動(dòng)物血中超氧化物歧化酶（SOD）的提取、分離純化及含量、活性、相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)

1、 動(dòng)物血中超氧化物歧化酶（SOD）的提取、分離純化及含量、活性、相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)理論內(nèi)容部分一、超氧化物歧化酶簡(jiǎn)稱：SOD.是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對(duì)人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。它們以銅和鋅、或錳、鐵、或鎳作為輔因子超氧化物歧化酶的來(lái)源超氧化物歧化酶的來(lái)源有很多途徑，可以根據(jù)當(dāng)?shù)氐脑蟻?lái)源，成本需求，技術(shù)要求來(lái)選取不同的提取途徑。其中根據(jù)不同的分類有以下幾個(gè)途徑獲取該酶。1、植物提取2、動(dòng)物提取3、微生物的生產(chǎn)發(fā)酵4、人工合成發(fā)展歷史超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1,

2、 SOD）是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶開(kāi)始算起，人們對(duì)SOD的研究己有七十多年的歷史。1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性，弄清了它催化過(guò)氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。超氧化物歧化酶的作用機(jī)理氧氣在有機(jī)體內(nèi)代謝還原，提供了生物能量，最后生成水，共接受4個(gè)電子。在這還原過(guò)程中，每接受一個(gè)電子就生成一個(gè)氧自由基或活性氧。但氧自由基，能引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致疾病發(fā)生。 O2+eO2 O2+2e+2H+ H2O2O2+3e+3H+ H2O+OHO2+4e+4H+ 2H2O而SOD是體內(nèi)專一清除超氧陰離子自由基的

3、一個(gè)抗氧化酶。 SOD的催化過(guò)程如下：O2-+O2-+2H+ H2O2+ O2SOD將O2-歧化生成雙氧水。國(guó)內(nèi)外對(duì)SOD的毒性進(jìn)行了廣泛的研究，大量資料表明SOD無(wú)毒、無(wú)副作用。二、SOD用途及前景1、抗氧化2、抗衰老3、預(yù)防慢性病及其并發(fā)癥4、抗疲勞5、化療副作用的消除劑6、避免手術(shù)的二次傷害手術(shù)會(huì)引起大量自由基，故建議手術(shù)前后口服抗氧化劑來(lái)迅速恢復(fù)體力加速傷口復(fù)原。超氧化物歧化酶的應(yīng)用 健康上的應(yīng)用 SOD是人體內(nèi)最主要的抗氧化物質(zhì)，是氧自由基的克星和專一清除劑；它清除人體內(nèi)一些自由基。它保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗毒性，調(diào)節(jié)H2O2的濃度，對(duì)付微生物的侵害，并且增強(qiáng)抗氧化酶的活性，迅速清除過(guò)剩的自由基

4、，保持身體健康，體力充沛，面容體態(tài)年輕。全球118位科學(xué)家發(fā)表聯(lián)合聲明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。體內(nèi)的SOD活性越高，壽命就越長(zhǎng)。藥物類主要集中在炎癥病患者，尤其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、心肌梗塞、心血管病、腫瘤患者以及放射性治療炎癥病患者；用于生化制藥作為一種生化酶制劑，廣泛應(yīng)用于臨床和科研上，具有極強(qiáng)的抗衰老，抗腫瘤、 調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)作用；用于化妝品類可添加在化妝品中，具有抗氧化抗腐蝕的優(yōu)良性能。有減少皺紋、祛斑的功效以 SOD為主要成份的產(chǎn)品風(fēng)靡世界，引發(fā)了化 妝品歷史上的一場(chǎng)革命，使人類永葆青春美麗夢(mèng)想成真； 用作保健食品、飲料如SOD糖、SOD口服液、SOD

5、干啤等都非常暢銷! 在飲料、糖果、糕點(diǎn)等食品中加入SOD既可利用其抗腐蝕性延長(zhǎng)保質(zhì)期，又可調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)總之，超氧化物歧化酶可以清除體內(nèi)過(guò)量的自由基，提高人體免疫力，延緩衰老；有效降低血脂、膽固醇、血壓； 抗疲勞，增強(qiáng)肝腎功能；抗輻射；對(duì)糖尿病有明顯的恢復(fù)作用；調(diào)節(jié)女性生理周期，推遲更年期 。應(yīng)用前景SOD 是一種新型的抗炎癥藥,尤其對(duì)關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有明顯療效,根據(jù)SOD 作用機(jī)制和毒性試驗(yàn),它對(duì)治療因O2 引起的各種疾病都有一定的療效。 為此,SOD 可作為抗衰老、抗炎癥、自身免疫疾病患者廣泛應(yīng)用的醫(yī)藥品。此外,SOD 對(duì)治療貝切特氏癥、心肌梗塞等血虛性心臟病、膠原病、新生兒呼吸困

6、難綜合癥、防御放射性傷害等也可望有效。近年來(lái)美、日、德、英國(guó)等對(duì)SOD 作為藥品開(kāi)發(fā)應(yīng)用進(jìn)行了一系列研究和臨床試驗(yàn)并得到廣泛應(yīng)用。可以預(yù)言,隨著人們對(duì)SOD 更廣泛深入的研究,不同類型SOD、SOD 修飾物及人工有機(jī)合成SOD 模擬酶將在醫(yī)療、保健、食品、農(nóng)業(yè)增產(chǎn)等方面發(fā)揮出更大的作用.三、SOD提取方法實(shí)驗(yàn)部分(P40-70）一、基本內(nèi)容：細(xì)胞破碎及酶的抽提。兩種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法及酶的活力測(cè)定。；離子交換柱分離操作及分析。SDS電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。固定化酶的制備技術(shù)。6. 酶的柱層析分離操作，包括裝柱，恒流泵及部分收集器的試調(diào)，上樣，洗脫等。7. IEF測(cè)蛋白質(zhì)PI；8. POD同工酶分

7、析；9. 細(xì)胞器的分離及其標(biāo)志物（酶）的測(cè)定 二.目的要求 學(xué)習(xí)提取分離純化超氧化物歧化酶的方法，掌握酶分離純化的基本操作技術(shù)。包括以下內(nèi)容：1細(xì)胞破碎及酶的抽提；2酶的柱層析分離操作；3酶的活力測(cè)定。三.基本原理 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD, EC 1.15.1.1)是一種歧化超氧負(fù)離子自由基O2生成H2O2和O2的金屬蛋白，為胞內(nèi)酶，在生物體內(nèi)具有延緩機(jī)體衰老，對(duì)腫瘤、自身免疫性疾病和輻射損傷具有重要的防御作用，是一種重要的藥用酶。根據(jù)所含的金屬離子，SOD可分為三類：Cu、ZnSOD、MnSOD和FeSOD。SOD在生物界中分布極廣，原核生物和真核

8、生物中都有存在。本實(shí)驗(yàn)從血中提取SOD，提取液經(jīng)葡聚糖凝膠柱上層析，分離出SOD，然后用鄰苯三酚法測(cè)定其酶活力。鄰苯三酚在自氧化過(guò)程中產(chǎn)生有色中間物（紅桔酚）和O2-,使溶液顏色變褐加深。加入SOD能歧化O2-阻止中間物（紅桔酚）的積累，通過(guò)分光光度計(jì)比色分析反應(yīng)液的顏色而測(cè)定其酶活力。超氧化物歧化酶的工藝流程動(dòng)物血液材料中制備超氧化物歧化酶分離純化工藝分為三個(gè)主要步驟：原材料的預(yù)處理乙醇-氯仿除去血紅蛋白粗酶液的制備有機(jī)溶劑沉淀 離子交換柱層析精制 SOD成品原材料的預(yù)處理材料材料試劑：3.8%檸檬酸三鈉，0.9%氯化鈉，95%乙醇，氯仿，牛血。器材：恒溫水浴，離心機(jī)，布氏漏斗，抽慮瓶，燒杯

9、，量筒，攪棒實(shí)驗(yàn)步驟收集：取新鮮牛血，加入到3.8%檸檬酸三鈉液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3:1,輕輕攪拌均勻，4000r/min,離心20min,收集紅細(xì)胞。浮選：紅細(xì)胞用3倍體積生理鹽水洗滌，4000r/min離心20min,重復(fù)3次。溶血：向洗凈的紅細(xì)胞加入倍體積去離子水，在5下攪拌30min,得到溶血物。 注意： 收集完新鮮血液后，應(yīng)盡快加抗凝劑去除血紅蛋白過(guò)程中，攪拌要均勻去血紅蛋白 向溶血液中分別緩慢加入倍體積的預(yù)冷95%乙醇和倍體積的預(yù)冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h,然后4000r/min離心20min，除去變性血紅蛋白沉淀，取清夜，過(guò)濾，收集濾液。 1.熱變性 原材

10、料的預(yù)處理中獲得的上清液加熱到65，保溫10min，然后迅速冷卻到室溫，3000r/min離心20min，棄去沉淀物，收集上清液。 2.沉淀 清夜在冰浴中冷卻，然后在-5一下的操作溫度下，加入倍量預(yù)冷丙酮，邊加邊攪拌均勻，即有白色沉淀產(chǎn)生，靜置23min，迅速抽濾，棄去濾液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸餾水溶解，4000r/min離心20min，除去不溶物，用的緩沖液透析，即得粗SOD溶液注意迅速冷卻至室溫沉淀過(guò)程保持低溫哦三材料器具 材料：動(dòng)物新鮮血液；Sephadex G75凝膠。儀器：高速組織搗碎機(jī)；高速冷凍離心機(jī)；層析柱（140cm）；自動(dòng)部分收集器；恒流泵；進(jìn)樣器和微量進(jìn)樣器；可見(jiàn)/紫外

11、分光光度計(jì)。試劑：（1）pH7.8, 5mmol/L磷酸緩沖液（內(nèi)含1mmol/L EDTA）；（2）考馬斯亮藍(lán)溶液：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G250于50ml 95%乙醇中，搖動(dòng)，待溶解后，加入100ml 85%磷酸，反復(fù)震動(dòng)后加蒸餾水定容至1000ml,過(guò)濾待用；（3）pH8.2, 50mmol/L Tris-HCl緩沖液；（4）50mmol/L 鄰苯三酚溶液；（5）10mmol/L HCl溶液4. 試劑的配法 （1）、50mmol/LTris-HCl 稱取，用雙蒸水溶解至80mL左右，用HCl調(diào)節(jié)（用pH計(jì)校正），最后定容至100mL。 （2）10mmol/LHCl （3）50mmol/

12、L鄰苯三酚 稱取鄰苯三酚，用10mmol/LHCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。 （4）SOD樣液 四.實(shí)驗(yàn)操作 (一) SOD的提取取新鮮血液,冷水浸泡24h,瀝干，加冰凍的pH7.8, 5mmol/L磷酸緩沖液適量，用高速組織搗碎機(jī)搗碎。用高速冷凍離心機(jī)以8000rpm離心除去固型物（需45次，每次15min）,上清液即SOD酶液。（二）SOD的凝膠層析分離純化 1.凝膠的準(zhǔn)備：（1）稱取Sephadex G75干凝膠2g，加適量洗脫液沸水浴溶脹2小時(shí)（也可室溫溶脹24小時(shí)）。 （2）用傾斜法傾去表面懸浮的細(xì)小顆粒，室溫儲(chǔ)存于磷酸緩沖液中備用。2裝柱： （1）將層析柱豎直固定于支架上

13、,連接好恒流泵、部分收集器,調(diào)節(jié)洗脫液的操作壓60cm。（2）先向?qū)游鲋屑尤?/3高度的pH7.8, 5mmol/L磷酸緩沖液,然后用大口進(jìn)樣器吸取上述準(zhǔn)備好的凝膠徐徐注入柱中緩沖液內(nèi),讓其自然沉降，沉降好的柱床頂部離管口12cm為宜。若高度不夠，可放去部分緩沖液，攪起管中凝膠界面，繼續(xù)添加凝膠。（3）裝畢，用23個(gè)床體積的洗脫液洗脫，以使床柱穩(wěn)定。 3上樣： （1）放去床表面上的緩沖液至與凝膠界面平齊。 （2）用進(jìn)樣器吸取酶液，加樣時(shí)將進(jìn)樣器尖端接觸柱內(nèi)壁并在離床表面數(shù)毫米處隨加隨沿內(nèi)壁轉(zhuǎn)動(dòng)一周，使樣品盡快分布于全表面。然后打開(kāi)恒流泵，待樣品液面與床柱表面平齊時(shí)，關(guān)閉恒流泵，以少許（1ml

14、）緩沖液沖洗內(nèi)壁數(shù)次，在打開(kāi)恒流泵，放至液面與床柱表面平齊。 （3）先用進(jìn)樣器加1cm高度的緩沖液覆蓋樣品，然后加足緩沖液，連接好進(jìn)液管。 4洗脫： 開(kāi)啟部分收集器和恒流泵，以pH7.8, 5mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫。調(diào)節(jié)流速，控制每管收集洗脫液1ml，每管按收集順序做好標(biāo)記。5洗脫液酶蛋白含量的測(cè)定： ： （1）取潔凈試管數(shù)支，分別加入考馬斯亮藍(lán)溶液3ml,搖勻，將其中一支試管不加任何試液作為對(duì)照管，其余的分別加入從第五收集管起的洗脫收集液50l,反復(fù)搖勻。（2）以對(duì)照管為調(diào)零液，用1cm比色杯在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管的OD595nm值。（3）合并OD595nm值高的原收集液，此即純

15、化的SOD酶液。保留測(cè)酶活力。 （4）測(cè)定完畢，先用乙醇洗去比色杯的顏色，再用蒸餾水蕩洗，用擦鏡紙拭干水珠，倒扣在培養(yǎng)皿內(nèi)。 （5）清理干凈工作臺(tái)，在儀器使用登記本上登記使用情況。（三）SOD酶活力測(cè)定在一般情況下，SOD活性測(cè)定只能應(yīng)用間接活性測(cè)定法。其測(cè)定方法很多，常見(jiàn)的有化學(xué)法、免疫法和等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有色中間物和O2-，利用SOD分解而間接推算酶活力。在化學(xué)方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學(xué)擴(kuò)增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡(jiǎn)單易行較為實(shí)用

16、。本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化方法。 鄰苯三酚自氧化法原理：鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2- （超氧陰離子自由基），生成帶色的中間產(chǎn)物（紅桔酚），反應(yīng)開(kāi)始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的是鄰苯三酚自氧化過(guò)程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在325nm波長(zhǎng)出有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間有色產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致吸光值下降因此，通過(guò)測(cè)定它們?cè)谔囟úㄩL(zhǎng)下得光吸收變化速率計(jì)算出SOD

17、的酶活性 。 鄰苯三酚 O2- + 紅桔酚（自氧化：有色物質(zhì)積累，吸光值增加） O2- + O2- +2H+H202+O2（SOD催化：阻止中間產(chǎn)物積累，吸光值降低） SOD實(shí)驗(yàn)步驟： 1測(cè)定鄰苯三酚溶液自氧化速率：取兩支試管按右表加入25預(yù)熱過(guò)的緩沖液,然后加入預(yù)熱過(guò)的鄰苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0士（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。2.SOD樣液活力測(cè)定：樣品管取代自氧化管。樣品管測(cè)定時(shí)先加入預(yù)

18、熱的待測(cè)酶液，在 25水浴鍋中保溫10min，再加入預(yù)熱的鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定 。3. 數(shù)據(jù)處理 3.1 加入SOD酶前后鄰苯三酚自氧化速率的計(jì)算 3.2 SOD酶活力計(jì)算： (酶活力單位定義:在一定條件下,每1mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50 %時(shí)的酶量定義為一個(gè)活力單位。) SDS技術(shù)及原理酶固定化技術(shù)鄰苯三酚的自氧化曲線緩沖液4.5mL 45mL鄰苯三酚溶液0.01mL)BackSOD酶對(duì)鄰苯三酚自氧化的抑制 酶活力測(cè)定曲線Back清 場(chǎng)各組將實(shí)驗(yàn)臺(tái)清理好，實(shí)驗(yàn)用具清洗干凈，恢復(fù)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的狀態(tài)。派人清掃實(shí)驗(yàn)室。色譜法純化超氧化物歧化酶 操作步驟 1

19、、DEAE-纖維素的預(yù)處理： DEAE-纖維素2、裝柱 （1）層析柱用洗滌液洗清潔，柱的下端聯(lián)接塑料管，裝上螺旋夾。關(guān)上螺旋夾，柱內(nèi)裝入緩沖液I，微開(kāi)螺旋夾。讓緩沖液緩慢流出，趕走死區(qū)及塑料管中的氣泡，柱中保留少量緩沖液，關(guān)閉螺旋夾。 （2）將基本平衡好的DEAE-纖維素漿液（約有1倍體積的緩沖液I）放在抽濾瓶中減壓除盡氣泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高約1cm高度時(shí)，部分旋松螺旋夾，讓溶液緩慢流出去，注意此時(shí)的流速要比正常洗脫時(shí)的流速慢，陸續(xù)加入較多的漿液，直至達(dá)到高10cm以上的柱床體積。 層析柱3、平衡 當(dāng)全部交換劑裝入柱中后，用上柱起始緩 沖液進(jìn)行平衡。流速可維持在4mL/15min，直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。（一般要平衡8h以上或過(guò)夜。） 4、層析 用毛細(xì)吸管小心吸去交換劑上面大部分液體，打開(kāi)出口使緩沖液恰流到表面，關(guān)閉出口。用毛細(xì)吸管小心地沿柱壁四周緩緩加入SOD粗酶液，打開(kāi)出口，使樣品溶液進(jìn)入纖維素內(nèi)，至幾乎露出床面時(shí)，柱壁用少量緩沖液小心洗滌23次，然后裝入緩沖液，使液面高出創(chuàng)面23 cm左右。 5、洗脫 （1）按圖8-9將梯度洗脫器和層析柱連接好。 （2）在洗脫瓶A（貯存器）和洗脫瓶B（混合器）內(nèi)各裝入100mL緩沖液和緩沖液，注意兩洗脫瓶，特別是液面應(yīng)處于同一水平面，同時(shí)應(yīng)排除連接管內(nèi)氣泡