環(huán)境毒理學(xué)常用實驗方法總結(jié)

1、環(huán)境毒理學(xué)常用實驗方法急性毒性實驗蓄積性毒性實驗亞慢性和慢性毒性實驗致突變試驗致畸試驗致癌試驗 毒理學(xué) 實驗基礎(chǔ) 實驗動物（laboratory animal） 經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物。 溫血動物(恒溫動物) 兔、豚鼠、大鼠、小鼠 有時也用猴、狗、貓等實驗動物的選擇狗 小鼠 大鼠 豚鼠 倉鼠 實驗動物的選擇種屬的選擇 個體選擇 年齡 體重 性別 生理狀態(tài) 健康狀況 實驗動物的選擇種屬的選擇 機體反應(yīng)上盡量近似于人體； 易獲得、易飼養(yǎng)、易管理； 最敏感、最合適； 選用幾種不同種屬的動物(對毒作用不清楚的化學(xué)物質(zhì))； 借助已有毒理學(xué)研究資料

2、選擇。 實驗動物的選擇借助已有毒理學(xué)研究資料選擇 氣體、蒸氣對粘膜的刺激作用貓 毒物對皮膚的局部作用豚鼠或兔(皮膚對刺激物的反應(yīng)近似于人) 過敏性反應(yīng)豚鼠(易于致敏) 觀察致嘔吐作用的實驗研究狗、貓 外界環(huán)境因素引起機體體溫過高及體溫過低的反應(yīng)兔或貓(大鼠、小鼠對于體溫調(diào)節(jié)不穩(wěn)定) 高血壓病理狗、兔、大鼠(易出現(xiàn)血壓變化) 物質(zhì)的致癌作用小鼠和大鼠 慢性中毒損害實質(zhì)性臟器的毒物小鼠(實質(zhì)性臟器容易罹患病變) 個體選擇 年齡 除特殊要求外，動物年齡一般選用初成年者。性別 根據(jù)目的，若對動物性別無特殊要求，宜選用雌雄各半。生理狀態(tài)懷孕、哺乳 通常實驗均不宜采用處于特殊生理狀態(tài)的動物進(jìn)行，為了某種特

3、定的實驗?zāi)康某?。健康狀況 所用動物進(jìn)入實驗室后，于實驗開始前應(yīng)觀察一周以上，以刪除不健康的動物，并使實驗動物適應(yīng)環(huán)境。 實驗動物的選擇常用染毒途徑和方式 (1）經(jīng)口 灌胃、喂飼、吞咽膠囊 （2）經(jīng)呼吸道 動物自行吸收（靜式吸入染毒、 動式吸入染毒） 人工動物氣管注入（3）經(jīng)皮膚（4）其它途徑 注射途徑 常用染毒途徑和方式(1) 經(jīng)口染毒 灌胃 用灌胃器將所應(yīng)投給動物的藥灌到動物胃內(nèi)； 直接灌入胃內(nèi)，不與口腔及食道接觸； 給予的化學(xué)物劑量準(zhǔn)確。 喂飼 將化學(xué)物溶于無害的溶液中拌入飼料或飲用水中，使動物自行攝入含化學(xué)物的飼料或水，然后依每日食入的飼料與水再推算動物實際攝入化學(xué)物的劑量。 常用染毒

4、途徑和方式(1) 經(jīng)口染毒 優(yōu)點：接觸化學(xué)物的方式符合人類接觸污染食物與水的方式，方法簡便、易操作。 缺點 進(jìn)食時浪費、損失飼料多，攝入的量不準(zhǔn)確； 如果化學(xué)物有異味，動物可能拒食； 如果化學(xué)物在室溫下可以揮發(fā)，或在飼料中和水中可以水解，則劑量也不準(zhǔn)確； 有經(jīng)呼吸道與皮膚交叉吸收的可能； 更適宜進(jìn)行多日染毒，急性毒性試驗一般不用之。 (1)經(jīng)口染毒 吞咽膠囊 將所需劑量的受試化學(xué)物裝入藥用膠囊內(nèi)，強制放到動物的舌后咽部迫使其咽下。 此法劑量準(zhǔn)確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解和有異臭的化學(xué)物。 兔、貓及狗等較大動物可用此法。 常用染毒途徑和方式（2）經(jīng)呼吸道染毒 凡是氣態(tài)或易揮發(fā)的液態(tài)化學(xué)物均有經(jīng)呼

5、吸道吸入的可能，在生產(chǎn)過程中形成氣溶膠的化學(xué)物也可經(jīng)呼吸道吸入。 類型: 動物自行吸收 靜式吸入染毒 動式吸入染毒 人工動物氣管注入 人工動物氣管注入將液態(tài)或固態(tài)外源化學(xué)物注入肺內(nèi)。這是一個手術(shù)過程，僅適用于制造化學(xué)物對肺臟損傷模型的制備，而不用于一般毒性研究。 常用染毒途徑和方式靜式吸入染毒 在一定容積的染毒柜內(nèi)加入一定量受試物，造成含一定濃度受試物的空氣環(huán)境，使受試動物在規(guī)定時間內(nèi), 經(jīng)吸入而達(dá)到染毒，適用于短時間染毒的試驗。 動式吸入染毒 采用機械通風(fēng)為動力，連續(xù)不斷地將含有已知濃度受試物的新鮮空氣送入染毒柜內(nèi)，并排出等量的污染氣體，使染毒濃度保持相對穩(wěn)定，這樣可使染毒時間不受染毒柜(室

6、)容積的限制，也可避免動物缺氧、CO2積聚、溫度增加等對試驗結(jié)果的可能影響，適用于較長時間以及反復(fù)染毒的試驗使用。常用染毒途徑和方式（3）經(jīng)皮膚染毒 液態(tài)、氣態(tài)和粉塵狀外源化學(xué)物均有接觸皮膚的機會。 能經(jīng)皮膚吸收的化學(xué)物主要以擴散方式經(jīng)過皮膚角質(zhì)層屏障，在表皮角質(zhì)細(xì)胞的間質(zhì)中充滿非極性的脂類物質(zhì)。脂溶性化學(xué)物主要通過這種途徑滲透入皮膚，角質(zhì)層薄的皮膚部位更易吸收。常用染毒途徑和方式實驗前詳細(xì)檢查去毛部位皮膚有無擦傷、紅腫、皮疹等異?，F(xiàn)象，剔除不合格動物。染毒時按單位體重確定給予所需毒劑的容量。接觸時間應(yīng)與人實際接觸該物質(zhì)的時間相仿。常用染毒途徑和方式成年動物年老動物表皮厚度、細(xì)胞成分改變?yōu)楸ＷC

7、不因皮膚部位不同而形成的化學(xué)物滲透率差異，一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮膚。面積則依據(jù)選用動物及受試物的劑量和劑型而定。（如家兔可取5cm6cm、豚鼠取3cm4cm、大鼠取1.5cm2.0cm直徑的面積，小鼠取1.0cm1.5cm直徑的面積。）（3）經(jīng)皮膚染毒（4）其它途徑染毒 有時需對外源化學(xué)物進(jìn)行絕對毒性或比較毒性研究，或進(jìn)行一些必要的特殊研究(如靜脈注射毒物動力學(xué)、代謝研究、急救藥物篩選等)，往往用注射途徑染毒。 靜脈注射:大鼠、小鼠尾靜脈，兔耳緣靜脈 注射途徑 肌肉注射 皮下注射 腹腔注射:小動物常用染毒途徑和方式動物實驗的一般操作方法急性毒性試驗一、急性毒性的概念 急性毒性是指機體(

8、人或?qū)嶒瀯游?一次或24h之內(nèi)多次接觸(染毒)外源化學(xué)物之后，在短期內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括引起死亡效應(yīng)。 一次：瞬間染毒，如經(jīng)口染毒、經(jīng)注射途徑染毒，但在經(jīng)呼吸道與經(jīng)皮膚染毒，則是指在一個特定的期間內(nèi)持續(xù)地接觸化學(xué)物的過程，“一次”含有時間因素。 多次：當(dāng)外源化學(xué)物毒性過低，或一次染毒劑量受機體容量限制，需給予實驗動物較大劑量時，則可在24h內(nèi)分次染毒。 二、急性毒性試驗的目的 探求化學(xué)物的致死劑量，以初步評估其對人類的可能毒害的危險性； 求該化學(xué)物的劑量-反應(yīng)關(guān)系，為其它毒性實驗打下選擇染毒劑量的基礎(chǔ)。表示急性毒性大?。篖D50急性毒性試驗三、急性毒性試驗的內(nèi)容（1）急性毒性測定 確定一次

9、染毒的 LD50或LC50；（2）經(jīng)皮膚染毒實驗 考察受檢化學(xué)物質(zhì)能否經(jīng)皮膚進(jìn)入體內(nèi)，LD50；（3）局部作用實驗 通過使受檢化學(xué)物質(zhì)直接接觸皮膚及眼結(jié)膜等試驗，研究其對生物體局部有無刺激、腐蝕及其他危害作用。急性毒性試驗三、急性毒性試驗的內(nèi)容（4）中毒癥狀的觀察 據(jù)染毒動物癥狀及體征，粗略了解毒物作用的程度和可能作用部位。（5）功能及病理組織學(xué)檢查 選擇必要的功能指標(biāo)，尋求毒作用劑量與功能改變的關(guān)系，確定急性閾劑量； 通過病理組織學(xué)檢查，進(jìn)一步了解毒作用部位及毒害程度。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（一）半數(shù)致死量(LD50、LC50)的測定1.動物準(zhǔn)備一般采用小動物，如小鼠、大鼠、

10、豚鼠等。實驗動物應(yīng)預(yù)先觀察7天左右，以了解其健康情況及正常活動狀態(tài)。正式實驗時，按隨機分組原則分組，一般分成56個實驗組(必要時備對照組)，每組510只動物(小鼠多用10只)。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（一）半數(shù)致死量(LD50、LC50)的測定2.劑量選擇先查閱文獻(xiàn)中與受試物的類似物L(fēng)D50或LC50；以3倍之差的三個劑量組進(jìn)行預(yù)實驗，每組3只動物，求出動物全活、全死劑量；在預(yù)試驗的全活全死劑量之間設(shè)56個劑量組，各組間劑量差距常按等比級數(shù)1.21.5設(shè)計。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（一）半數(shù)致死量(LD50、LC50)的測定3.藥液配制及染毒給藥的劑型溶解性水溶液、

11、混懸液、油劑或乳劑在非吸入染毒實驗中，多按單位體重給予等容量藥液的方法給藥，可以保證不同劑量組動物接受相同容量的藥液。如配制實驗用液中用到新溶劑、新助劑，或?qū)嶒灲K結(jié)時需作病理組織學(xué)觀察時，則應(yīng)有對照組。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（一）半數(shù)致死量(LD50、LC50)的測定4.癥狀觀察染毒開始后應(yīng)觀察并記錄實驗動物的中毒表現(xiàn)、生理狀況變化和死亡情況。觀察時間可確定為幾小時、幾天、一周或兩周，但一般不超過二周（二周內(nèi)）。急性毒性試驗急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（一）半數(shù)致死量(LD50、LC50)的測定5.病理學(xué)檢查觀察器官是否有血、出血、水腫或其他變化，并對有變化的臟器作病

12、理組織學(xué)檢查。對存活動物在觀察期滿后也應(yīng)做病理學(xué)檢查。6.結(jié)果評價計算半致死劑量或濃度：確定絕對致死劑量或濃度、最小致死劑量或濃度和最大耐受劑量或濃度。急性毒性進(jìn)行評定：與同系物或其他毒物比較，與毒性分級比較分析。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（二）急性閾劑量的測定 急性閾劑量指毒物經(jīng)一次染毒后對機體產(chǎn)生不良作用的最小劑量，是用于評價毒物非致死性損害的參數(shù)。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（二）急性閾劑量的測定 1.觀察指標(biāo)的選擇 應(yīng)根據(jù)毒物和實驗動物的特性采用不同的生理、生化及形態(tài)學(xué)的指標(biāo)。 （1）對于新化學(xué)物質(zhì)，首先選用整體狀態(tài)及非特異性作用指標(biāo)，如活動能力、應(yīng)激狀態(tài)、條件反

13、射等。 （2）對于毒作用特點比較清楚的毒物，可選擇該毒物作用引起最敏感反應(yīng)指標(biāo)，如有機磷農(nóng)藥可選膽堿酯酶活性變化。 （3）對于刺激性氣體和蒸氣，可測定其刺激閾濃度或嗅覺閾濃度。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（二）急性閾劑量的測定 2.實驗方法（1）游泳試驗主要是通過觀察動物的活動能力，揭示不同劑量的毒物對機體體力影響的程度，是研究閾劑量(或濃度)的常用指標(biāo)。實驗動物一般用小鼠或大鼠。記錄每只動物自放入水中至口鼻沉沒到水下5秒鐘的時間，即游泳時間。在游泳過程中記錄游泳速度、運動姿勢等。比較染毒組與對照組游泳時間和速度以及游泳姿勢上的差異并進(jìn)行評價。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（

14、二）急性閾劑量的測定 2.實驗方法（2）刺激閾試驗刺激性氣體或蒸汽，對上呼吸道、眼睛和口腔等器官的黏膜會產(chǎn)生局部刺激作用，通過觀察毒物在不同濃度下引起的刺激癥狀，可找出毒物引起刺激癥狀的最低濃度，即閾濃度。實驗動物多用貓。觀察指標(biāo)除一般刺激癥狀，如流淚、流涕、等以外，主要觀察動物的流涎出現(xiàn)的時間及嚴(yán)重程度。將50以上動物出現(xiàn)“有少量唾液流到口唇周圍”以上程度的刺激癥狀的最小濃度作為閾濃度。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（三）局部作用試驗 用于研究一些化學(xué)物質(zhì)引起接觸的皮膚和黏膜的癥狀，如炎癥和燒傷。 1.急性皮膚刺激/腐蝕試驗為了確定化學(xué)物質(zhì)對哺乳動物的皮膚是否具有刺激或腐蝕作用。選用

15、白色豚鼠或家兔作為實驗動物。觀察涂抹部位的皮膚反應(yīng)，對刺激作用給予全面完整的評價。急性毒性試驗四、哺乳動物的急性毒性實驗（三）局部作用試驗 2.急性眼睛刺激/腐蝕試驗結(jié)膜囊染毒試驗。試驗常選用家兔或豚鼠為實驗動物。將受試化學(xué)物0.1mL滴人一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，用手將眼瞼壓住，使閉眼幾秒鐘，另一側(cè)眼滴生理鹽水作對照。記錄滴藥后1h、12h、24h、48h、72h和96h的局部反應(yīng)，如充血、水腫、流淚、怕光、角膜、結(jié)膜和眼球損害的程度以及恢復(fù)的時間等。以規(guī)定的間隔時間觀察刺激或腐蝕作用的程度，同時作進(jìn)一步描述以便對刺激作用給予全面、完整的評價。急性毒性試驗五、水生動物毒性實驗 一些水生生物對水質(zhì)變化很

16、敏感，反應(yīng)顯著。因此，在環(huán)境毒理實驗中常用水生生物作為實驗動物，特別在制訂污水排放標(biāo)準(zhǔn)時，常進(jìn)行水生生物的急性毒性實驗。 魚類、甲殼動物、藻類毒性實驗等方法。急性毒性試驗魚類毒性實驗1. 實驗用魚的選擇必須具有一定區(qū)域代表性，便于在實驗條件下飼養(yǎng)，對化學(xué)物質(zhì)較為敏感。短期試驗多采用我國的青、草、鰱、鳙四大養(yǎng)殖淡水魚，一般體長機體消除速度不斷累積毒性作用閾劑量蓄積毒性實驗蓄積毒性作用 環(huán)境污染物在體內(nèi)的蓄積作用的過程，表現(xiàn)為：物質(zhì)蓄積：污染物不斷進(jìn)入機體，其吸收量排出量，以致在體內(nèi)的貯留量增多；功能蓄積：不斷進(jìn)入機體內(nèi)的環(huán)境污染物，反復(fù)作用機體，引起機體一定結(jié)構(gòu)或功能的變化，并逐漸累積加重，最后

17、導(dǎo)致出現(xiàn)損害作用。相對的區(qū)分，同時存在，互為基礎(chǔ)蓄積毒性實驗蓄積毒性作用環(huán)境污染物在體內(nèi)的蓄積作用，是引起亞慢性和慢性毒性作用的基礎(chǔ)。常是評估環(huán)境污染物毒性作用的指標(biāo)之一；制定其在環(huán)境中的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的重要參考依據(jù)。闡明污染物有無蓄積作用及其程度有重要意義。蓄積毒性實驗一、試驗方法（一）蓄積系數(shù)法 固定劑量每天連續(xù)染毒法 劑量定期遞增染毒法（二）20天蓄積試驗法（三）生物半減期法一、試驗方法（一）蓄積系數(shù)法（cumulative coefficient method） 分次給受試物后引起50%受試動物出現(xiàn)某種毒效應(yīng)的總劑量（LD50(n)表示）與一次給受試物后引起50%受試動物出現(xiàn)同一毒效應(yīng)的劑量

18、（以LD50(1)表示）的比值，即蓄積毒性實驗蓄積作用強度分級蓄積毒性實驗一、試驗方法（一）蓄積系數(shù)法試驗方法固定劑量每天連續(xù)染毒、劑量定期遞增染毒先按常規(guī)方法測定受試動物的LD50或ED50，此即LD50(1)或ED50(1)；然后另取動物進(jìn)行LD50(n)或ED50(n)的測定。試驗動物通常是大鼠和小鼠。一、試驗方法（一）蓄積系數(shù)法1.固定劑量每天連續(xù)染毒法固定劑量1/10-1/20LD50每天染毒一次觀察死亡情況LD50(n)5個LD50時，若動物死亡數(shù)未超過半數(shù)，K5， 表明蓄積作用不明顯。如果染毒過程中動物相繼死亡，記下受試動物出現(xiàn)半數(shù)死亡時的累計的染毒總劑量，按上述計算蓄積系數(shù)。分

19、次染毒劑量為1/20 LD50時，實驗時間可長達(dá)100天，分次染毒劑量為1/10 LD50時，實驗還可長達(dá)50天。蓄積毒性實驗2、劑量定期遞增染毒法：以4d為一期，開始第一期每天染毒劑量為1/10 LD50，隨后染毒劑量每隔4d按1.5倍遞增一次。 定期遞增染毒劑量*表 (注：表中的遞增染毒劑量*為LD50 ) 染毒日期（天） 每日染毒劑量 每4天染毒總劑量 累計染毒總劑量 14 0.10 0.4 0.4 58 0.15 0.6 1.0 912 0.22 0.9 1.9 1316 0.34 1.4 3.3 1720 0.50 2.0 5.3 如果連續(xù)染毒已達(dá)20d，此時染毒的總劑量已累計達(dá)到5.30倍的LD50，受試動物中出現(xiàn)某種毒性效應(yīng)或死亡的動物數(shù)未達(dá)到50%，則表示該受試物的蓄積毒性不明顯，試驗可以終止。如受試物在試驗過程中，相繼出現(xiàn)的某