylor的實驗證明，在真核生物中，DNA的復制也是半保留的B:（雙鏈標記） A和C:（單鏈標記）H3-標記的脫氧胸苷脫氧胸苷 單鏈DNA首先復制合成雙鏈的復制型復制型（單鏈DNA復制時，通常先形成雙鏈復制型，再進行半保留復制）。 無論是復制、轉錄或逆轉錄，在形成雙鏈螺旋分子時都是通過堿基配對來完成的。半保留半保留復制非常普遍 DNA半保留復制的意義 意義意義：按半保留復制方式，子代：按半保留復制方式，子代DNA與親代與親代DNA的堿的堿基序列一致，子代保留了親代的全部遺傳

4、信息，體現(xiàn)了遺基序列一致，子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎，但是相對的。傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎，但是相對的。1. 設計實驗證明設計實驗證明DNA是半保留復制是半保留復制 -2012大連理工大學生物化學2. 豬流感病毒豬流感病毒HRN1是反轉錄病毒，試想出實驗方案以阻止是反轉錄病毒，試想出實驗方案以阻止病毒在細胞內復制而不影響細胞內病毒在細胞內復制而不影響細胞內DNA正常復制正常復制 -2012山東大學生物化學3. 簡述Mettew Meselson和Franklin Stahl設計了一個什么樣的實驗,證實DNA的復制是半保留復制思考題思考題 華東

5、師范大學2007年生物化學思考題思考題20102010年南開大學年南開大學（二）、半不連續(xù)復制（二）、半不連續(xù)復制（P418） （1）DNA聚合酶只能在53方向延長DNA （2）DNA是反向雙螺旋 DNA聚合酶如何同時完成2條鏈的復制 ? ?半不連續(xù)復制 定義：定義： DNA一條鏈連續(xù)合成和另一條鏈不連續(xù)合成的復制方式,稱為DNA的半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制。 DNA聚合酶只能按53方向催化合成DNA，不能催化35方向合成, 領頭鏈領頭鏈隨從鏈隨從鏈岡崎片段岡崎片段: :引物引物半不連續(xù)復制(續(xù)1) 領頭鏈領頭鏈:對應3 5的模板鏈，順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領頭鏈。

6、隨從鏈隨從鏈:對應53的模板鏈，復制的方向與解鏈方向相反，復制不是連續(xù)延長復制不是連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為隨從鏈。 岡崎片段岡崎片段: :隨從鏈中不連續(xù)的DNA片段稱為岡崎片段。 原核生物原核生物: : 10002000個核苷酸，相當于一個順反子真核生物真核生物: : 100200個核苷酸（相當一個核小體）思考題1. 是非判斷題是非判斷題 DNA分子是由兩條鏈組成，其中一條鏈作為前導鏈的模分子是由兩條鏈組成，其中一條鏈作為前導鏈的模板，另一條鏈作為后隨鏈的模板板，另一條鏈作為后隨鏈的模板。 廈門大學廈門大學2005年生物化學年生物化學前導鏈和滯后鏈是針對某個復制叉而言的 思思 考考 題

7、題（1）如何證明岡崎片斷的存在如何證明岡崎片斷的存在？（2）最初對岡崎片斷測定的實驗表明，其數(shù)量遠超過新合成最初對岡崎片斷測定的實驗表明，其數(shù)量遠超過新合成 DNA的一半，好象兩條鏈都是不連續(xù)的，試分析原因的一半，好象兩條鏈都是不連續(xù)的，試分析原因？提示：（1） 同位素標記dNTP，經(jīng)過一段時間后終止合成， 檢查發(fā)現(xiàn)標記出現(xiàn)在小片段DNA上，且小片段 DNA分子量相同，數(shù)量較多。 （2）前導鏈會少量的dUMP摻入，后尿嘧啶堿基被切除 形成AP位點，后該處磷酸二酯鍵打斷，部分核苷 酸，水解，造成一個缺口，后被修復，該過程會產(chǎn) 生一些類似岡崎片斷的DNA片段。P418脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成：dU

8、TP一旦形成就被轉化成dUMP ?dUTPase活性高低的影響？DNA復制復制DNA復制復制XUUAAUUAA 解 釋糖苷酶糖苷酶(ung)+ )+ 其他酶U等被切除等被切除（如果糖苷酶失活ung-，結果會如何？），結果會如何？）判斷：判斷：DNA聚合酶可以利用dUTP做底物。 解 釋UUdenature 糖苷酶糖苷酶- ung dump 片段越長,大約有一半的新生DNA為被脈沖標記的岡奇片段AA dut dump 片段越短dUTPase DNA 沒有U ！ 解釋解釋 E.coli dUTPase，它能使 dUTP變成 dUMP， dUMP是不能作為DNA合成的底物，這樣它就不再能加入DNA中

9、。 尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N- glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無 Pu和 Py位點（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP內切酶在AP位點切出一個缺口，進一步進行切除修復。 解解 釋釋 (1) 在 dut -突變體（ dUTPase缺失）中岡崎片段比在 dut +中為短。這是因為U摻入機會增加； (2) 在 ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突變體中，新合成的DNA約有一半由片段組成。 (3) 因為尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不會切除U的糖苷鏈，也就不會出現(xiàn)AP位點，所以堿沉淀時不易斷裂，從而保持了半不連續(xù)的原貌。 在 dut-,

10、ung-雙突變體中，結果和實驗（2）相同，更進一步證實了此推測。思考題1. 細胞DNA復制是半不連續(xù)的，這是因為： A. DNA 聚合酶只能從35 合成DNA鏈 B. 模板雙鏈是反平行的 C. DNA 聚合酶只能一個一個地加接核苷酸殘基 D. DNA 酶法合成是個自發(fā)過程 南開大學2006年生物化學2. 論述半保留復制和半不連續(xù)復制的過程 2011年天津大學生物化學思考題3. DNA是以半保留方式進行復制的，如果放射性全標記的雙鏈DNA分子在無放射性標記的溶液中經(jīng)兩次復制，那么所產(chǎn)生的4個DNA分子其放射性狀況如何？ A、兩個分子含有放射性； B、全部含有放射性； C、雙鏈中各有一半含有放射性

11、； D、所有分子的兩條鏈都沒有放射性。 華南理工大學2006年生物化學思考題3. DNA復制時候后隨鏈是岡崎片段，為什么前導鏈也是小片段 山東大學2010年生物化學二二、DNA復制的起點和方式復制的起點和方式 復制子復制子:基因組中可以獨立進行復制的單位基因組中可以獨立進行復制的單位， 它包括DNA每條鏈的一個復制起點序列，可能還有一些終止序列。（復制在復制在起始階段進行調控起始階段進行調控, ,一旦起始，將復制下去，直到完成）一旦起始，將復制下去，直到完成）1、原核生物和病毒為單復制子單復制子，真核生物為多復制子多復制子P408思考題 岡崎片段岡崎片段不是一個復制子，其起點也非復制起點 復制

12、的類型和方式復制的類型和方式 復制方向大多數(shù)是雙向的（等速進行或異速進復制方向大多數(shù)是雙向的（等速進行或異速進行），形成兩個復制叉，少數(shù)是單向復制，形成一個行），形成兩個復制叉，少數(shù)是單向復制，形成一個復制叉。復制叉。（1）、直線雙向復制直線雙向復制 單點雙向單點雙向：T7 多點雙向多點雙向：真核染色體DNA（2）、型復制：型復制：環(huán)狀雙鏈DNA，單向或雙向（E .coli.） 復制的類型和方式復制的類型和方式 首先將E.coli染色體，切成1%染色體長度的片段，分別進行（分子雜交）分子雜交），后放射自顯影大腸桿菌OriC在liv位點P409 大腸桿菌復制起點大腸桿菌復制起點：OriC（ori

13、gin of Chromosomal replication） 2、復制往往具有一定的起點 復制的方向判斷 先低放射性先低放射性再高放射性再高放射性（3H-脫氧胸苷脫氧胸苷）P409DNA復制起點的特點（1）復制起點較保守富含AT，含一些反向重復反向重復序列（2）兩條鏈復制起點可以在不同的點上（如：D-環(huán)復制）（3）DNA復制的控制在起點控制復制的控制在起點控制，復制的速度決定于起始復制的速度決定于起始 頻率（延伸的速度比較恒定，不決定于培養(yǎng)基狀況）頻率（延伸的速度比較恒定，不決定于培養(yǎng)基狀況） DNA鏈的呼吸作用：鏈的呼吸作用：DNA（復制原點處）氫鍵迅速斷裂與再生，導致兩條DNA鏈不斷解鏈

14、與聚合，形成瞬間的單泡狀結構的過程。判斷題 1. 通常DNA復制終止時并不需要特定的信號。 () 中山大學2002年生物化學試題 2. 真核生物DNA復制起點的序列專一性要低于細菌和病毒 （）.思考題特殊的復制方式特殊的復制方式滾環(huán)復制 主要發(fā)生在病毒主要發(fā)生在病毒中,細菌F因子(F factor)；如X174 噬菌體 （單向復制？） 在正鏈正鏈DNA上打開一個切口切口； 以切口的3-端為引物開始合成環(huán)鏈DNA的互補鏈，取代開環(huán)的鏈；3-OHP410滾環(huán)復制滾環(huán)復制NOTE: can get single unit genomes or multimeric copies 單向復制單向復制 復

15、制的類型和方式復制的類型和方式滾環(huán)復制滾環(huán)復制E. coli phage (噬菌體）: X174 “Template “rolls”, extrudes leading strand Okazaki frags made on leading strand as it emerges. 單向復制單向復制 ？ 特殊的復制方式特殊的復制方式- -D環(huán)復制D環(huán)復制環(huán)復制： 線粒體、葉綠體線粒體、葉綠體DNA（不對稱復制，兩條 鏈的復制起點不在同一點上，一條鏈先復制，另一條 鏈保持單鏈而被取代：當一條鏈復制到一定程度時才 暴露出另一條鏈的復制起點，另一條鏈才開始復制， （單向復制，全連續(xù)復制，沒有岡崎

16、片段）（單向復制，全連續(xù)復制，沒有岡崎片段） D-環(huán)擴充越過被取環(huán)擴充越過被取代鏈的復制起點；代鏈的復制起點； 被取代鏈啟動復制，方被取代鏈啟動復制，方向與第一條鏈相反；向與第一條鏈相反； 兩條鏈的合成沒有岡崎兩條鏈的合成沒有岡崎片斷片斷單向復制，全連續(xù)復制單向復制，全連續(xù)復制 特殊的復制方式特殊的復制方式- -D環(huán)復制 特殊的復制方式特殊的復制方式- -2D環(huán)復制葉綠體DNA復制的類型和方式復制的類型和方式多復制叉復制多復制叉復制 第一輪復制尚未完成，復制起點就開始第二輪的復制。 DNA復制時復制叉前進的速率比較恒定，復制時復制叉前進的速率比較恒定，DNA復制的速率實復制的速率實際上取決于起

17、始頻率。際上取決于起始頻率。 E.coli復制叉移動的速率約50Kb/min，復制一代約需40分鐘4.2X106/（50KbX2）=42。富營養(yǎng)時，可采取多復制叉復制方式，結果結果20min可以可以復制一代復制一代。 真核生物真核生物DNA的復制 真核復制叉前進的速率約1000-3000bp/min，采用多復制子方式，真核染色體復制一代要6-8小時。 1. 一條染色體上具有多個復制子，同一染色體上，各復制子長度不同。 2. 不同生長期，復制子數(shù)目不同。 如果蠅，生長旺盛期，細胞快速分裂，復制子數(shù)目可擴增十倍。 3. 每個每個復制起點復制起點在每個復制周期中只啟動一次。在每個復制周期中只啟動一次

18、。 4. 相鄰復制子的終點是隨機碰撞會合的。1. 已知大腸桿菌在37 攝氏度時雙向復制一次約需40分鐘，但在這些培養(yǎng)基內，細菌分裂可達20 分鐘一次，為什么？ 中山大學2000年生物化學試題思考題2、名詞解釋：滾環(huán)復制2013山東大學3、判斷：滾環(huán)復制是噬菌體DNA 在細菌中最常用的一種復制方式2008南京大學4 4、滾滾滾環(huán)復制滾環(huán)復制（BDE） A、是細胞DNA的主要復制方式。 B、可以使復制子大量擴增。 C、產(chǎn)生的復制子總是雙鏈環(huán)狀拷貝。 D、是噬菌體DNA在細菌中最通常的一種復制方式。 E、復制子中編碼切口蛋白的基因的表達是自動調節(jié)的思考題三、 DNA復制有關的酶及蛋白質因子 底物底物

19、：dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP） 模板模板（template）：解開成單鏈的DNA母鏈 引物引物（primer）：提供3-OH末端(體內為RNA, 體外為DNA, 如 PCR反應) 酶及蛋白質因子酶及蛋白質因子 DNA聚合酶：依賴DNA的DNA聚合酶 解鏈（解旋酶）類，單鏈結合蛋白 引物酶，拓撲異構酶 DNA連接酶（P410） 需4 種dNTP（不是不是dNDP、dNMP、NTP） 需DNA模板模板 需引物引物 (DNA、RNA) 53方向越長 （化學合成方向與此相反）P413DNA聚合反應和聚合酶 DNA + dNTP = DNA(n+1) + PPiDNA聚合酶反應的特

20、點 DNA + dNTP = DNA-dNMP + PPi-磷酸磷酸dNTP思考題思考題1. 一個同學想研究一個同學想研究DNA復制過程用放射性磷來標記底物，他復制過程用放射性磷來標記底物，他標記的磷是標記的磷是第第3位的磷，問是否能夠達到目的位的磷，問是否能夠達到目的。 2012年山東大學生物化學年山東大學生物化學思考題思考題2. 用放射性磷元素標記dNTP的-磷酸磷酸，參與DNA合成，分離后用檢測其放射性以確定在合成過程中標記核苷酸摻入的量1）、這一過程的化學原理2）、如只標記一種dNTP放射性檢測結果會有什么不同3）、如果在加入時不小心漏加了一種核苷酸，對放射性的影響4）、如標記其它位置

21、的磷元素結果如何。 2012年山東大學生物化學 2. 大腸桿菌的DNA聚合酶DNA聚合酶： DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶（聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指導的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均縮寫為DDDP。（P414） （1）.大腸桿菌的DNA聚合酶 I 單鏈單鏈球狀蛋白，含鋅鋅原子，多功能酶。 5 3DNA 聚合酶聚合酶活力（使DNA 鏈從53方向延長） 3 5 核酸外切酶核酸外切酶活力，起校正校正功能； 5 3 核酸外切酶活

22、核酸外切酶活力，切除引物或修復由紫外線照射 而形成的嘧啶二聚體； 聚合反應的逆反應聚合反應的逆反應（由3端焦磷酸解） DNA + dNTP = DNA-dNMP + PPi DNA復制過程中堿基對受雙重校對 （DNA聚合酶聚合酶選擇作用選擇作用）（3 5外切酶外切酶的校對作用）的校對作用）DNA聚合酶的右手裝結構沒有校對作用的錯誤率沒有校對作用的錯誤率：10-5，有校對作用的錯誤率有校對作用的錯誤率5x10-7 35外切酶活性校對作用 某些T4噬菌體突變株中DNA復制的真實性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4 DNA聚合酶的35外切酶活性很低，起著促突變因子的作用。 相反，另外一些具

23、有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的35外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復制真實性好，變異率低。可見，35外切酶活性對DNA復制真實性的維持是十分重要的。 DNA聚合酶I的部分水解DNA-pol木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶N 端C 端小片段大片段/Klenow 片段 53核酸外切核酸外切酶活性酶活性 DNA聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性（P414）DNA聚合酶 I的特點 Klenow 片段 (Klenow fragment)： E.coli DNA聚合酶I經(jīng)部分水解生成的C末端605個氨基酸殘基片段。該片段保留了DNA聚合酶I 的5-3聚合酶和3-5外切酶活性， Klenow片段

24、是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。 Sanger（雙脫氧非）DNA測序中使用Klenow片段優(yōu)于全酶？最好使用沒有校對活性的酶？DNA聚合酶I的功能 遺傳學分析表明DNA聚合酶I 復制速度慢，持續(xù)合成能力差，不是主要的復制酶，主要是參與引物主要是參與引物切成或切成或DNA的損傷修復的損傷修復 （2）. 大腸桿菌的DNA聚合酶 53 聚合酶活性 35 外切酶活性 無 53 外切酶活性 它只是在無pol I及pol 的情況下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在損傷修復中有特殊作用可能在損傷修復中有特殊作用。在在DNA聚合酶聚合酶 I活性低的細菌中發(fā)現(xiàn)活性低的細菌中發(fā)現(xiàn),

25、,多多亞基亞基 (3).大腸桿菌的DNA聚合酶 結構特點：結構特點：含含鋅鋅原原子子 由10種亞基組成不對稱異源二聚體異源二聚體。 核心酶核心酶（） 亞基亞基：53 聚合酶活性 亞基亞基：3 5外切酶活性和 堿基選擇功能，是復制保真性所必需 亞基亞基:可能起組裝作用 亞基亞基：夾穩(wěn)模板鏈并使酶沿模板鏈滑動,維持進行性 - -復合物復合物：促進全酶組裝至模板及增強核心酶活性EpsilonThetaDNA聚合酶全酶功能：原核生物復制延長中功能：原核生物復制延長中真正起催化作用的真正起催化作用的酶酶大腸桿菌的三種DNA聚合酶小節(jié)催化DNA聚合，主要復制酶參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復修復合成、切除引物

26、、填補空隙功能2040400分子數(shù)/細胞1011亞基數(shù)-+5 外切酶活性+ 5外切酶活性+5 聚合酶活性pol IIIpol IIpol I突變后的致死性突變后的致死性 可能可能 ？ 可能可能P414（4）大腸桿菌DNA聚合酶和. 新近發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶和，參與易錯鏈的修復。 pol IV: (encoded by dinB gene) a) SOS repair enzyme of damaged DNApol V: (encoded by umuD2C gene) a) SOS repair enzyme of damaged DNA 連接連接DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰 DN

27、A 鏈鏈5 -P末端，形末端，形成磷成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。鏈連接成完整的鏈。反應需要提供能量反應需要提供能量 能量：能量：細菌的連接酶利用細菌的連接酶利用NAD+。 能量：能量：動物和噬菌體的連接酶利用動物和噬菌體的連接酶利用ATPP4173. DNA連接酶（DNA ligase） 酶酶ATP(或或NAD+) +酶酶Connect two adjacent ssDNA strands by joining the 3-OH of one DNA strand to the 5-P of another DNA strand. DNA連接

28、酶過程連接酶過程 P417共價催化共價催化共價的共價的酶酶- -AMP中間物中間物The reaction catalyzed by DNA ligase (1) NAD+或ATP將其腺苷酰基轉移到DNA連接酶的一個賴氨酸殘基的氨基上形成共價的酶共價的酶-AMP中間物，同時釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)或焦磷酸； (2) 將酶-腺苷酸中間物上的AMP再轉移到DNA的5-磷酸基端，形成一個焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸; (3) 被激活的5-磷?；丝梢院虳NA的3-OH端反應合成磷酸二酯鍵，同時釋放出AMP。 細菌細菌的連接酶的連接酶只能連接堿基只能連接堿基互補基礎上雙鏈中的單鏈缺口互補基礎上

29、雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈。若DNA兩股都有單鏈切口，只要缺口前后堿基互補也可連接 DNA連接酶在復制、DNA修復、修復、 重組、剪接中均起縫合重組、剪接中均起縫合缺口作用，是重要的工具酶之缺口作用，是重要的工具酶之一一。 DNA連接酶 4. 引物酶引物酶 (primerase)（P419） 前導鏈只需要一個引物，滯后鏈需要多個引物前導鏈只需要一個引物，滯后鏈需要多個引物引物為一小段引物為一小段RNA 引物酶引物酶 (primerase) DNA聚合酶不能發(fā)動新鏈的起始，只能催化鏈的延伸-DNA合成需要引物，復制的引物為一小段復制的引物為一小段RNA,岡崎片岡崎片斷

30、的斷的5末端連接有末端連接有小段小段RNA做引物做引物,以提供自由的以提供自由的3-OH，使子代使子代DNA鏈能夠開始聚合。鏈能夠開始聚合。 (1) DNA合成除需要dNTP外，還需要(NTP)-引物引物需要需要，引物為引物為RNA (2) DNA復制需RNA聚合酶聚合酶-（引物合成酶）引物合成酶）, ,一種依賴DNA的RNA聚合酶引物酶 引物酶對 RNA聚合酶抑制劑不敏感，對利福平不敏感 引物酶, 本身無活性, 需組裝成引發(fā)體才能催化RNA引 物的合成。大腸桿菌的引物酶：Dna G 合成引物50-100nt（長）真核生物的引物酶：DNA聚合酶a 合成引物10nt左右 DNA復制為什么要用引物

31、？（為什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？為什么引物為RNA?） 從模板復制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配 新復制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的3， 5，校對功能難發(fā)揮作用。 為什么需要引物5. DNA復制的拓撲異構性質UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion 天然天然DNA存在著存在著負超螺旋負超螺旋，這對于DNA分子的解旋非常由利。但隨著復制的進行，復制叉前方的親代DNA會形成正超螺旋，然會積累巨大的張力，這種張力主要是通過DNA拓撲異構酶拓撲異構酶作用消除的作用消除的。P419 DNA復制的拓撲

32、異構性質拓撲異構酶拓撲異構酶:(與轉錄有關與轉錄有關) 切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。每一次催化作用可消除一個負超螺旋，L值增加1. 反應不需ATP拓撲異構酶拓撲異構酶:(:(與復制有關與復制有關) ) 切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端， DNA分子引入負超螺引入負超螺旋狀態(tài)。每次催化作用使L減少2，又稱促旋酶。（DNA topoisomerase）Type I topoisomerases共價催化共價催化Type I topoisomerases共價催化共價催化細菌中的旋轉酶細菌

33、中的旋轉酶 細菌中稱為旋轉酶（gyrase)，屬于拓撲異構酶引入負超螺旋狀態(tài)引入負超螺旋狀態(tài) Topoisomerases as drug targets: Because dividing cells require greater topoisomerase activity due to increased DNA synthesis, topoisomerase inhibitors areused as chemotherapeutic agents. Camptothecin(喜樹堿喜樹堿 )- Topo I inhibitor Doxorubicin(阿霉素或多柔比星阿霉素或多柔

34、比星)- Topo II inhibitor These drugs act by stablilzing the DNA-Topoisomerase complex.Also, some antibiotics are inhibitors of the bacterial-specific toposisomerase DNA gyrase e.g. ciprofloxacin喹諾酮類喹諾酮類 殺菌與抗癌殺菌與抗癌6. DNA解螺旋酶（解旋酶，解鏈酶解鏈酶） 解鏈酶解鏈酶依賴于單鏈依賴于單鏈DNA，對，對單鏈單鏈DNA親和力強親和力強 解旋過程消耗解旋過程消耗ATP：2ATP/bp；具有A

35、TPase活性 DnaB 蛋白在后隨鏈模板沿蛋白在后隨鏈模板沿53移動； Rep蛋白或蛋白或Pri A 蛋白沿前導鏈模板 35移動 DNA解螺旋酶（解旋酶解旋酶）不是拓撲異構酶，細菌中拓撲異構酶稱為旋轉酶旋轉酶P4217. 單鏈DNA結合蛋白 四聚體的蛋白四聚體的蛋白； 與DNA單鏈發(fā)生結合； 結合具有協(xié)同效應 穩(wěn)定DNA解鏈后 的單鏈狀態(tài)，并保 護核酸不被降解。 使DNA的Tm下降真核生物中為真核生物中為Rp-A缺失會致死 Single Strand DNA Banding Protein (SSB)P421 四、原核生物DNA復制的過程復制過程分為：復制過程分為：起始起始，延伸延伸，終止終

36、止三個基本步驟三個基本步驟P421( (一一).). DNA復制的起始復制的起始( initiation) E.coli的復制起點的復制起點OriC是決定和控制是決定和控制E.coli染色體復制的唯一片段。染色體復制的唯一片段。大腸桿菌的復制起點大腸桿菌的復制起點（OriC） E. coli 復制起始點oriC的序列特征 E.coli的復制起點的復制起點OriC中中有二個復制必需區(qū)域有二個復制必需區(qū)域： 4個是9bp重復序列重復序列，能與起始蛋白能與起始蛋白Dna A特異結合，對于特異結合，對于DNA復復制的起始十分重要；制的起始十分重要；3個是個連續(xù)出現(xiàn)的個是個連續(xù)出現(xiàn)的13bp序列，序列，

37、富含富含A和和T，有利于雙螺旋，有利于雙螺旋DNA局部解旋局部解旋并暴露兩條復制模板鏈并暴露兩條復制模板鏈。 富含富含A和和T原核生物原核生物DNA復制起始的相關蛋白質復制起始的相關蛋白質蛋白蛋白功功 能能曾用名曾用名DnaA辨認復制起點辨認復制起點 DnaB結合于結合于DnaA, 提供解旋酶活性提供解旋酶活性解螺旋酶解螺旋酶DnaC與與DnaB形成復合體形成復合體 DnaG合成引物合成引物 引物酶引物酶 HU刺激起始，促進復合體形成刺激起始，促進復合體形成 Gyrase解除正超螺旋，引入負超螺旋解除正超螺旋，引入負超螺旋 旋轉酶旋轉酶 SSB穩(wěn)定單鏈穩(wěn)定單鏈DNA單鏈結合蛋白單鏈結合蛋白P4

38、22DNA復制的起始Dna BDna GDna C引發(fā)體引發(fā)體( Dna B+ Dna G)+ATPHU前引發(fā)復合物前引發(fā)復合物負超螺旋負超螺旋DNA復制的起始復制起始消耗復制起始消耗ATP復制的起始 復制的起始，復制的起始，要求要求DNA呈負超螺旋呈負超螺旋，這是因為DnaA只能與負超螺旋的DNA相結合，負超螺旋比正超螺旋有更好的負超螺旋比正超螺旋有更好的模版作用。模版作用。 復制的起始，復制的起始，要求起點附近的基因處于轉錄狀態(tài)，要求起點附近的基因處于轉錄狀態(tài)，RNA聚合酶對復制起始的作用，可能是因為其在起始點附近合成一段RNA，形成RNA突環(huán)，影響起點的結構，因而有利于DnaA的作用 研

39、究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DNA復制唯一一個受到調節(jié)的階段為復制唯一一個受到調節(jié)的階段為起始階段，起始階段，DNA的甲基化與細菌質膜的的作用可以影響復制的甲基化與細菌質膜的的作用可以影響復制起始的時間起始的時間，DNA復制的發(fā)動與DNA甲基化甲基化和細菌質膜有關。 大腸桿菌復制起點叫ori C，由245bp構成，在ori C中有11個含4bp的回文序列“GATC”，Dam甲基化酶可使該序列中的A第6位N甲基化。 細菌細菌DNA的復制調控發(fā)生在起始階段P422 細菌細菌DNA的復制調控發(fā)生在起始階段oriC 的的11個回文序列個回文序列 半甲基化半甲基化DNA不啟動復制，因為因為oriC與膜

40、結合與膜結合DNA全部復制完并全部復制完并延遲一定時間后，延遲一定時間后，子鏈子鏈DNA被甲基化被甲基化新一輪復制新一輪復制 2. 復制的延伸DNA聚合酶聚合酶IIIDNA聚合酶聚合酶IIIDNA聚合酶聚合酶III引物引物引物引物引物引物前導鏈：前導鏈：DNA旋轉酶，解螺旋酶旋轉酶，解螺旋酶，SSB，DNA聚合酶聚合酶，焦磷酸酶焦磷酸酶 復制的延伸 前導鏈前導鏈 (leading strand):以一條鏈(3 5)為模板時,子代鏈的合成方向是5 3, 由引物酶在原點合成一條短RNA鏈，DNA多聚酶III結合于引物并加接脫氧核糖核苷酸殘基 一旦合成開始,前導鏈的合成便連續(xù)地進行,緊跟著復制叉移動

41、,合成是連續(xù)的. 隨后鏈隨后鏈 (lagging strand): 以另一條親代鏈(5 3)為模板時,子代鏈的合成方向5 3滯后鏈的合成是不連續(xù)的以短的岡崎片斷的形式完成的,每合成一個岡崎片段岡崎片段都需起始一次, 由引物酶合成一個引物引物. 前導鏈前導鏈合成一個引物,滯后鏈滯后鏈則合成許多岡崎片段的引物。在同一復制叉上，引物的合成前導鏈早于滯后鏈前導鏈早于滯后鏈。引物引物 是短鏈RNA。（體外為PCR中DNA) 長度一般：原核生物, 10-60 bp（長） 真核生物, 2-10 bp(哺乳動物) 前導鏈引物長于長于滯后鏈岡崎片段引物 合成方向是53方向。 提供的3-OH，可在DNA-pol催

42、化下，利用dNTP 生成磷酸二酯鍵。后隨鏈的模板在全酶上繞轉180.形成一個小環(huán) 原核同一個同一個DNA聚合酶III以二聚體形式在同一時間分別進行復制DNA前導鏈和滯后鏈。引發(fā)體引發(fā)體(primosome)與引物合成與引物合成 解鏈酶 Dna B有兩個功能,其一是解螺旋酶解螺旋酶;另一是活化引物合成酶（Dna G）,與Dna G引物合成酶構成一個基本功能單位,稱為引發(fā)體引發(fā)體（Dna B+ Dna G），合成引物。在某些噬菌體DNA的復制過程中,引發(fā)體還包括一些輔助蛋白。P423DNA復制的延伸復制的延伸 引發(fā)體引發(fā)體方向移動（與引物或岡崎片段合成的方向正好相反相反，而與復制叉移動的復制叉移動

43、的方向相同方向相同），移到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成岡崎片段的連接 岡崎片段的連接岡崎片段的連接: 在DNA聚合酶聚合酶的催化下, 除去RNA引物, 同時催化DNA片段繼續(xù)延長至另一DNA片段的5端，后在連接酶的催化下連接成完整的DNA 分子。 123岡崎片段的連接岡崎片段的連接切口平移DNA 連接連接酶酶 DNApol IDNApol III DNApol III DNApol IDNA 連接連接酶酶DNA切口平移所用的酶為（ ）。 A、Klenow酶， B、Taq酶， C、DNA聚合酶I D、DNA連接酶Nick Translation（自學）切口平移中國科學院中國科學院0606年

44、年 拓撲異構酶拓撲異構酶細菌領頭鏈和細菌領頭鏈和隨從鏈的延長差異隨從鏈的延長差異前導鏈：前導鏈：DNA旋轉酶，旋轉酶，解螺旋酶解螺旋酶，SSB，DNA聚合聚合酶酶，焦磷酸酶焦磷酸酶細菌領頭鏈和隨從鏈的延長差異 前導鏈前導鏈 滯后鏈滯后鏈 前 體dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTPNTP: ATP, GTP, CTP, UTP 酶DNA旋轉酶，解螺旋酶，單鏈DNA結合蛋白（SSB），DNA聚合酶，焦磷酸酶DNA旋轉酶，解螺旋酶，單鏈DNA結合蛋白（SSB），DNA聚合酶，焦磷酸酶，引物酶引物酶，DNA聚合酶，DNA連接

45、酶和連接酶和NAD+復制延伸過程中的各種原料、酶或蛋白質因子) 復制體(replisome) 復制體：復制體：是在復制叉附近與DNA復制有關的酶和蛋白質因子，他們在復制叉上形成離散的復合物,彼此配合,進行高度精確的復制,這種結構稱為復制體 (DNA pol二聚體、引發(fā)體和DnaB等)復制體的基本活動包括：復制體的基本活動包括：1）雙鏈的解開；2）RNA引物的合成；3）DNA鏈的延長；4）切除RNA引物，填補 缺口，連接DNA片段；5）切除和修復錯配堿基。P4213. E. coli DNA合成的終止 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個終止區(qū)域終止區(qū)域 （terE,D,A 和ter C,B,F）， 位

46、于相遇點的另一側位于相遇點的另一側100Kb 處。每一終止順序對某一方處。每一終止順序對某一方 向移動的復制叉來說是特異的向移動的復制叉來說是特異的。 終止需要終止需要Tus(36kD)， Tus能識別ter保守順序， 并阻止復制叉繼續(xù)前進。 ter-Tus復合物可能通過 抑制螺旋酶螺旋酶來實行終止E. coli DNA合成的終止合成的終止 The two newly synthesized circular chromosomal DNAs are topologically interlinked (catenated) and is finally separated by theact

47、ion of a Type II opoisomerases. 最后還有最后還有50-100bp通過修復方式填補通過修復方式填補拓撲異構酶拓撲異構酶( termination)思考題1. 在DNA復制過程中，兩條新鏈的合成為何一條鏈是連續(xù)復制，另一條鏈是間斷復制？并比較兩條新鏈合成過程的不同點。 天津醫(yī)科大學2006生物化學2. 簡述參與DNA復制的酶及基本過程 復旦大學2003年考研生物化學3. 細胞DNA復制是半不連續(xù)的，這是因為： A. DNA 聚合酶只能從35 合成DNA鏈 B. 模版雙鏈是反平行的 C. DNA 聚合酶只能一個一個地加接核苷酸殘基 D. DNA 酶法合成是個自發(fā)過程

48、南開大學2006年生物化學 思考題 4. 以下哪個過程不需要以下哪個過程不需要DNA連接酶連接酶? ? (A) DNA復制 (B) DNA修復 (C) DNA重組 (D) 制備重組DNA (E) DNA修飾。 5 需要以需要以RNA為引物的是為引物的是: : (A) DNA復制 (B) RNA轉錄 (C) 轉錄 (D) 蛋自質合成 (E) RNA復制 華東師范大學2006生物化學考研 6. 敘述DNA聚合酶I在大腸桿菌細胞DNA復制中的功能，并 介紹這個酶在生物技術中的應用。 南開大學2006年生物化學 7. 原核生物DNA復制的過程 中國農(nóng)業(yè)大學2011年生物化學思考題8. 關于關于DNA復

49、制的敘述哪一項論述是錯誤的復制的敘述哪一項論述是錯誤的? ? ( ) A有DNA指導的RNA聚酶參加，B有RNA指導的DNA聚合酶參加，C. 為半保留復制 D. 有DNA指導的DNA聚合酶參加 山東大學2001生物化學9. 在一個復制叉之中，以下哪一種蛋白質的數(shù)量最多在一個復制叉之中，以下哪一種蛋白質的數(shù)量最多?( ) （A）DNA聚合酶 （B）引發(fā)酶 （C）SSB （D）DNA解鏈酶 （E） DNA拓撲異構酶 華東師范大學2007年 思考題思考題10、打開打開DNA超螺旋的酶或蛋白質是（超螺旋的酶或蛋白質是（ ） A、DNA解螺旋酶 B、單連結合蛋白 C、DNA旋轉酶 D、DNA聚合酶1 E

50、、DNA聚合酶2 蘇州大學蘇州大學20062006年年11、DNA 連接酶連接酶 在下列那一過程中不需要在下列那一過程中不需要？A、 DNA復制 B、 制備重組DNA C、 DNA 修復 D 、DNA斷裂 廈門大學廈門大學20112011年年12、 山東大學山東大學2015 名詞解釋名詞解釋: 滾環(huán)復制 判斷：判斷： 1）.大腸桿菌DNA聚合酶I具 5-3外切酶活性，也可以RNA 為底物。 2）. 基因組DNA復制，先導鏈引物為DNA，后隨鏈引物為 RNA。 3）. 因所有的DNA聚合酶都按5-3催化鏈延長，因此推測必定存在一種未發(fā)現(xiàn)的酶能 按3-5催化復制叉上第二條鏈使之延長。思考題 思考題

51、思考題13、大腸桿菌大腸桿菌DNA復制和體外酶促擴增復制和體外酶促擴增DNA的比較。的比較。中國藥科大學中國藥科大學201320132.、為什么說DNA復制以5-3為模板的是半不連續(xù)復制，它如何完成復制過程。2015考研考研827生化回憶版生化回憶版_天津大學天津大學五五 真核生物真核生物DNA復制復制P424 真核生物染色質的基本單位：核小體，核小體真核生物染色質的基本單位：核小體，核小體DNA長長度度200bp左右，真核生物岡崎片段較短的長度左右，真核生物岡崎片段較短的長度200bp左右，左右，相當于一個核小體相當于一個核小體DNA長度長度多起點復制，酵母復制起點多起點復制，酵母復制起點A

52、RS真核生物真核生物DNA復制與原核生物復制與原核生物DNA復制的差異復制的差異(1). 真核生物復制慢真核生物復制慢：原核細胞DNA復制叉移動速度快，細菌復制叉移動速度為50000bp/min，哺乳動物DNA復制叉移動速度慢,約為10003000bp/min。(2). 真核細胞含多個復制子真核細胞含多個復制子，多個復制起點。人平均每個染色體上有1000個復制子，原核細胞DNA中多數(shù)只有一個復制子。(3). 真核細胞的復制子在每個細胞周期僅復制一次真核細胞的復制子在每個細胞周期僅復制一次，原核細胞在快速生長時，在DNA復制起點可連續(xù)復制多次，(4). 引物和岡崎片段較短引物和岡崎片段較短 (5

53、). 連接酶需連接酶需ATP (6). 端粒的復制端粒的復制 (7). 聚合酶和蛋白質因子不同聚合酶和蛋白質因子不同。真核細胞DNA與組蛋白結合成核小體，原核細胞DNA不存在核小體。P425（1）. Semi-conservative replication（2）. Semi-discontinuous repliction（3）. DNA helicase（4）. RNA priming (5). 校對校對（Proofreading） (6). 單鏈結合蛋白單鏈結合蛋白真核生物真核生物DNA復制與原核生物復制與原核生物DNA復制的相同點復制的相同點2.原核生物與真核生物復制的差異2015年東

54、北師范大學（851）生物化學 真核生物的五種DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol 類似類似原核生物原核生物DnaG, primase德爾塔德爾塔伊普西龍伊普西龍在核酸酶切在核酸酶切去引物后，去引物后，補引物缺口補引物缺口合成引物：合成引物：RNA+DNA主要的主要的復制酶復制酶 真核生物的五種DNA聚合酶(1) DNA-pol （核內）: 起始引發(fā)，有引物酶引物酶活性。 （DNA-pol+ primase形成緊密的復合物）(2) DNA-pol （核內）: 參與低保真度的復制 。(3) DNA-pol （德爾塔德爾塔）（核內）:延長子鏈的主要酶主要酶，有持 續(xù)合成DNA鏈的活性又有校讀功

55、能,和組織相容抗原 PCNA)相互作用。(4) DNA-pol （伊普西龍）（核內）:修復損傷DNA 和填補引填補引 物空隙物空隙的功能的功能。(5) DNA-pol （線粒體內）:在線粒體DNA復制中起作用。 DNA復制的起始復制的起始起始起始DNA德爾塔德爾塔 真核生物DNA復制的過程1、DNA Pol 形成引物（RNA + DNA）2、兩個DNA Pol （德爾塔德爾塔）或一個DNA Pol 與一個DNA-pol （伊普西龍）在引物后延長DNA3、RNaseH1和FEN1(MF-1)蛋白切除岡崎片段RNA引物的4. DNA聚合酶填補缺口，類似細菌-DNA-pol5. DNA連接酶進行連接

56、反應，需要ATP供能。DNA-pol （德爾塔德爾塔）（核內）:延長子鏈的主要酶主要酶起作用。伊普西龍伊普西龍真核生物引物的切除和補缺口FEN1又寫為MF-1 pol (伊普西龍伊普西龍)真核和原核細胞的DNA復制比較 功能功能 E.coli 人人 復制酶復制酶 Pol的的 全酶全酶 Pol 進行性因子進行性因子 夾子夾子 PCNA 定位因子定位因子 復合體復合體 RF-C SSB 引物酶引物酶 DnaG Pol -引發(fā)酶引發(fā)酶 去除引物的酶去除引物的酶 DNA聚合酶聚合酶1 RNaseH1和和MF-1 后隨連修復酶后隨連修復酶 DNA聚合酶聚合酶1和和 DNA聚合酶聚合酶 DNA連接酶連接酶

57、 DNA連接酶連接酶 1 解旋酶解旋酶 DnaB T抗原抗原 消除拓撲張力酶消除拓撲張力酶 旋轉酶旋轉酶 拓撲異構酶拓撲異構酶 單鏈結合蛋白單鏈結合蛋白 SSB RP-A 起始蛋白起始蛋白 DnaA T抗原抗原注：MF-1又寫為FEN1P426環(huán)狀環(huán)狀DNA 大腸桿菌能否完整復制真核生物鏈狀染色體？線狀線狀DNA: 滯后鏈復制不完整5端 DNA復制的末端復制的末端端粒和端粒酶端粒和端粒酶 端粒是存在于真核細胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質復合體。端粒由成百個6個核苷酸的重復序列所組成（人TTAGGG，四膜蟲為TTGGGG），富含G。端粒也被科學家稱作“生命時鐘”。 端粒和端粒酶端粒和端粒

58、酶 人類端粒酶含三部分人類端粒酶含三部分： （端粒酶端粒酶RNA） 、（端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白）、（端粒酶端粒酶逆轉逆轉錄酶）錄酶），除骨髓干細胞、胚胎原始干細胞等細胞外, 大多數(shù)正常人體細胞正常人體細胞失去端粒酶活性失去端粒酶活性。惡性腫瘤細胞中, 85%90%端粒酶強陽性。端粒酶強陽性。端粒酶可作為腫瘤標志和腫瘤治療靶點端粒酶可作為腫瘤標志和腫瘤治療靶點. . 原核生物沒有端粒酶原核生物沒有端粒酶端粒酶(telomerase):是一種反轉錄酶, 修補端粒序列 由由RNA（做模版）（做模版）和蛋和蛋白質白質（逆轉錄酶）（逆轉錄酶）構成的一構成的一種核糖核蛋白復合體，維持種核糖核蛋白復合

59、體，維持端粒的長度。端粒的長度。 端端 粒粒 酶酶端粒的形成端粒的形成六、 DNA復制的忠實性機制（補充補充） DNA復制的差錯率只有復制的差錯率只有10-810-101. DNA聚合酶的選擇作用選擇作用（根據(jù)堿基配對規(guī)律，但堿基有烯 醇式和酮式兩種構象）(104-105)2. DNA聚合酶本身具有校正功能校正功能(35外切酶活性)(102-103) 加入錯配堿基后合成速率下降，為校對修復留出時間：動力學校對3. 細胞內有錯配修復等損傷修復系統(tǒng)損傷修復系統(tǒng)4. 細胞維持dNTP的平衡水平的平衡水平；5. RNA作為合成引物（起始合成時易出錯）；前導鏈和滯后鏈的忠實性程度往往不同DNA復制時，新

60、鏈合成都遵循堿基配對原則！(102-103)1. 哪些機制保證了DNA復制的準確性？為什么生物體內轉錄的準確性沒有DNA復制準確性高？ 中國農(nóng)業(yè)大學2012年生物化學2、判斷：判斷：與原核生物不同，幾乎所有的真核細胞都發(fā)現(xiàn)有 端聚酶。2013年中山大學3. 端粒酶是：端粒酶是：A、限制性內切酶 B、DNA聚合酶 C、RNA聚合酶 D、肽酰基轉移酶 廈門大學廈門大學20112011年招年招思考題思考題南開大學20102011年中國海洋大學年中國海洋大學6. 判斷：所有的岡崎片段都是從5-3方向合成，在3端延長。 廈門大學廈門大學20112011年招年招7、下列與DNA解鏈無關的是？ A、單鏈DN