第二講血脂脂蛋白及載脂蛋白測定

1、血脂、脂蛋白及載脂蛋白測定1一、血脂測定血脂測定項目 TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp（a）、ApoAI、ApoB等。檢測項目的合理選擇 臨床常規(guī)血脂測定：TC、TG、HDL-C 及LDL-C這四項，有條件的實驗室可測定ApoA、ApoB及Lp(a)。 特殊檢查項目：如Apo（A、C、C、C和E）、FFA、CETP、LPL、LCAT測定等，多用于科研或臨床特殊病例研究。2血脂和脂蛋白檢測前應注意的問題 分析前主要影響因素有： 1.生物學因素 如個體間、性別、年齡和種族等。 2行為因素 如飲食、肥胖、吸煙、緊張、飲酒、飲咖啡和鍛煉等。 3臨床因素 如疾病繼發(fā)；藥物誘導4標本收集與處理3建

2、議： 1抽血前2周保持平時的飲食習慣。2抽血前3天避免高脂飲食，24小時內(nèi)不飲酒，不作劇烈運動。3應在禁食1214小時后空腹抽血。4除臥床的患者外，一般應坐位休息5分鐘后抽血。5抽血前最好停用影響血脂的藥物數(shù)天或數(shù)周，否則應記錄用藥情況。4（一）血清外觀分析（血清冷置試驗） 混濁（TG增高）下層濁（VLDL增高）型下層清（VLDL正常）型均勻混濁（VLDL）TC正常 型上層奶油樣（CM）TC增高 a型TC正常 正常人清亮（TG正常）TC b，型空腹血清 測TC 4過夜 測TC5（二）血清總膽固醇測定 膽固醇是人體重要的脂類成分，具有重要的生理功能，如合成類固醇激素，維生素D3膽汁酸，并構(gòu)成細胞

3、膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），膽固醇與動脈粥樣硬化有密切關系，故膽固醇測定是最常用的實驗室檢測項目之一。 TC測定方法很多，約200多種，分為化學測定法、酶法、氣相色譜法、高效液相色譜法、核素稀釋質(zhì)譜法（決定性方法）。61、化學測定法 主要有兩類（1）Liberman-Burchard反應 簡稱L-B反應，膽固醇經(jīng)冰醋酸，濃硫酸脫水生成3.5-膽烷二烯陽離子，然后被醋酐，濃硫酸氧化生成綠色的膽烷六烯磺酸。呈色穩(wěn)定性差。（2）Zak反應 膽固醇經(jīng)冰醋酸，濃硫酸脫水生成3.5-膽烷二烯陽離子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫紅色膽烷四烯陽離子，靈敏度較L-B反應高7倍，且呈色穩(wěn)定性

4、好，但試劑腐蝕性極大，不能用于自動化分析。 72、酶法膽固醇酯 膽固醇 脂肪酸膽固醇 O2 膽烷-4-烯-3酮 H2O2H2O2 4AAP 酚 紅色亞胺醌 H2OCEHChODPOD 試劑中除上述三種酶外，還有膽酸鈉和表面活性劑及穩(wěn)定劑，膽酸鈉用于激活CEH，表面活性劑促進膽固醇從脂蛋白中釋放。 酶法操作簡便，快速，試劑無腐蝕性，適合于自動化分析，但也存在有一些不足，CEH對膽固醇水解不完全，表面活性劑影響CEH活性，黃疸血清中過高的膽紅素可還原H2O2使結(jié)果偏低。8【參考范圍】3.105.70mmol/L【臨床意義】血清TC含量受年齡、性別、飲食和運動等因素的影響。20歲以上隨年齡而，70歲

5、以后則有下降趨勢。2040歲階段男性高于女性，但女性絕經(jīng)后則高于男性。城市人群高于農(nóng)村人群，與飲食和運動有關。腦力勞動者高于體力勞動者。 病理性高膽固醇血癥 原發(fā)性高膽固醇血癥、糖尿病、膽道阻塞、腎病綜合癥、甲狀腺功能減退。 病理性低膽固醇血癥 嚴重貧血、甲亢、營養(yǎng)不良。 9（三）血清甘油三脂測定 TG是有一分子甘油與三分子脂肪酸組成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，臨床化學中往往以測定甘油代表TG的含量。TG的測定方法很多，如氣相色譜法、高效液相色譜法、紅外分光光度法。但上述方法需特殊的儀器設備和技術，故一般只用于研究工作中。臨床實驗室主要用化學法和酶法。 101、化學法 基本步驟可歸納

6、為四步 （1）提?。焊视腿奶崛?采用合適的溶劑，使脂蛋白變性提取TG，同時去除干擾物質(zhì)(磷脂、游離甘油、葡萄糖等),常用方法有： 1）異丙醇抽提，沸石合劑（沸石、高嶺土）吸附。 2）異丙醇抽提，氧化鋁吸附磷脂。 3）正壬烷、異丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用價廉的正庚烷代替正壬烷。應用較廣。11 （2）皂化：甘油三脂的水解 一般都采用KOH乙醇或KOH異丙醇溶液，60，515min可使TG完全水解。 （3）氧化：甘油的氧化 最常用的氧化劑是HIO4，甘油在酸性條件下被氧化成甲醛、甲酸。反應受-磷酸甘油、葡萄糖、絲氨酸的干擾，故抽提時應盡量除去此類物質(zhì)的干擾。12 （4）顯色：

7、顯色測定甲醛。常用方法有： 1）甲醛與變色酸（4.5-二羥-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加熱生成紫紅色化合物。（570nm） 2）甲醛與乙酰丙酮在氨的存在下縮合成黃色的3.5-二乙酰-1.4-二氫-2.6-二甲基吡啶。（420nm）132、酶法 常用的有：（1）磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法） TG H2O 甘油 FA 甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADP 3-磷酸甘油 O2 磷酸二羥丙酮 H2O2 H2O2 4-AAP 酚 紅色亞胺醌 H2O 試劑較穩(wěn)定，靈敏度高，線性范圍寬，膽紅素、維生素C可消耗H2O2使結(jié)果偏低。LPLGK GPOD POD 14（2）乳酸脫氫酶法（GK-P

8、K-LDH 法）TG H2O 甘油 FA甘油 ATP 3-磷酸甘油 ADPADP 磷酸烯醇式丙酮酸 ATP 丙酮酸 丙酮酸 NADHH+ 乳酸 NAD+ （3）甘油氧化酶法第一步消除血清中原有的甘油： LPLGPODPKLDH 15游離甘油 O2 甘油醛 H2O2GlyODH2O2 EMAE 無色物質(zhì) EMAE稱N-乙基-N-（3-甲基）-N-乙酰乙二胺。是一種還原劑，靈敏度比酚高。第二步測定甘油三脂水解釋放的甘油： TG H2O 甘油 FA甘油 O2 甘油醛 H2O2 H2O2 4-AAP EMAE 有色化合物 POD GlyODLPL POD 16【參考范圍】0.561.70mmol/L【

9、臨床意義】血清TG一般隨年齡增長而升高，體重超標者往往偏高。 1.病理性增高 原發(fā)性高脂蛋白血癥、肥胖癥、糖尿病、腎病綜合癥、脂肪肝、妊娠后期。 2.病理性降低 甲亢、腎上腺皮質(zhì)功能減退、嚴重肝功能損傷。 17(四)血清（漿）脂蛋白測定 1、血清脂蛋白電泳 臨床實驗室常用的支持介質(zhì)有醋酸纖維薄膜和瓊脂糖凝膠。 （1）血清脂蛋白醋酸纖維薄膜電泳 以醋酸纖維薄膜為支持介質(zhì)，血清脂蛋白經(jīng)電泳分離，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不飽和脂肪酸的雙鍵斷裂生成醛，再用亞硫酸品紅染色，即生成紫紅色區(qū)帶。18（2）血清脂蛋白預染瓊脂糖電泳 血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預染后，以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)，進行電泳分離，即可

10、得到清晰的蘭色區(qū)帶。 凝膠濃度一般為0.5%，超過1%，-Lp與pre-Lp不易分開，0.5%，凝膠機械強度太低。 血清：染料為9：1，染料過多稀釋標本，而且染料中乙醇會引起蛋白質(zhì)變性，影響分離效果。 19 結(jié)果判斷，直觀區(qū)帶的著色深淺，寬窄，用淺染，稍淺染，深染及消失加以描述；或用光密度掃描儀測定?！緟⒖挤秶?-Lp 30%40% pre-Lp 13%25% -Lp 50%60% CM （）202、血清高密度脂蛋白測定 常以測定HDL-C含量代表HDL水平。測定步驟包括HDL的分離；測定HDL中膽固醇。 HDL的分離方法有：超速離心法、凝膠過濾法、免疫化學法、電泳法、沉淀法。臨床實驗室常用

11、沉淀法。沉淀劑一般為二價陰離子和多價陰離子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖- Mg2+、磷鎢酸- Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。 21 如：磷鎢酸- Mg2+選擇性地沉淀血清中的LDL和VLDL，經(jīng)離心上清液中保留HDL，然后用酶法測定上清液中的膽固醇含量，即代表HDL中的膽固醇?！緟⒖挤秶磕?1.280.33mmol/L女 1.370.33mmol/L【臨床意義】HDL-C與冠心病發(fā)病呈負相關，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危險因素。223、血清高密度脂蛋白亞組分測定 HDL有三個亞類（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亞類與冠心病危險度的相關程度比總H

12、DL-C更密切。 HDL2 d = 1.0631.125g/ml HDL3 d = 1.1251.210g/ml HDL2脂類60% 蛋白質(zhì)40% ； HDL3脂類45% 蛋白質(zhì)55%23 高密度脂蛋白亞組分的分析方法有超速離心法、柱層析法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、多價陰離子分級沉淀法。 其中多價陰離子分級沉淀法具有快速、經(jīng)濟、簡便更為實用，是目前臨床實驗室最常用的方法。常用的沉淀劑有硫酸葡聚糖- Mg2+、聚乙二醇（PEG）。24【原理】用PEG做沉淀劑，以不同濃度的PEG在不同pH條件下分別將VLDL和LDL（沉淀劑 95g/L PEG，pH6.5）HDL2（沉淀劑 170g/L PEG，p

13、H7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀劑）和HDL3（沉淀劑），然后用酶法測定HDL-C和HDL3-C，并以HDL-C減去HDL3-C的差即為HDL2-C的含量。 【參考范圍】 HDL2-C 男 0.530.17mmol/L 女 0.620.22mmol/L HDL3-C 男 0.750.17mmol/L 女 0.750.16mmol/L254、低密度脂蛋白測定 低密度脂蛋白水平通常以LDL-C含量表示。LDL-C測定方法很多，常用的有： （1）Friedewald公式法 LDL-C TCHDL-C 或 在一般情況下能得到可被臨床接受的近似結(jié)果，但TG4.25mmol/L時不能應用此公式計

14、算，否則結(jié)果偏差太大。TG2.2TG5mg/dlmmol/L26（2）聚乙烯硫酸鹽沉淀法 聚乙烯硫酸（PVS）能選擇性沉淀血清中LDL，再以血清TC減去上清液（含HDL和VLDL）膽固醇，即得LDL-C值。試劑中加入EDTA去除兩價陽離子，避免VLDL共沉，輔以聚乙二醇獨甲醚（PEGME）可加速沉淀。（3）直接測定法 勻相的LDL-C直接測定法是以不同的表面活性劑的雙試劑使非LDL-C與LDL-C分兩步水解，因先消除非LDL-C，故也稱為消除法?！緟⒖挤秶縇DL-C3.12mmol/L【臨床意義】LDL-C增高是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要危險因素。275、脂蛋白（a）測定 脂蛋白(a)是由載

15、脂蛋白(a)與載脂蛋白B100通過二硫鍵連接所形成的特殊蛋白。脂蛋白(a)測定的方法目前常用的是ELISA法。 血清中的脂蛋白(a)與單克隆抗Lp(a)抗體結(jié)合，再與過氧化物酶結(jié)合，形成Lp(a)-單克隆抗體-酶復合物，然后與底物孵育顯色。28【參考范圍】120180mg/L【臨床意義】Lp（a）動脈粥樣硬化、冠心病的獨立危險因素，與動脈粥樣硬化成正相關。血清Lp（a）濃度300mg/L時，其冠心病的發(fā)病率高于健康人的25倍。血清Lp（a）水平主要決定于遺傳，個體間Lp（a）水平差異很大，但同一個體血漿Lp（a）水平的變化較小，環(huán)境、飲食、藥物對它的影響不明顯。29（五）血清載脂蛋白A及B測定 脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分稱為載脂蛋白（apolipoprotein，Apo），可分為A、B、C、D、E、F、G、H八類，其中ApoA，B，C還有亞類。 ApoA是HDL的主要蛋白質(zhì)，占HDL蛋白質(zhì)的85%左右，它的血清濃度可代表HDL水平，ApoB是LDL的主要蛋白質(zhì)，占LDL蛋白質(zhì)的97%左右，ApoB濃度主要反映LDL水平。30 Apo的測定方法主要有三類：層析分離，然后再按一般蛋白質(zhì)定量；電泳分離后經(jīng)染色光密度掃描定量；各種免疫分析法。 層析法操作麻煩，