細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)（基礎(chǔ)課堂）

1、細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng)南醫(yī)大三附院檢驗(yàn)科 江培濤1智囊經(jīng)驗(yàn)常用試驗(yàn)碳水化合物的代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)碳源和氮源利用試驗(yàn)各種酶類試驗(yàn)抑菌試驗(yàn)2智囊經(jīng)驗(yàn)一 碳水化合物的代謝試驗(yàn)1 糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)原理：細(xì)菌含有發(fā)酵糖（醇、苷）的酶分解糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、或僅產(chǎn)酸 培養(yǎng)基：含有0.5%1%的糖（醇、苷）的液體、半固體、固體、或 微量生化管方法： 純菌種接種培養(yǎng)基，要求的溫度，數(shù)小時至兩周，微量管注意保持濕潤，以免干燥結(jié)果：能分解糖（醇、苷）類產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng) 若能產(chǎn)氣時，培養(yǎng)基可出現(xiàn)開裂氣泡等現(xiàn)象意義：腸桿菌科尤為重要3智囊經(jīng)驗(yàn)2 氧化-發(fā)酵試驗(yàn)（O/F）原理：細(xì)菌分解葡萄

2、糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；可以進(jìn)行無氧降解的，稱為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的稱為產(chǎn)堿型培養(yǎng)基：HL二氏培養(yǎng)基方法；待測菌同時接種兩只HL培養(yǎng)基，其中一只滴加無菌的液體石蠟，高度不少于1cm，35培養(yǎng)48h或更長結(jié)果：兩只均無變化為產(chǎn)堿型；兩只均產(chǎn)酸為發(fā)酵型；僅不加石蠟的產(chǎn)酸為氧化型意義：腸桿菌科與非發(fā)酵菌的鑒別；葡萄球菌與微球菌的鑒別，前者為發(fā)酵型，后者為氧化型4智囊經(jīng)驗(yàn)3 ONPG（半乳糖苷酶試驗(yàn)）原理：有的細(xì)菌可以產(chǎn)生半乳糖苷酶，分解鄰-硝基酚- 半乳糖苷生成黃色的鄰-硝基酚方法：從KIA上取菌，于0.25ML無菌生理鹽水中制菌懸液，加甲苯一滴，使酶釋放。37 水浴5min,

3、加0.25mlONPG試劑，水浴20min-3h觀察結(jié)果結(jié)果：呈現(xiàn)黃色為陽性，一般20-30min內(nèi)顯色意義：迅速及遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陽性，不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌的快速鑒定注意：該試驗(yàn)不一定與分解乳糖相一致，決定于細(xì)菌產(chǎn)生的酶及其活性5智囊經(jīng)驗(yàn)七葉苷水解試驗(yàn)原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，后者與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應(yīng)生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色方法：將待測菌接種于七葉苷培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮砸饬x：D群鏈球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，前者為陽性；肺炎克雷伯、陰溝腸桿菌多陽性6智囊經(jīng)驗(yàn)V-P試驗(yàn)原理：細(xì)菌分

4、解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基中蛋白胨內(nèi)精氨酸中的胍基作用，生成紅色化合物，即為V-P試驗(yàn)陽性。奈酚可加速此反應(yīng)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 48h，加入甲液（6%奈酚酒精溶液）和乙液（40 %KOH溶液）結(jié)果：20min內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，如無紅色，且于35 4h 后仍如故即為陰性意義：本試驗(yàn)常與甲基紅一起試驗(yàn)，前者陽性則后者多陰性7智囊經(jīng)驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)原理：細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者進(jìn)一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的PH降至4.5以下，加入甲基紅試劑后顯紅色即陽性。若產(chǎn)酸量少，或進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其

5、他物質(zhì)，則培養(yǎng)基的PH仍在6.2以上，加入甲基紅試劑后顯黃色，為陰性培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，2-4天后，加入甲基紅試劑，觀察結(jié)果結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性，橘紅色為弱陽性，黃色為陰性意義：大腸、沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌、等為陽性；腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬為陰性8智囊經(jīng)驗(yàn)7 葡萄糖酸鹽試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能氧化葡萄糖酸鹽作為唯一碳源，生成2-酮基葡萄糖酸鹽。加入班氏試劑，于沸水煮沸10分鐘，出現(xiàn)磚紅色沉淀，表明有葡萄糖酸鹽的存在培養(yǎng)基：2-酮基葡萄糖酸鹽肉湯方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)18-24h，于其中加入0.3ml濃縮班氏試劑，然后沸水中煮沸10分鐘，出現(xiàn)磚紅色沉淀

6、表明有葡萄糖酸鹽的存在意義：用于腸桿菌科分類9智囊經(jīng)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1 明膠液化試驗(yàn)原理：細(xì)菌產(chǎn)生明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體變?yōu)橐后w方法：待測菌接種于明膠培養(yǎng)基，22 培養(yǎng)7天。若用35 孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察前先置4 冰箱30min再觀察結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性意義：多數(shù)假單胞菌能液化明膠，腸桿菌科細(xì)菌如：沙雷菌、變形桿菌、 陰溝桿菌等可液化明膠10智囊經(jīng)驗(yàn)2 吲哚（?；|(zhì)）試驗(yàn) 原理：某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當(dāng)加入吲哚試劑-柯氏試劑（對二氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚培養(yǎng)基：蛋白胨水方法：待測

7、菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)24-48小時，沿試管壁緩慢加入吲哚試劑結(jié)果：于兩者接觸面出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性意義：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定；大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯為陽性試劑：柯氏試劑（對二氨基苯甲醛）與歐氏試劑的區(qū)別：前者含戊醇，后者含酒精，都含濃鹽酸，前者主要成分為后者10倍，后者靈敏度更高11智囊經(jīng)驗(yàn)硫化氫試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，后者遇亞鐵離子或鉛則形成黑褐色的沉淀。培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基方法：待測菌接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)24-48小時觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮砸饬x：沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、腐敗假單胞菌

8、為陽性12智囊經(jīng)驗(yàn)4 尿素分解試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)18-24小時觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮砸饬x：變形桿菌、摩根氏、雷氏普羅維登氏、克雷伯氏為陽性13智囊經(jīng)驗(yàn)5 苯丙氨酸脫氨酶（TDA）試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)18-24小時，加10%三氯化鐵試劑3-4滴，觀察結(jié)果結(jié)果：腸桿菌科變形桿菌、普羅維登氏菌、摩根氏菌陽性14智

9、囊經(jīng)驗(yàn)6 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)原理：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑顯色培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，并加入無菌液體石蠟，35 培養(yǎng)18-24小時觀察結(jié)果結(jié)果：對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色，（指示劑為溴甲酚紫）測定管呈黃色為陰性；若對照管呈紫色則試驗(yàn)無意義意義：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定15智囊經(jīng)驗(yàn)三 碳源和氮源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌能以枸櫞酸鹽為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基35 培養(yǎng)18-24小時，觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基

10、中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，不變色為陰性意義：克雷伯菌屬、沙門菌屬常為陽性16智囊經(jīng)驗(yàn)丙二酸鹽利用試驗(yàn)原理：有的細(xì)菌可利用丙二酸鹽為唯一碳源，將其分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基方法：待測菌接種于培養(yǎng)基35 培養(yǎng)18-24小時，觀察結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠變?yōu)樯钏{(lán)為陽性，無變化則為陰性意義：腸桿菌科屬間鑒別17智囊經(jīng)驗(yàn)四 各種酶類試驗(yàn)1 氧化酶試驗(yàn)原理：細(xì)胞色素氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶，。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物試劑：1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺方法：菌落

11、法、濾紙法、試劑紙片法。前二者浪費(fèi)試劑，后者節(jié)省結(jié)果：10秒內(nèi)呈深紫紅色為陽性應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的區(qū)別，前者陰性，后者多陽性奈瑟菌屬、莫拉菌屬也為陽性18智囊經(jīng)驗(yàn)2 觸酶試驗(yàn)原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和氧，出現(xiàn)氣泡試劑：3%過氧化氫溶液方法：取菌置于潔凈的試管或玻片上，然后滴加3%過氧化氫數(shù)滴，觀察結(jié)果結(jié)果：出現(xiàn)大量氣泡的為陽性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性意義：用于革蘭氏陽性球菌的鑒別，葡萄球菌和微球菌為陽性，鏈球菌和腸球菌為陰性，腸球菌多假陽性19智囊經(jīng)驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氨，氨再轉(zhuǎn)化為氨基酸和其他含氮化合物；硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸系統(tǒng)

12、中的終末受氫體。有的細(xì)菌能使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，有的能使其還原為亞硝酸鹽和離子銨，有的能使其還原為氮培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基試劑：甲（對氨基苯磺酸），乙（奈胺）方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)18-24小時，將甲乙液分別加入培養(yǎng)基，立即觀察結(jié)果結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性注意：若加入試劑后無反應(yīng)，可能是硝酸鹽沒有被還原，試驗(yàn)陰性硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而致假陰性，此時要加入少許鋅粉，若出現(xiàn)紅色則為陰性，不產(chǎn)生紅色則為假陰性，實(shí)際為陽性意義：腸桿菌科為陽性；銅綠、嗜麥芽能產(chǎn)生氮?dú)?；鏈球菌腸球菌陰性，葡萄球菌陽性20智囊經(jīng)驗(yàn)4 DNA酶試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌產(chǎn)生DNA酶，可使長鏈DNA水解，后者可被酸

13、沉淀，長鏈DNA水解后形成的寡核苷酸鏈則溶于酸，所以在平板上加入酸后會在菌落周圍形成透明環(huán)培養(yǎng)基：0.2%DNA瓊脂平板方法：點(diǎn)種被測菌于上述平板， 35 培養(yǎng)18-24小時；用1mol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結(jié)果結(jié)果：菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽性意義：金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌、變形桿菌陽性21智囊經(jīng)驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn)原理：致病性葡萄球菌；結(jié)合凝固酶、游離凝固酶；纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白使血漿凝固方法：1 玻片法檢測結(jié)合凝固酶 兔血漿 2試管法檢測游離凝固酶 0.5ml兔血漿37 水浴3-4結(jié)果：玻片法中有明顯顆粒樣凝集而鹽水對照無凝集為陽性 試管法以血漿凝固為陽性意義：致病性葡萄球菌；金黃色葡萄球菌多陽性

14、22智囊經(jīng)驗(yàn)6 CAMP試驗(yàn)原理：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進(jìn)葡萄球菌的溶血毒素的活性，在兩菌的交界處溶血力加強(qiáng)，出現(xiàn)矢形溶血區(qū)培養(yǎng)基；BAP方法：先以產(chǎn)溶血毒素的金葡菌劃一橫線接種于BAP，再將被測菌與前一劃線作垂直劃線接種，兩線不能相交，0.5-1cm，37 培養(yǎng)18-24小時觀察結(jié)果，設(shè)陰陽性對照結(jié)果：在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣溶血區(qū)為陽性意義：B群鏈球菌陽性，馬紅球菌出現(xiàn)反CAMP現(xiàn)象23智囊經(jīng)驗(yàn)?zāi)懼芫冈囼?yàn)原理：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，使細(xì)菌發(fā)生自溶試劑：10%去氧膽酸鈉或純牛膽汁方法： 平板法：滴加10%去氧膽酸鈉一環(huán)于被測菌落上35 30min觀察結(jié)果 試管法：0.9

15、ml被測菌培養(yǎng)物加入10%去氧膽酸鈉0.1ml后置35 水浴10-30min觀察結(jié)果結(jié)果：菌落消失，或培養(yǎng)物變透明為陽性意義：肺炎鏈球菌陽性24智囊經(jīng)驗(yàn)8 脂酶、卵磷脂酶、鹼性磷酸酶主要用于厭氧菌的鑒定產(chǎn)氣夾膜梭菌卵磷脂酶陽性中間類桿菌脂酶陽性致病性葡萄球菌鹼性磷酸酶陽性，如金葡等25智囊經(jīng)驗(yàn)26智囊經(jīng)驗(yàn)五 抑菌試驗(yàn)1 O/129試驗(yàn)原理： O/129（二氨基喋啶）對弧菌屬有抑制作用，而對氣單胞菌屬無抑制作用培養(yǎng)基；堿性瓊脂培養(yǎng)基方法：紙片法藥敏 40ug/片結(jié)果：有抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)為耐藥意義：弧菌、鄰單胞菌敏感；氣單胞菌屬耐藥27智囊經(jīng)驗(yàn)桿菌肽試驗(yàn)原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎全敏感，而

16、其他鏈球菌則耐藥培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏0.04U/片結(jié)果：10mm敏感；10mm耐藥意義：A群鏈球菌敏感28智囊經(jīng)驗(yàn)3 奧普托欣Optochin試驗(yàn)原理：肺炎鏈球菌對Optochin敏感，其他鏈球菌無抑制作用培養(yǎng)基：BAP方法：同紙片法藥敏 5ug/片結(jié)果：抑菌環(huán)直徑14mm敏感；14mm耐藥此時加做膽汁溶菌試驗(yàn)證實(shí)意義：肺炎鏈球菌對Optochin敏感29智囊經(jīng)驗(yàn)4 新生霉素敏感試驗(yàn)原理：表皮葡萄球菌對新生霉素敏感；腐生葡萄球菌對新生霉素耐藥培養(yǎng)基：MH瓊脂方法：同紙片法藥敏 5ug/片結(jié)果：抑菌環(huán)直徑16mm敏感；16mm耐藥意義：區(qū)別表皮葡萄球菌與腐生葡萄球菌30智囊經(jīng)驗(yàn)氫氧化鉀拉絲試驗(yàn) (1)原理：革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁在稀堿溶液中易于破裂，釋放出未斷裂的DNA螺旋，使氫氧化鉀菌懸液呈現(xiàn)粘性，可用接種環(huán)攪拌后拉出粘絲來，而革蘭陽性細(xì)菌在稀堿溶液中沒有上述變化。(2)方法：取1滴40g/L氫氧化鉀水