納米級(jí)超順磁性氧化鐵的制備及其對(duì)小鼠急性毒性作用的觀察

1、納米級(jí)超順磁性氧化鐵的制備及其對(duì)小鼠急性毒性作用的觀察 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào) 文明;宋琳;柏瑋;李少林;李必波;9% 2007-10-20SPIO標(biāo)記的c-erbB2反義寡脫氧核苷酸探針研制及磁共振基因成像 重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 文明(導(dǎo)師：李少林)6% 2008-03-01 超順磁性Fe3O4納米粒的制備及其對(duì)小鼠的急性毒性作用張玉坤，羅 聰，朱朝敏（400014重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院什么科室？）摘要 目的：制備超順磁性Fe3O4納米粒（superparamagnetic Fe3O4 nanoparticle ,SPFN），探討其對(duì)小鼠的急性毒性作用。方法：采用化學(xué)共沉淀法制備SPF

2、N，應(yīng)用透射電鏡、Zeta 電位分析儀和振動(dòng)樣品磁場(chǎng)計(jì)等對(duì)SPFN進(jìn)行形態(tài)觀察和結(jié)構(gòu)表征測(cè)定。取60只小鼠按不同的給藥方式和劑量，隨機(jī)分為3組（n=20）：口服灌胃組（總劑量：2 104.8 mg/kg、容積：25 ml/kg），腹腔注射組（總劑量：1578.6mg/kg、容積：20ml/kg），尾靜脈注射組（總劑量：438.5 mg/kg、容積：10 ml/kg）；每組另取10只小鼠按相應(yīng)方式（口服灌胃、腹腔注射和尾靜脈注射）給予等量生理鹽水作為對(duì)照（n=10）。觀察小鼠的一般情況；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠主要血生化指標(biāo)；HE染色觀察主要臟器的病理改變；Wright染色觀察骨髓組織。結(jié)果：制

3、成粒徑大小為1520 nm, 飽和磁化強(qiáng)度為21.431 emu/g,剩余磁化強(qiáng)度為0.101 6 emu/g的SPFN。予SPFN 2周后，各組小鼠均未死亡，血生化指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），主要臟器和骨髓均未見(jiàn)炎癥、水腫、變性、壞死等改變。結(jié)論：成功制備超順磁性Fe3O4納米粒；自制超順磁性Fe3O4納米粒對(duì)小鼠無(wú)明顯急性毒性。關(guān)鍵詞 超順磁性；納米粒；急性毒性Preparation of Superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles and their acute toxicity on miceZhang Yukun, Luo Cong, Zhu C

4、haomin ( Childrens Hospital of Chongqing Medical University, 400014)Abstract Objective: To prepare superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles (SPFN) and to study their acute toxicity on mice. Methods: The SPFNs were obtained by means of chemical coprecipitation,and their morphology and structural charact

5、erization were observed and determined by transmission electron microscope, Zeta potential analyzer, and vibratory sample magnetometer, etc. According to different ways and dosage of the drug 60 mice were randomly divided into oral administration (with a total dose of 2000 mg/ kg and a volume of 25

6、ml/ kg, n = 20), intraperitoneal injection (with a total dose of 1625 mg/ kg and a volume of 20 ml/ kg, n = 20) and caudal vein injection (with a total dose of 438. 5 mg/ kg and a volume of 10 ml/ kg, n = 20) groups. Another 10 mice in each group receiving the same dose of normal saline via the same

7、 pathway served as the controls ( n = 10). The general condition of mice was observed during the experiment, the major blood biochemical indicators were analysed by the automatic biochemical analyzer, and the pathological changes of major organs and the myeloid tissue were observed by H-E staining a

8、nd Wright staining respectively. Results: We have prepared SPFNs with the particle diameter 15-20 nm , a saturated magnetization of 21.431 emu/g, and a remanent magnetization of 0.1016 emu/g. There was no death of mice during the observation. There was no significant difference in blood biochemical

9、indicators between mice of different groups and between each experiment group and their corresponding control group. No inflammation, edema, degeneration and necrosis were seen in the major organs and the bone marrow. Conclusion: We have successfully prepared SPFNs that cause no acute toxicity on mi

10、ce, which warrants further study on their role as a carrier in clinical application of carrier-attached drugs.Key Words superparamagnetism；nanoparticles；acute toxicity請(qǐng)?jiān)诖搜a(bǔ)充基金的英文 和通信作者的英文（請(qǐng)核對(duì)第一個(gè)基金名稱(chēng)是否夠準(zhǔn)確？）超順磁性納米粒具有比表面積和磁效應(yīng)等性質(zhì)，可作為一種主動(dòng)、被動(dòng)靶向?yàn)橐惑w的制劑1-2。當(dāng)Fe3O4納米粒的粒徑達(dá)30 nm以下時(shí)，其顆粒間的振動(dòng)能足以克服磁吸引力，呈現(xiàn)超順磁性3。Fe3O4納

11、米粒最終能排除體外，是理想的醫(yī)用磁性微粒4-5。超順磁性Fe3O4納米粒（superparamagnetic Fe3O4 nanoparticle ,SPFN）屬于親水性基質(zhì)磁性液體，稱(chēng)為磁流體。既具有磁性，又具有液體的流動(dòng)性；在外加磁場(chǎng)作用下，磁流體的流向及流速可以控制，即具有可控性；此外，磁流體還可以將電磁能轉(zhuǎn)化為熱能。正是由于這些特性，F(xiàn)e3O4磁流體在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。例如化療藥物磁性微球的靶向治療6，磁控血管內(nèi)磁微球栓塞7等，但其生物安全性還未明確。本研究采用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性Fe3O4納米粒。在3種不同的給藥方式下，觀察小鼠主要臟器的病理變化，檢測(cè)血生化指標(biāo)，從而

12、評(píng)價(jià)其急性毒性，旨在為其作為載體載附藥物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 ADE EV11振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì),美國(guó)ADE Technologise公司；DENVER INSTRUMENT電子天平,北京賽多利斯儀器系列有限公司；Hitachi-600型透射電子顯微鏡，日本日立公司；BMJ-B型包埋機(jī)、BMJ-B型病理組織包埋冷凍臺(tái)、Leica 2065石蠟切片機(jī)、PHT-漂烤儀，常州市中威電子儀器有限公司；硫酸亞鐵銨，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；硫酸鐵銨，重慶博藝化學(xué)試劑有限公司；油酸鈉，中國(guó)醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；染色試劑（H-E,Wright染色），均有實(shí)驗(yàn)室自備。1.2方法

13、1.2.1 超順磁性Fe3O4納米粒的制備及理化指標(biāo)的測(cè)定 采用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性Fe3O4納米粒。具體方法如下：將100 ml 6 mol/L的NaOH與100 ml 1%的油酸鈉溶液混合，配置成A液，將適量的硫酸鐵銨和硫酸亞鐵銨混合，溶于200 ml 3%的油酸鈉溶液中配置成B液。將B液移入三角燒瓶中，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，快速攪拌（500 r/min），加熱至55 后，滴入A液，降低攪拌速度（150 r/min），水浴30min（85），制成超順磁性Fe3O4納米粒混懸液。用虹吸法處理超順磁性Fe3O4納米粒混懸液，棄去上層澄清液，加蒸餾水重復(fù)洗滌，直至pH為78，充氮?dú)獗４?。取適量樣品，用

14、透射電鏡、Zeta 電位分析儀和振動(dòng)樣品磁場(chǎng)計(jì)檢測(cè)其Fe3O4 核心粒徑、平均粒徑和飽和磁化強(qiáng)度相關(guān)理化指標(biāo)。1. 2. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供SPF級(jí)昆明小鼠。取90只小鼠（6周齡），雌雄各半，體質(zhì)量（182）g作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。隨機(jī)選取60只小鼠，按給藥方式和劑量不同，隨機(jī)分為口服灌胃、腹腔注射、尾靜脈注射3組，每組20只。采用最大耐藥量給藥8。口服灌胃組總劑量2 104.8 mg/kg，給藥容積25 ml/kg，24 h內(nèi)分2次給藥（9:00 a.m,14:00 p.m）；腹腔注射組總劑量1578.6 mg/kg,給藥容積20 ml/kg,24 h內(nèi)分2次給藥（9

15、:00 a.m,14:00 p.m）；尾靜脈注射組總劑量438.5mg/kg，給藥容積10ml/kg，一次性給藥0.2 ml。各組另取10只小鼠按相應(yīng)方式（口服灌胃、腹腔注射和尾靜脈注射）給予等量生理鹽水作為對(duì)照（n=10）。實(shí)驗(yàn)中昆明小鼠均在相同環(huán)境下喂養(yǎng)。1.2.4一般情況觀察 飼養(yǎng)期間每日觀察并記錄小鼠的飲食及活動(dòng)情況，有無(wú)腹瀉、嗜睡、體質(zhì)量的增減和死亡等。1.2.5小鼠生化指標(biāo)的測(cè)定 給藥2周后，摘眼球取血，3 000 r/min離心5 min，吸取血清，用Beckman全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)主要生化指標(biāo)：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(CREA )、尿素氮(BU

16、N)、尿酸 (URCA)、總膽紅素( TBIL )、總膽汁酸( TBA)。1.2.6小鼠各臟器病理變化 給藥2周后，處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎，觀察臟器顏色、形態(tài)，計(jì)算各臟器系數(shù)（90只小鼠）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)樣本估計(jì)，在每組中隨機(jī)抽取5只小鼠，取心、肝、脾、肺、腎HE染色做病理組織學(xué)檢查；取骨髓組織Wright染色觀察細(xì)胞有無(wú)水腫、變性、壞死等。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多變量分析的Hotelling T2檢驗(yàn)，計(jì)量指標(biāo)以s表示。2. 結(jié)果2.1 超順磁性Fe3O4納米粒的理化特性 透射電鏡觀察核心粒徑大小為1520 nm, 飽和磁化強(qiáng)度為21.431 emu/g,剩余磁化

17、強(qiáng)度為0.1016 emu/g, Zeta電位分析儀測(cè)的其平均粒徑為298.6 nm，結(jié)果顯示所制備的樣品符合超順磁性納米粒的要求。見(jiàn)圖1？ 圖1 SPFN透射電鏡圖 圖2 SPFN樣品的磁化曲線2.2一般情況觀察 3種方式給藥后連續(xù)飼養(yǎng)2周，小鼠均未出現(xiàn)死亡；口服灌胃組給藥后第1天3只小鼠出現(xiàn)輕微腹瀉，2只小鼠嗜睡，；腹腔注射組給藥第1天有7只出現(xiàn)易驚恐煩躁、呼吸急促，2只腹瀉；尾靜脈注射組小鼠，3只小鼠出現(xiàn)煩躁驚恐，呼吸急促。對(duì)照組均無(wú)腹瀉，無(wú)嗜睡，次日全部恢復(fù)正常。2.3主要血生化指標(biāo)的觀察 在3種給藥方式中，超順磁性Fe3O4納米粒對(duì)小鼠主要生化指標(biāo)的影響不明顯，各對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較亦

18、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，實(shí)驗(yàn)組之間比較亦無(wú)明顯差異(P0.05)。見(jiàn)表1。表1 各組小鼠血清主要生化指標(biāo)的測(cè)定S生化 口服灌胃 腹腔注射 靜脈注射指標(biāo) 生理鹽水 SPFN 生理鹽水 SPFN 生理鹽水 SPFN (n=10) (n=20) (n=10) (n=20) (n=10) (n=20)ALT(U/L) 40.436.88 40.215.40 39.214.33 41.204.25 38.465.82 41.244.28AST(U/L) 143.458.56 150.39.12 140.608.23 143.428.63 143.269.31 141.509.56BUN(mmol/L

19、) 8.44 0.35 8.570.43 8.600.48 8.520.51 8.690.71 8.730.60CREA(mol/L) 9.310.40 9.650.76 9.200.23 9.460.56 9.210.46 9.290.79URCA(mol/L) 141.457.31 140.107.25 145.166.31 144.396.91 143.106.31 143.526.65TBA(mol/L) 24.162.12 24.562.31 23.892.47 24.382.56 24.762.69 24.332.57TBIL(mol/L) 1.850.06 1.840.14 1.

20、890.11 1.870.13 1.900.09 1.810.152.4 主要臟器的病理觀察 解剖小鼠后取臟器觀察，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃腸、骨髓等組織顏色、形態(tài)等均未見(jiàn)顯著異常;各實(shí)驗(yàn)組間及其對(duì)照組小鼠的臟器系數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05，表2）。表2 各組小鼠的主要臟器系數(shù)S器官 口服灌胃 腹腔注射 靜脈注射生理鹽水 SPFN 生理鹽水 SPFN 生理鹽水 SPFN (n=10) (n=20) (n=10) (n=20) (n=10) (n=20)心 3.340.58 3.560.91 3.460.63 3.310.46 3.610.58 3.420.91肝 30.90

21、2. 35 31.612.62 31.512.56 31.492.44 31.611.98 30.103.21脾 4.480.91 4.720.71 4.560.91 4.460.68 4.650.61 4.340.89肺 2.850.0.68 2.860.98 2.910.60 2.930.71 2.730.91 2.920.83腎 7.770.97 7.760.86 7.850.79 8.021.01 7.8400.78 7.890.84實(shí)驗(yàn)組與與對(duì)照組主要臟器心、肝、脾、肺、腎的HE染色及骨髓Wright染色對(duì)比觀察發(fā)現(xiàn)：各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎和骨髓均無(wú)水腫、變性、壞死等異常改變。

22、見(jiàn)圖3。 A：口服灌胃組心臟 (HE400)； B： 腹腔注射組肝臟(HE400)；C：靜脈注射組脾臟(HE400)； D：靜脈注射組肺臟(HE400)；E：腹腔注射組腎臟(HE400)；F：靜脈注射組骨髓組織(Wright1 000)； a、b、c、d、e、f 是與A、B、C、D、E、F相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組器官組織圖3 實(shí)驗(yàn)組小鼠心、肝、脾、肺、腎組織HE染色及骨髓Wright染色3討論 本研究制備的SPFN是用油酸納（分散劑）將納米級(jí)Fe3O4顆粒均勻分散于水相中形成穩(wěn)定的膠態(tài)懸浮液，SPFN的核心粒徑為1520 nm，此時(shí)其振動(dòng)能足以克服磁吸引力，呈現(xiàn)超順磁性，具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性，在無(wú)外加磁場(chǎng)

23、時(shí)磁性能很快消失。在外加磁場(chǎng)的作用下，可以載附藥物使其濃集于靶組織，具有局部靶向作用。并且本研究制備的超順磁性Fe3O4納米粒采用化學(xué)共沉淀法，步驟簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉。經(jīng)檢測(cè)其理化性質(zhì)及磁理學(xué)性質(zhì)可以滿(mǎn)足作為載體載附藥物的磁性微球制備的要求，這為各種腫瘤和結(jié)核性腦膜炎等疾病的治療帶來(lái)了新的契機(jī)和希望。 納米粒子的超微性使得納米材料更易被人體吸收，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)9-10。一般而言，納米材料進(jìn)入人體主要通過(guò)呼吸道吸入，胃腸道攝入，或透過(guò)皮膚吸收。研究表明11納米粒子可通過(guò)被動(dòng)轉(zhuǎn)移、載體介導(dǎo)或者吞噬作用透過(guò)血腦屏障，但毒性物質(zhì)也可能通過(guò)這些途徑進(jìn)入腦組織，所以需要對(duì)納米材料進(jìn)行全面的安全評(píng)價(jià)。超順磁性Fe3O4納米粒是各類(lèi)化學(xué)物質(zhì)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)獲得，因此其是否有毒性還未可知。所以在本課題組研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)對(duì)SPFN的急性毒理學(xué)進(jìn)行研究，為其應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。 任何一種新藥在推薦臨床試用前必須進(jìn)行周密、細(xì)致、認(rèn)真的毒性研究，而急性毒理試驗(yàn)是藥物安全評(píng)價(jià)的第一道關(guān)卡。急性毒理試驗(yàn)是指機(jī)體一次或短時(shí)間內(nèi)（24 h）多次接受大劑量某種藥物后所產(chǎn)生的快速而劇烈的中毒反應(yīng)，包括死亡。評(píng)價(jià)藥物的急性