異體皮低溫儲存全面研究和臨床應(yīng)用

1、異體皮低溫儲存全面研究和臨床應(yīng)用前 言 皮膚的低溫儲存工作對于臨床燒傷患者的救治起著十分重要的作用 對于大面積深度燒傷病人，其治療是一個漫長而復(fù)雜的過程，尤其是臨床上皮源的匱乏將嚴(yán)重影響病人的治愈率我院皮庫簡介自1973年創(chuàng)建皮庫以來，分別運用了4、 -20和-80低溫冰箱皮膚保存法以及液氮儲皮方法1987年開始速凍玻璃化儲皮方法儲存的實驗研究和臨床應(yīng)用 我院皮庫簡介每年異體尸體皮采集及儲存40余具深低溫速凍異體皮保存方法的改進使保存皮片活力穩(wěn)定保持在70%以上，皮片移植成活率達(dá)95%以上成為亞洲最大的皮庫之一，已儲存了2000余具活力良好的尸體皮，供全國30個省市300多家醫(yī)院使用每年創(chuàng)利潤

2、數(shù)百萬元，經(jīng)濟效益顯著 我院皮庫簡介曾獲國家自然科學(xué)基金，八五、九五、十五全軍科研基金10余項出版相關(guān)專著10余部，發(fā)表學(xué)術(shù)論著100余篇培養(yǎng)進修生、研究生數(shù)百人獲國家科技進步二等獎1項，軍隊科技進步二等獎5項第一部分 皮膚低溫儲存的基礎(chǔ)與進展 皮膚儲存的基礎(chǔ)知識皮膚低溫儲存的理論依據(jù)皮膚的低溫?fù)p傷機制低溫儲存理論依據(jù) 理論上，儲存溫度越低，儲存物活力保持的時間越長，細(xì)胞組織代謝越低，污染的細(xì)菌也不易繁殖 皮膚儲存方法比較項目 4 -20 -80 -196 費用 少 少 較貴 貴（補液氮） 保存時間(d) 3-7 45 12個月 理論無限期 最佳活力(%) 30-80 50-60 50-60

3、70低溫?fù)p傷機制： 低溫保存關(guān)鍵在于解決低溫?fù)p傷對生物組織的影響。經(jīng)典的低溫生物學(xué)認(rèn)為在低溫條件下，細(xì)胞主要受到來自兩種因素的損傷即溶質(zhì)性損傷和胞內(nèi)冰損傷，即“兩因素”學(xué)說?！皟梢蛩亍睂W(xué)說胞內(nèi)冰晶損傷 胞內(nèi)生成冰晶，長大到一定程度，引起細(xì)胞壁及細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是降溫速率較快時引起損傷的主要原因溶質(zhì)性損傷（高滲性損傷） 細(xì)胞外水分結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度的升高并持續(xù)較長的時間。由高滲引起細(xì)胞的損傷，是降溫速率較慢時引起損傷的主要原因“兩因素”學(xué)說皮膚結(jié)構(gòu)與儲存的關(guān)系皮膚不是單細(xì)胞成分，而是由表皮和真皮構(gòu)成的復(fù)合組織，由于皮膚內(nèi)的各種主要細(xì)胞成分的結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜性，各種

4、細(xì)胞代謝與營養(yǎng)條件不同,對環(huán)境改變的適應(yīng)性亦有所不同。因此皮膚的低溫?fù)p傷是一個更為非常復(fù)雜的過程低溫?fù)p傷的干預(yù)：玻璃化儲皮方法的發(fā)展抗凍液的使用玻璃化的基礎(chǔ)知識玻璃化的概念 玻璃化是一個物理學(xué)的概念，是指當(dāng)水或溶液在極快降溫到或低于-100-110的溫度范圍時，形成一種具有高黏度的界于液態(tài)和固態(tài)之間、非晶體態(tài)的、雜亂無章的、透明的玻璃狀態(tài) 玻璃化儲存生物組織和細(xì)胞，由于降溫速率很快，水分沒有足夠的時間來形成冰晶，即進入均勻的玻璃狀態(tài)。這種玻璃態(tài)的物理性能與晶體態(tài)不同，是一種既可以避免或減輕冷凍過程組織的損傷，又是同時可長期保存組織的良好方法玻璃化儲存的特點兩種方法的比較慢降溫速率玻璃化速凍冰晶

5、形成均勻玻璃化狀態(tài) 皮膚在196的深低溫環(huán)境中，其組織和細(xì)胞內(nèi)各種酶的活力及代謝很低甚至近乎零，即所謂的“生命懸持狀態(tài) ”。在此溫度下保存的皮膚理論上可無限期儲存。皮膚的玻璃化儲存理論上說，體積很小的1微升純水要用106-107/s降溫速率才能形成玻璃態(tài)玻璃化的理想條件以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻璃化需要極高的降溫速率。目前只能采用各種方法實現(xiàn)部分玻璃化，抑制冰晶形成和長大，避免細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷皮膚玻璃化儲存的途徑皮膚玻璃化儲存的途徑冷源問題 目前國內(nèi)各家皮庫主要采用液氮作為冷源，溫度可達(dá)-196，皮片直接放入液氮后，其最快的降溫速率可達(dá)2160/min皮膚玻璃化儲存的途徑 儲存的皮膚往往

6、因具有一定的厚度和面積帶來冷源溫度傳導(dǎo)困難和儲存不便 ，因此可設(shè)計成皮卷形式皮膚玻璃化儲存的途徑降溫速率 冷卻的銅板預(yù)冷皮膚后即將其直接浸入液氮 預(yù)冷銅板示意圖抗凍劑的應(yīng)用抗凍液的作用及機制： 深低溫儲存組織離不開抗凍液的保護，否則皮膚將受到嚴(yán)重的損傷 抗凍劑的作用機制有以下兩點：有效抑制過冷水的不規(guī)則形態(tài)及促進快速結(jié)晶，促進玻璃化行程緩沖因冰形成而造成的滲透壓升高，減輕溶質(zhì)損害目前較為成熟抗凍液配方H液（20%二甲基亞砜、6%丙二醇），以此作為玻璃化儲存皮膚的抗凍液 一般情況下，10000cm2面積的皮膚約需抗凍液3000ml 30分鐘6小時內(nèi)皮片新潔爾滅生理鹽水H抗凍液玻璃化儲皮及使用步驟

7、臨床使用液氮復(fù)溫401530皮卷生理鹽水生理鹽水總結(jié)：玻璃化儲存皮膚的步驟異體皮的采集消毒皮膚的修整抗凍液的處理包裝快速降溫液氮容器的管理玻璃化對皮膚結(jié)構(gòu)和功能的影響細(xì)胞膜的影響 降低細(xì)胞的流動性細(xì)胞骨架受損表皮細(xì)胞黏附率降低基底膜的破壞玻璃化對皮膚抗原性影響皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新鮮異體皮長低溫儲存后皮片抗原性降低，可能與皮膚內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞（LS）數(shù)量降低有關(guān)保存溫度越低，抗原性越弱，移植后存活時間越長低溫對朗格漢斯細(xì)胞的影響 新鮮豚鼠皮朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量較多、呈樹突狀輪廓 -196豚鼠皮朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量明顯減少、樹突變短異體皮勻漿免疫擴散電泳圖 右側(cè)為新鮮皮勻漿與抗體形成的沉淀

8、環(huán);左側(cè)為液氮儲存h后與抗體形成的沉淀環(huán)，面積明顯縮小新鮮組玻璃化組異體皮勻漿免疫火箭電泳圖上圖為新鮮皮勻漿電泳結(jié)果;下圖為液氮儲存48h后皮片勻漿電泳結(jié)果玻璃化組新鮮組皮膚活力的鑒定常用的皮膚活力的鑒定方法皮膚氧耗量測定法琥珀酸鈉脫氫酶測定法四氮唑鹽WST-1法SYTO/EB雙重染色法皮膚氧耗量測定法 原理：有活力的組織均有代謝耗氧。 恒溫營養(yǎng)液內(nèi)微電極（鉑、銀電極）與有活力的皮膚接觸，表面氧分壓下降，通過放大器測下降程度，推算出皮膚的活力，操作可在1h內(nèi)完成我院自行設(shè)計的測氧儀外觀琥珀酸脫氫酶測定法測定原理琥珀酸鈉+紅四氮唑 延胡索酸+甲琥珀酸脫氫酶H+月替琥珀酸脫氫酶測定法示意圖 皮片氮

9、氣琥珀酸鈉+紅四氮唑37水浴1h乙二醇乙醚皮片OD490um/mg（活力單位）四氮唑鹽WST-1法 原理:利用活組織或細(xì)胞中的線粒體琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系(RS) ,作用在亞細(xì)胞呼吸鏈反應(yīng)中的還原型輔酶 (NADH)、NAD +(輔酶) 脫氫反應(yīng)與細(xì)胞組織中的呼吸鏈EC(電子偶聯(lián)反應(yīng)體系) 結(jié)合,將H 結(jié)合到WST-1 的甲氮唑苯環(huán)上,打開其四氮唑苯環(huán)而顯色。 四氮唑鹽WST-1法琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系(RS)琥珀酸脫氫酶H+呼吸鏈WST-1顯色反應(yīng)SYTO/EB雙重染色法為一種敏感、快速的皮膚活力檢測法,采用新型穿透性核酸染色劑SYTO和EB 。方法：皮片經(jīng)PBS洗滌后加入SYTO 50ul,3

10、7避光孵育30， PBS洗滌加入50ulEB,水浴避光孵育30 后PBS洗滌。通過488/520nm激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察。玻璃化對皮膚活力的影響 通過對氧耗量及琥珀酸脫氫酶活力的測定發(fā)現(xiàn)玻璃化儲存的皮膚活力較慢凍法提高了將近20%速凍玻璃化儲皮的優(yōu)點及效果：該法可以永久保存皮膚，儲存后冷凍皮片的平均活力指標(biāo)可達(dá)到新鮮皮片的70 %，較以往的慢速冷凍法提高活力近20 %采用該法保存的皮膚臨床具有質(zhì)地柔軟、植皮后轉(zhuǎn)紅快、成活率高（95%左右）、存活期長等優(yōu)點皮膚低溫儲存的基礎(chǔ)研究進展皮膚細(xì)胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白、層粘連蛋白等）、骨架蛋白（微絲、微管、中間絲）以及細(xì)胞間連接橋粒結(jié)構(gòu)可能是低溫?fù)p傷

11、的關(guān)鍵位點新型抗凍劑 海藻糖的發(fā)現(xiàn)，可進一步優(yōu)化低溫抗凍液配方細(xì)胞微環(huán)境略圖黏附連接縫隙連接緊密連接橋粒各種細(xì)胞連接示意圖海藻糖分子結(jié)構(gòu)示意圖FN免疫組化染色結(jié)果 新鮮組-196組-80組4組FN皮膚免疫組化染色 360LN免疫組化染色結(jié)果 新鮮組-196組4組-80組LN皮膚免疫組化染色 360 低溫儲存對皮膚表皮FN和LN含量的影響（平均積分光密度， XSD，n=10）標(biāo)本組別FNLN新鮮皮膚144.143.6156.540.7 -196組121.338.4127.837.3 -80組68.917.9*85.916.4* -20組31.48.7*54.89.3* 4組22.84.6*22.

12、47.6* 與新鮮皮片組相比，E-cadherin免疫組化染色結(jié)果 新鮮組4組-80組-196組E-cadherin皮膚免疫組化染色 360-catenin免疫組化染色結(jié)果 新鮮組-196組-catenin皮膚免疫組化染色 360 4組-80組低溫儲存對皮膚表皮E-cadherin和-catenin含量的影響 （平均積分光密度,XSD，n=10）* 與新鮮皮片組相比，標(biāo)本組別E-cadherin-catenin新鮮皮膚76.618.5100.223.9-196組61.823.487.817.3-80組 23.911.4 * 65.918.4 *-20組24.48.7 *34.89.3 *4組1

13、8.85.6 *22.47.6 * 新鮮皮膚表皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，胞核圓形或橢圓形，196皮膚結(jié)構(gòu)基本正常，有少量胞質(zhì)水腫，淡染，胞核縮小。 (HE400) 低溫冷凍對皮膚組織-肌動蛋白表達(dá)的影響新鮮組196組 新鮮皮膚組織-actin主要分布于細(xì)胞質(zhì)，顏色均勻分布,陽性反應(yīng)強，196組陽性反應(yīng)減弱，但結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)染色基本呈紅色 。(SP200) 新鮮組196組低溫冷凍對皮膚組織-肌動蛋白表達(dá)的影響透射電鏡下觀察低溫冷凍對皮膚組織微絲的影響 新鮮組較粗,束狀廣泛均勻分布。-80組大片束狀結(jié)構(gòu)解聚，空隙增大，見斷裂和分叉；4組分布不均，細(xì)絲樣物質(zhì)明顯減少，結(jié)構(gòu)松散，粗細(xì)不等。 -196

14、組分布較廣泛，呈束狀(20K，電鏡） 新鮮 -80 4 -196 新鮮皮膚顏色均勻，陽性反應(yīng)強，T/D組近似，但有少量細(xì)胞質(zhì)水腫，胞核縮小。D/P組呈淡黃色，DMEM組呈陰性反應(yīng)。 （SP200，光鏡） T/DD/PDMEM新鮮海藻糖對低溫保存皮膚后-肌動蛋白的實驗研究透射電鏡下觀察CPA對低溫保存皮膚后微絲的影響 新鮮組束狀廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中，T/D組少量斷裂和分叉，束狀密集分布。D/K組呈簇狀不均勻分布，空隙增大，解聚斷裂；DMEM組大部分已解聚斷裂，無明顯束狀結(jié)構(gòu)。 （25K，電鏡） 新鮮T/DD/KDMEM皮膚1整合素及相關(guān)蛋白免疫組化染色結(jié)果 基質(zhì)蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白關(guān)系模

15、型laminin整合素是一類位于細(xì)胞表面黏附分子，屬跨膜糖蛋白胞外區(qū)與基質(zhì)蛋白相連，胞內(nèi)區(qū)與細(xì)胞骨架相連，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外雙向信息傳遞1整合素位于皮膚基底細(xì)胞表面，維系表皮、真皮之間的連接，對維持細(xì)胞膜完整性及功能起著重要的作用整合素（Integrin）示意圖新鮮組196組-20組4組低溫冷凍對皮膚組織1整合素表達(dá)的影響新鮮正常皮膚組織1integrin分布基底細(xì)胞細(xì)胞膜或胞漿低溫冷凍對皮膚層粘連蛋白laminin表達(dá)的影響新鮮正常皮膚組織laminin表達(dá)在真皮和表皮連接處新鮮組196組20組4組低溫冷凍對皮膚層踝蛋白talin表達(dá)的影響新鮮正常皮膚組織talin分布于基底細(xì)胞新鮮組196組20

16、組4組低溫冷凍對皮膚-輔肌動蛋白表達(dá)的影響各溫度組皮膚組織-actinin表達(dá)新鮮組196組4組80組低溫儲存對皮膚表皮1 integrin、 laminin、 talin含量的影響 （平均積分光密度,XSD，n=10）與新鮮組皮膚組織比較，標(biāo)本組別1 integrinlaminin talin新鮮皮膚0.2560.016 0.2650.016 0.2160.012 -196組0.2450.0210.2470.025 0.1940.013* -80組0.2320.0120.2380.020 0.1790.009* -20組0.1650.015* 0.1760.013* 0.1630.010*4

17、組0.1350.011* 0.1470.015* 0.1520.017* 低溫儲存對皮膚組織基底膜影響新鮮組196組4組 新鮮皮膚基底膜完整、密度正常，連續(xù)性好，半橋粒結(jié)構(gòu)清晰可見，分布均勻； -196組中基底膜結(jié)構(gòu)基本與新鮮組相似； 4組基底膜變薄，出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模糊不清，半橋粒明顯減少海藻糖對低溫保存皮膚1整合素的實驗研究T/D-7d組D/P -7d組T/D-14d組D /P -14d組14天時兩組染色程度均降低，D /P 組染色強度降低較明顯兩種低溫保護劑對皮膚組織1integrin表達(dá)變化影響 （平均積分光密度,XSD，n=6）與新鮮組皮膚比較，*，T/D、D/P組間比較， 組別 7

18、天 14天新鮮組T/D組 D/P組 0.2960.019 0.2960.019 0.2870.015 0.2790.010 0.2840.014 0.2490.018* 橋粒透射電鏡下觀察CPA對低溫保存皮膚基底膜的影響T/D-7d組D /P -7d組T/D-14d組D /P -14d組2周時間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，橋粒芯糖蛋白1、2免疫組化染色結(jié)果 錨著在橋粒斑上的細(xì)胞骨架細(xì)絲胞質(zhì)橋粒斑蛋白細(xì)胞間空隙橋粒芯蛋白相鄰細(xì)胞膜橋粒結(jié)構(gòu)示意圖 新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白1主要分布于顆粒細(xì)胞層，20組，

19、4組陽性反應(yīng)明顯減弱。(SP400) 低溫冷凍對皮膚組織橋粒芯糖蛋白1表達(dá)的影響-20新鮮組-1964 新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白2主要分布于基底細(xì)胞層，20組，4組陽性反應(yīng)明顯減弱。(SP400) 低溫冷凍對皮膚組織橋粒芯糖蛋白2表達(dá)的影響新鮮組-1964-20低溫儲存對皮膚表皮Dsg1和Dsg2含量的影響 （平均積分光密度,XSD，n=10）* 與新鮮皮片組相比，標(biāo)本組別Dsg1Dsg2新鮮皮膚0.2870.0080.2540.007-196組0.2830.0050.2470.006-80組0.2720.007 *0.2390.007 *-20組0.2350.018 *0.1640.008

20、*4組0.2030.012 *0.1150.021 * 新鮮皮膚橋粒結(jié)構(gòu)清晰、 完整、數(shù)量較多 -196組中橋粒結(jié)構(gòu)、數(shù) 量基本與新鮮組相似 4組橋粒出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模 糊不清，數(shù)量明顯減少新鮮組-1964橋粒橋粒橋粒透射電鏡下觀察低溫冷凍對皮膚組織橋粒的影響海藻糖對低溫保存皮膚橋粒芯糖蛋白1的實驗研究D/P -21d組T/D-21d組T/D-7d組D/P -7d組 兩種低溫保護劑對皮膚組織Dsg1表達(dá)變化影響 （平均積分光密度,XSD，n=6）與新鮮組皮膚比較，*，T/D、D/P組間比較， 組別 7 天 21天新鮮組T/D組 D/P組 0.2870.008 0.2870.008 0.2850.

21、006 0.2840.0040.2820.004 0.2750.005*T/D-7d組D /P-7d組橋粒橋粒透射電鏡下觀察CPA對低溫保存皮膚橋粒的影響橋粒D /P -21d組T/D-21d組橋粒第二部分臨床實際應(yīng)用 皮膚的結(jié)構(gòu) 皮膚從外到內(nèi)，由表皮、真皮和皮下組織三部分組成 皮膚附件作為特化的表皮結(jié)構(gòu)也屬于皮膚的重要結(jié)構(gòu)，其中包括汗腺、皮脂腺、毛發(fā)、指甲皮膚的結(jié)構(gòu) 表皮 從上到下又分為 角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層、基底層 真皮 分為乳頭層、網(wǎng)狀層。主要有結(jié)締組織構(gòu)成，包括膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維。此外皮膚附件，血管、淋巴管、神經(jīng)末梢皮膚的主要功能：保護作用感覺作用體溫調(diào)節(jié)作用分泌和排

22、泄作用吸收作用水分 電解質(zhì)皮膚缺失熱量 蛋白質(zhì)病原體 貧血 低蛋白血癥 創(chuàng)面膿毒癥MODS死亡大面積燒傷病人創(chuàng)面焦痂的存在引起 體液的丟失 有害介質(zhì)釋放侵襲性感染的滋生地機體超高代謝多器官功能衰竭及并發(fā)癥皮膚儲存的必要性：當(dāng)大面積燒傷或皮膚缺損超過體表面積的30%時，自體供皮受限臨床實踐證明：具有活力的異體皮仍是目前最為理想的創(chuàng)面覆蓋物 異體皮來源時間受限皮片的來源及種類自體皮 燒傷治療中最為常用的皮片，其來源受 到供皮區(qū)的限制異種皮 以豬皮多見。取材方便，但移植后排斥 時間短，有時難以達(dá)到覆蓋創(chuàng)面的目的同種異體皮 主要來源于成人新鮮尸體，其次為新 鮮死嬰皮 冷凍異體皮的適用范圍開放性創(chuàng)面、深度燒傷創(chuàng)面和切痂創(chuàng)面的暫時性覆蓋用于郵票、網(wǎng)狀或自體微粒皮的覆蓋移植，保證下方自體微粒皮成活用于自體皮源緊張的燒傷后期整形重建手術(shù)，作為自體微粒皮的支架用于暫不適合自體皮的創(chuàng)面覆蓋以改善創(chuàng)基情況 異體皮覆蓋創(chuàng)面的意義防止創(chuàng)面干燥，減少水分及熱量喪失 防止電解質(zhì)、蛋白質(zhì)及血細(xì)胞丟失減少創(chuàng)面污染，減輕患者疼痛有利于關(guān)節(jié)部位