02-2-第二篇-海藻組織培養(yǎng)技術(shù)PPT課件.ppt

1、第三節(jié) 海藻組織培養(yǎng)概況1 根據(jù)海藻材料的不同，海藻組織培養(yǎng)分為：海藻切段培養(yǎng)海藻愈傷組織培養(yǎng)海藻細(xì)胞培養(yǎng)海藻原生質(zhì)體培養(yǎng) 一、海藻組織培養(yǎng)的分類2二、海藻組織培養(yǎng)研究歷史海藻組織培養(yǎng)開始于20世紀(jì)50年代，美國加州大學(xué)教授A.Gibor最早開始用褐藻(Cystoseira)進(jìn)行海藻組織培養(yǎng)試驗(yàn)。Chen和Taylor(1978)最早報(bào)道對紅藻門皺波角叉菜（Chondrus crispus）的髓部組織培養(yǎng)。3早期的海藻組織培養(yǎng)研究遇到了兩大難題：獲得無菌材料困難：海藻的表面寄生物多，且生長牢固，難以去除，必須采用劇烈的刷洗，而海藻的外表皮細(xì)胞無角質(zhì)層類的保護(hù)層，很容易受損傷；同時(shí)由于寄生的微生

2、物種類多，數(shù)量大，所用的消毒劑和抗生素的量需加大，極易造成外植體畸形或死亡；海藻的基礎(chǔ)研究落后，缺乏控制其生長和分化的x相關(guān)知識。4海藻的生活環(huán)境復(fù)雜具有許多不同于高等植物的特性，使得組織培養(yǎng)研究進(jìn)展相對緩慢。從20世紀(jì)80年代開始，進(jìn)行了許多海藻表面消毒和無菌孢子獲得方法的研究。各種新的抗生素和清洗技術(shù)應(yīng)用到大型海藻的組織培養(yǎng)中，許多海藻成功的實(shí)現(xiàn)了組織培養(yǎng)。同時(shí)對于愈傷組織產(chǎn)生的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了詳細(xì)的研究，包括各種培養(yǎng)條件，不同的培養(yǎng)基，產(chǎn)生部位以及來源（組織塊，細(xì)胞，原生質(zhì)體）。5對于影響愈傷組織形成的物理因子，包括滲透壓，瓊膠強(qiáng)度，鹽度（Robaina et al.1990，Yokoya

3、 et al.1999），營養(yǎng)鹽包括甘油、有機(jī)碳源(Garcia-Jimenez et al.1998)，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(Bradley&Cheney 1990，Yokoya&Handro 1996，Yokoya 2000) 等進(jìn)行了詳細(xì)的研究。據(jù)統(tǒng)計(jì)迄今已有六十余種大型海藻通過原生質(zhì)體、組織切塊實(shí)現(xiàn)了再生培養(yǎng)。 6三、海藻組織培養(yǎng)的應(yīng)用海藻組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：取材少，繁殖周期短、環(huán)境條件人為控制不受季節(jié)限制、易于工廠化生產(chǎn)等。7海藻組織培養(yǎng)主要應(yīng)用在：種苗培育研究次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)8 種苗培育研究海藻種質(zhì)庫：我國在大型經(jīng)濟(jì)海藻的養(yǎng)殖與應(yīng)用方面一直處于國際領(lǐng)先地位，同時(shí)也是少數(shù)幾個(gè)具有大型海藻種質(zhì)

4、庫的國家之一，目前已保存了海帶、裙帶菜、紫菜的多個(gè)品系。苗種生產(chǎn)：利用植物離體繁殖進(jìn)行大規(guī)模的苗種生產(chǎn)。目前，已在經(jīng)濟(jì)海藻的苗種生產(chǎn)研究中取得了一定的進(jìn)展。9劉鳳賢（1990）用殼聚多糖可將鷓鴣菜切段長成再生苗；朱仲嘉等（1992）羊棲菜組織培養(yǎng)芽生苗；裴魯青等（1993）石花菜切段再生。賀麗虹等（2004）條斑紫菜單細(xì)胞固體培養(yǎng)成苗；曾慶國等（2004）以壇紫菜單個(gè)體細(xì)胞克隆培養(yǎng)獲得的葉狀體，再用組織培養(yǎng)技術(shù)形成純和絲狀體，然后進(jìn)行海上養(yǎng)殖等。10 次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)海洋植物含有特殊的成分，在工業(yè)和醫(yī)藥中有特殊的利用價(jià)值。溫帶紅藻Agardhiella subulata含有稀有的通過脂肪氧化

5、代謝產(chǎn)生的類花生酸（Graber等1996）和具有抗濾過性病原體活性的磺酸鹽半乳糖體（Witvrouw等1994）；11熱帶紅藻Ochtodes secundiramea含有的多種鹵化類萜化合物（Maliakal等2001），可以通過月桂烯合成酶（Wise等2002）和海洋溴過氧化物酶（Roner等2001）產(chǎn)生。另外，從海藻組織培養(yǎng)中還可以生產(chǎn)有用的藥物或其他活性物質(zhì)如胡蘿卜素、紅藻色素等。12四、海藻組織培養(yǎng)操作基本步驟： 實(shí)驗(yàn)室消毒 實(shí)驗(yàn)室器具洗滌與消毒培養(yǎng)基配制與消毒外植體準(zhǔn)備與消毒外植體切割與接種外植體培養(yǎng)與觀察131、培養(yǎng)基的配制高等植物培養(yǎng)基主要有： MS培養(yǎng)基（Murashig

6、e和Skoog,1962） ER培養(yǎng)基（Eriksson,1965） B5培養(yǎng)基（Gambor等，1968） SH培養(yǎng)基（Shenk和Hildebrandt，1972） HE培養(yǎng)基（Heller，1953） 14 海藻組織培養(yǎng)培養(yǎng)基（海水加富型培養(yǎng)基）主要有： 培養(yǎng)褐藻的PESI培養(yǎng)基； 培養(yǎng)紅藻和綠藻的PES培養(yǎng)基、MES培養(yǎng)基、VAS培養(yǎng)基； 培養(yǎng)一般海藻的Erd（-shreiher）培養(yǎng)基和ESS培養(yǎng)基。1516人工海水培養(yǎng)基 這種培養(yǎng)基，在對海藻營養(yǎng)要求進(jìn)行調(diào)查和調(diào)整及生理生化過程的研究時(shí)采用，適用于海藻的一般性無菌培養(yǎng)，主要有： 綠藻常用Asp1培養(yǎng)基、Asp7培養(yǎng)基； 紅藻常用As

7、p2培養(yǎng)基、Asp6培養(yǎng)基； 褐藻常用Asp12培養(yǎng)基； 綠藻常用KDX培養(yǎng)基。 1718MES培養(yǎng)基配制步驟： MP II原液的配制 MES enrichment 原液的配制19 MES培養(yǎng)液的配制 1000mL MES培養(yǎng)液 = 20mL MES enrichment 原液 + 980mL 消毒海水 熔化瓊脂 電爐加熱至瓊脂熔化，將配制好的混合培養(yǎng)液加入到瓊脂中，定容。 調(diào)pH 正常海水的pH值一般為8.1-8.3。 用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH 培養(yǎng)基的分裝 用錐形瓶分裝，培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/51/4，用2塊硫酸紙中間夾1層牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎，貼標(biāo)簽，待消毒。2

8、02、外植體的選擇與消毒外植體選擇:外植體（explant）是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料。外植體的來源：生長在自然環(huán)境下野生或栽培的海藻21最適于用作組織培養(yǎng)的外植體是靠近藻體生長部的分生組織，健康無毒。組織部位、植株年齡、取材季節(jié)以及植株的生理狀態(tài)和質(zhì)量都對培養(yǎng)時(shí)器官的分化有一定影響。22外植體消毒:消毒的尺度是既能全都?xì)缤庵搀w上附帶的微生物，而又不傷害植物材料的生活力。一般使用消毒海水反復(fù)清洗進(jìn)行藻體消毒，或者用碘化鉀或次氯酸鈉溶液進(jìn)行藻體表面消毒。海藻組織培養(yǎng)只能做到少菌而不能真正做到無菌。23表1 常用消毒劑的使用和效果（引自潘瑞熾，2001）*質(zhì)量分?jǐn)?shù)24如果海藻外植

9、體確實(shí)需要無菌，可以使用抗生素消毒，但成功率不高。使用一定濃度的抗生素浸泡一定時(shí)間，每隔一定時(shí)間挑出外植體進(jìn)行無菌檢測，直到確實(shí)無菌為止。培養(yǎng)基中應(yīng)該含有300ug/mL的青霉素 G（ Penicillin G ）、100ug/mL的硫酸鏈霉素（ Streptomycin sulphate ）、50ug/mL的新霉素B（ Neomycin B ）、200ug/mL的康納徽素（ Kanamycin）253、外植體切割與接種切割: 海藻多是頂端生長，切取外植體時(shí)要注意選取具有分生組織的部位，同時(shí)要注意切取藻體的大小。外植體的組織塊大?。翰煌Ｔ逵糜诮M織培養(yǎng)的最佳長度和大小是不同的。 如，江蘺組織培

10、養(yǎng)切段至少要在3mm以上； 多管藻只含1個(gè)細(xì)胞長度的切段也能再生； 不了解藻體再生能力，可以設(shè)立不同長度和大小的梯度試驗(yàn)，以找到組織培養(yǎng)的最佳藻體長度和大小。26切割一般在培養(yǎng)皿上進(jìn)行 培養(yǎng)皿內(nèi)消毒前放入3-4層圓形濾紙，在濾紙上進(jìn)行切割。 每切割1次外植體需要更換位點(diǎn)，同時(shí)器具需要用酒精燈火焰消毒1次，以免交叉感染。27接種:接種就是將消毒過的外植體接入液體培養(yǎng)基中或插入固體培養(yǎng)基中，要無菌操作。接種量： 固體培養(yǎng)基 每瓶接種4-10個(gè)外植體切段 液體培養(yǎng)基 接種量為液體培養(yǎng)基重量的 5-20%左右28接種基本步驟： 將外植體在培養(yǎng)皿濾紙上切割好 用經(jīng)過消毒的鑷子將外植體接入已消毒的培養(yǎng)液中

11、。如果為固體培養(yǎng)基則需將外植體插入到培養(yǎng)基表層中，約1/2露在培養(yǎng)基表面外； 接種后試管用無菌藥棉封口，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口； 將接種后的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放置在培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 。294、海藻組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)方式: 分固體培養(yǎng)基培養(yǎng)和液體培養(yǎng)基培養(yǎng)兩種方式。 一般的小型實(shí)驗(yàn)，可使用各種型號的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。 如果實(shí)驗(yàn)材料比較多，常采用液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法。30培養(yǎng)條件:光照條件：一般采用日光燈，光照強(qiáng)度范圍為15-40molm-2s-1，光照時(shí)間為每日12-16 h。溫度條件：根據(jù)培養(yǎng)材料在自然生態(tài)下的溫度變化來調(diào)整培養(yǎng)室的溫度高低，一般在15-25左右。濕度條件：

12、包括培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度條件和培養(yǎng)環(huán)境的濕度條件。31充氣條件：液體培養(yǎng)可以通過充氣方式進(jìn)行攪拌培養(yǎng)。通入空氣，需要經(jīng)過過濾裝置（濾膜孔徑為0.22um）以保證無菌狀態(tài)；或者用硫酸銅溶液除去雜藻以達(dá)到無污染。32培養(yǎng)液更換： 可以根據(jù)培養(yǎng)對象和培養(yǎng)要求更換全部培養(yǎng)液或只更換1/2或1/3的培養(yǎng)液。 注意：海水培養(yǎng)液因蒸發(fā)而使鹽度提高，故應(yīng)每天定量補(bǔ)加蒸餾水。33培養(yǎng)物的檢查與觀察:定期檢查培養(yǎng)物細(xì)胞的分裂、生長、分化情況檢查的方法：首先，用肉眼觀察培養(yǎng)物的顏色、形狀變化；其次，在倒置顯微鏡下或解剖鏡下觀察培養(yǎng)物細(xì)胞的生長、分化情況。必要時(shí)還可取樣做細(xì)胞學(xué)、染色體研究，同時(shí)做好觀察記錄。34第四節(jié)

13、海藻切段再生 海藻切段再生是海藻組織培養(yǎng)最簡單的形式，就是將藻體切成段，通過無菌培養(yǎng)使切段再生成為植株。 大型海藻是一類低等植物，其藻體再生能力比高等植物更強(qiáng)。35一、海帶假根、柄、葉片切段再生Saga等（1977）用海帶藻體分別進(jìn)行假根、莖、葉片切段再生試驗(yàn) 結(jié)果證明：只有在離基部（包括假根、柄）一段才有再生能力。36按下圖的方法將藻體切成6段培養(yǎng)條件為：溫度10；光照周期為10L：14D；光照強(qiáng)度30molm-2s-1；用PESI培養(yǎng)液培養(yǎng)。372葉片+莖3莖+固著器4莖5固著器1葉片+莖+固著器6包括生長部的葉片1個(gè)月后，葉狀體上部和中部都死亡，其他結(jié)果：切段1從生長部伸長出葉片；切段2

14、葉狀體生長了約2cm，在莖的切口處從周圍生出約0.5cm固著器，長成為全長約3cm的藻體。切段3從莖的切口處周圍生長出約1cm的固著器，但沒有再生出葉狀體；切段4從莖的上下切口處周圍再生出固著器約0.2cm長；切段5有固著器切口處再生出1cm長的固著器；切段6向四周生長，再生成0.7cm不定形葉狀部。對照組完整的藻體全長再生長了2cm。38以上結(jié)果證明：不含生長部的葉狀體不能生存；雖然含有生長部的葉狀部可以生長，但不能再生其他器官；柄部能夠再生分化成固著器，但不能分化成葉；固著器可以再生，但只能再生成固著器。說明只有含有生長部和柄的切段才能再生成為完整的植株。39二、莖段切段再生Chen和Ta

15、ylor（1978）用角叉菜雌配子藻體的分枝（直徑大于2mm）為材料，進(jìn)行了髓部組織培養(yǎng)試驗(yàn)：用靠近頂端約3cm處的藻體切段，應(yīng)用含有抗菌素的海水固體培養(yǎng)基（SWMD-1）培養(yǎng)，獲得無菌材料；在無菌操作下將靠近頂端的部分進(jìn)行切段，并切去表皮及皮層，僅剩有內(nèi)皮層和髓部小塊（大小約2mm3）；再按每瓶1塊組織接入50mL TC-1培養(yǎng)液，以200r/m的旋轉(zhuǎn)速度搖床培養(yǎng) ，培養(yǎng)條件為溫度15，光照強(qiáng)度100molm-2s-1、光照周期16L:8D。實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)皮層和髓部細(xì)胞具有較強(qiáng)的再生能力。40 脫分化：已經(jīng)分化的植物細(xì)胞切割損傷后,在適宜的培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)形成失去分化狀態(tài)的比較均一的愈傷組織，這

16、一過程稱為脫分化。第五節(jié) 海藻愈傷組織培養(yǎng)41一、愈傷組織的誘導(dǎo)形成 從一塊外植體或單個(gè)細(xì)胞形成愈傷組織大致要經(jīng)過3個(gè)時(shí)期：1、起動期 是指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。 用于接種的外植體的細(xì)胞，通常都是成熟細(xì)胞，處在靜止?fàn)顟B(tài)。起動期是通過一些刺激因素(如機(jī)械損傷、改變光照強(qiáng)度、增加氧等)和激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動加強(qiáng)，迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的合成。42生長物質(zhì)常用作誘導(dǎo)劑，高等植物的常用誘導(dǎo)劑有2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）和細(xì)胞分裂素等，其作用是使細(xì)胞立即進(jìn)入DNA復(fù)制以及全部細(xì)胞進(jìn)入S期（DNA合成期）并發(fā)生同步分裂。海藻的誘導(dǎo)期比較短，其對誘導(dǎo)劑也不十分

17、敏感。432、分裂期 是指外植體細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)以后脫分化，不斷分裂、增生子細(xì)胞的過程。外植體外層細(xì)胞開始細(xì)胞分裂，使細(xì)胞脫分化，形成薄壁分生組織。如果對這一期細(xì)胞不斷更換新鮮的培養(yǎng)基，則愈傷組織可以無限制地進(jìn)行分裂而維持不分化狀態(tài)。有些海藻外植體脫分化比較容易，有些比較難； 不同器官、不同部位外植體脫分化差異較大，幼嫩組織較易，而成熟組織和老化組織較難。處于分裂期的愈傷組織的特點(diǎn)是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明。443、形成期 分裂期后，細(xì)胞內(nèi)部開始發(fā)生一系列的形態(tài)和生理變化，導(dǎo)致分化出形態(tài)和功能不同的細(xì)胞。 一般愈傷組織的顏色是淺色、透明、有光澤，老化或污染后就變?yōu)楹稚蛏钌?，直到死亡?/p>

18、45二、影響愈傷組織生長分化的因素 由處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織再度分化形成不同類型細(xì)胞的過程稱為再分化。1、影響愈傷組織生長分化的內(nèi)在因素 外植體遺傳型 器官和部位 年齡 一般選擇較幼嫩的藻體或近頂端切段作為外植體462、影響愈傷組織生長分化的外部因素培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中的無機(jī)營養(yǎng)元素和有機(jī)成分，特別是生長素和激動素等生長物質(zhì)及其比例更起著重要作用；培養(yǎng)基的固體、半固體或液體狀態(tài)，對愈傷組織培養(yǎng)也有很大影響。47培養(yǎng)條件 主要是溫度、光照強(qiáng)度、光照周期、光質(zhì)以及振動頻率、通氣量等。溫度控制在1025之間，光源可采用日光燈或自然光線，每天光照約16h，光照強(qiáng)度為1540 molm-2s-1。藍(lán)光有利

19、于芽的分化；而紅光、遠(yuǎn)紅外光對芽的分化有抑制作用，但促進(jìn)根的分化；紫光對生芽有刺激作用。48激素一般來說，細(xì)胞分裂素有利于愈傷組織誘導(dǎo)形成；高比例的細(xì)胞分裂素/生長素的培養(yǎng)基易于形成芽；高比例的生長素/細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基易于形成根；由于分化與激素的關(guān)系同植物的遺傳性有著密切的關(guān)系，有時(shí)會出現(xiàn)相反的結(jié)果。49三、海藻組織塊愈傷組織的誘導(dǎo)大型海藻如海帶目中的某些種類具有較大和較厚的葉狀體，可以用打孔器穿透葉狀體而得到藻體組織的圓片。以此為外植體，可以獲得無菌的培養(yǎng)物并可誘導(dǎo)形成愈傷組織和再分化形成葉狀體?，F(xiàn)以狹葉海帶(Laminaria angustata)的孢子體為例介紹這一方法。 501儀器 培養(yǎng)箱，超凈臺，顯微鏡，打孔器(直徑3-5mm）數(shù)個(gè)，手術(shù)刀1把，三角瓶(100 mL)10個(gè)，酒精燈1個(gè)，其他小器具。512材料準(zhǔn)備 一般選用自然生長和人工培養(yǎng)的幼苗的生長部為材料。 可以從海邊采集海帶目海藻為材料(或其他大型海藻)。采集時(shí)，將藻體和固著器一起采回，將藻體表面的附著生物洗刷干凈，將莖部和葉狀體下部生長點(diǎn)部位留下，其余部位切除棄之。用滅菌海水對留下的藻體部分反復(fù)沖洗，備用。523培養(yǎng)基 狹葉海帶采用ASP12NTA培養(yǎng)基(ASP12NTA的組成是每100mL ASP12培養(yǎng)基中加10