沉淀分離法和具體應用

1、沉淀分離法和具體應用固相析出分離技術(shù) 1.概念： 通過加入某種試劑或改變?nèi)芤簵l件，使生化產(chǎn)物以固體形式從溶液中沉淀析出的分離純化技術(shù)。 2.種類結(jié)晶法：析出物為晶體沉淀法：析出物為無定形固體 3.沉淀和結(jié)晶（晶體）的異同點 ：在本質(zhì)上同屬一種過程（固相析出） 晶體：有規(guī)則無定形沉淀：無規(guī)則構(gòu)成單位（原子、離子或分子）的排列方式不同 條件緩慢變化時，溶質(zhì)分子有足夠時間排列，有利于結(jié)晶形成； 條件變化劇烈，強迫快速析出，溶質(zhì)分子來不及排列就析出，形成無定形沉淀。區(qū)別： 結(jié)晶法：高度的選擇性（原因：只有同類分子 或離子才能排列成晶體）。沉淀法：濃縮與分離，但所得的沉淀物聚集多 種物質(zhì)，或含有鹽類，或

2、包裹著溶劑。分離效果 沉淀法： 利用某種沉淀劑或改變條件，使所需提取的物質(zhì)或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。 具有濃縮和分離的雙重作用。 在蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸和其他細胞組分的回收和分離中應用的很多。鹽析沉淀法有機溶劑沉淀等電點沉淀法成鹽沉淀法高分子聚合物沉淀選擇性變性沉淀法 一、鹽析沉淀法 鹽析法： 在高濃度中性鹽存在下，欲分離物質(zhì)在中性鹽水溶液中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀。 早在19世紀鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質(zhì)，目前該方法仍廣泛用來回收或分離蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)。 （一）基本原理 蛋白質(zhì)的溶解特性取決于其組成、構(gòu)象、周圍環(huán)境的物理化學性質(zhì)以及溶劑的可利用度

3、。 這些性質(zhì)就本質(zhì)而言是水分子間的氫鍵和蛋白質(zhì)表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液溫度、pH值、介電常數(shù)和離子強度等參數(shù)的影響。 蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的， 表面：大部分是親水基團 內(nèi)部：大部分是疏水基團蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀態(tài)兩性物質(zhì)，一定pH下表面帶有一定的電荷，靜電斥力作用使分子間相互排斥蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，在表面形成水化膜，這一層能保護蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。 當向蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽時：低鹽-鹽溶(低鹽情況下，隨著中性鹽離子強度的增加，蛋白質(zhì)溶解度增大)高鹽-鹽析(高鹽濃度時，蛋白質(zhì)溶解度隨之減小)鹽離子部分中和蛋白質(zhì)的電性，使分子間排斥作用減弱中性鹽的

4、親水性比蛋白質(zhì)大，鹽離子在水中發(fā)生水化作用從而使蛋白質(zhì)脫去水化膜，暴露出疏水區(qū)域H+OH-+pHpI,帶負電，有水膜，是穩(wěn)定的親水膠體_+_pH=pI時, 有水膜，是不穩(wěn)定的親水膠體中性鹽破壞水膜+中性鹽破壞水膜_+_中性鹽破壞水膜_中性鹽中和電荷SO42-中性鹽中和電荷NH4+或Na+蛋白質(zhì)的鹽析機制示意圖蛋白質(zhì)沉淀 蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關，還與離子所帶電荷數(shù)有關，高價離子影響更顯著。 通常用離子強度表示對鹽析的影響。1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5碳氧血紅蛋白的lgS與(NH4)2SO4離子強度的關系S0(離子強度)l

5、gS鹽析鹽溶鹽析區(qū):lgS = - Ks 蛋白質(zhì)溶解度常數(shù)鹽析常數(shù)鹽離子強度蛋白質(zhì)溶解度起始蛋白濃度 （二）無機鹽的選擇 在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的鹽析劑有(NH4)2SO4, Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4, K3PO4。(NH4)2SO4原因廉價在水中溶解度大，且溶解度隨溫度變化小，低溫下仍具有較大的溶解度對大多數(shù)蛋白質(zhì)的活力無損害0 20 40 60 80 100中性鹽溫度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.6 75.4 81.0 88.0 95.3 1034.9 18.9 48.3 45.3 43.3 42.2 - 34

6、.5 44.4 54.6 63.6 70.81.6 7.8 54.1 82.6 93.8 101 常用鹽析劑在水中的溶解度（g/100ml水）鹽析效果：陰離子 陽離子尤其以高價陰離子更為明顯。常見陰離子的鹽析作用順序：PO43- SO42- CH3COO Cl NO3 ClO4 I SCN陽離子對鹽析效果的影響：Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+無機鹽可按兩種方式加入溶液中：直接加入固體(NH4)2SO4粉末工業(yè)生產(chǎn) (分批加入，充分攪拌)加入(NH4)2SO4飽和溶液實驗室和小規(guī)模生產(chǎn) (防止溶液局部過濃，但加量較多時溶液會被稀釋)

7、（三）影響鹽析的各種因素 無機鹽的加入量蛋白質(zhì)的濃度溫度pH操作方式1.無機鹽加入量的影響1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5S0(離子強度)lgS鹽析蛋白質(zhì)溶解度0 2 4 6 8 10-0.500.50-1.00(離子強度)lgS蛋白質(zhì)溶解度 0不同蛋白質(zhì)溶解度與離子強度的關系蛋白質(zhì)種類不同，鹽析所用的無機鹽量也不同 對于特定的蛋白質(zhì)，一定操作條件下產(chǎn)生沉淀時的無機鹽濃度范圍都是一定的，即具有一定的蛋白質(zhì)鹽析分布曲線。 30lgS蛋白質(zhì)溶解度20 30 40 50 60 702040100P不同(NH4)2SO4 飽和度C0蛋白質(zhì)沉淀的速度可用

8、- 對鹽飽和度（P）作圖來表示：dSdP 620 30 40 50 60 704820dSdP 蛋白質(zhì)溶解度隨(NH4)2SO4 飽和度而變化的速率P利用不同蛋白質(zhì)鹽析分布曲線在橫軸上的位置不同，可采取先后加入不同量無機鹽的辦法來分級沉淀蛋白質(zhì)。2.蛋白質(zhì)濃度的影響 蛋白質(zhì)濃度不同，沉淀所需無機鹽用量也不同。 隨濃度提高，鹽用量減少。 640 50 60 70 804820dSdP P不同濃度碳氧肌紅蛋白的鹽析分布曲線3g/L30g/L分級沉淀：將溶液稀釋，使重疊曲線拉開距離制取成品：提高蛋白質(zhì)濃度3.溫度的影響低鹽濃度：溫度升高，溶解度升高高鹽濃度：溫度升高，溶解度降低 溫度適當提高有利于蛋

9、白質(zhì)沉淀。 高溫容易導致蛋白質(zhì)變性。 蛋白質(zhì)鹽析一般在室溫下進行，某些溫度敏感性的蛋白質(zhì)鹽析最好在低溫下進行。的影響 蛋白質(zhì)在pI時的溶解度最小，最容易從溶液中析出，因此選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)的pI附近。 耗鹽少，蛋白質(zhì)收率也高 5.操作方式的影響 10 50 60 70 飽和度（%）51 酶活性 U/ml操作方式對延胡索酸酶鹽析的影響固體，間歇12h飽和溶液，間歇12h飽和溶液，連續(xù)12h飽和溶液，連續(xù)1.6min采用間歇方式所需鹽量比連續(xù)方式少；間歇操作中，用飽和溶液的需鹽量比用固體鹽的高。 6.鹽析法的優(yōu)缺點（1）優(yōu)點： 室溫下沉淀物在硫酸銨鹽析溶液中長時間放置不會失活，且無機鹽不容易引起

10、蛋白質(zhì)變性失活； 非蛋白的雜質(zhì)很少被夾帶沉淀； 適用范圍廣，幾乎所有蛋白質(zhì)和酶都能采用 設備簡單，操作方便。 （2）缺點： 沉淀物中含有大量鹽析劑 硫酸銨容易分解產(chǎn)生氨的惡臭味，產(chǎn)品不能直接用于醫(yī)藥上 鹽析法可以作為初始的提取方法，再與多種精制手段結(jié)合起來，如采用超濾、凝膠色譜、透析等方法將無機鹽去除，就可制得高純度產(chǎn)品。 二、有機溶劑沉淀法 在蛋白質(zhì)等生物大分子的水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，能顯著降低蛋白質(zhì)等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。 不同蛋白質(zhì)沉淀時所需有機溶劑的濃度不同，因此調(diào)節(jié)有機溶劑的濃度，可以使混合物中的蛋白質(zhì)分段析出，達到分離純化的目的。 不僅適于蛋白質(zhì)的分離純化

11、，還常用于酶、核酸、多糖等的分離純化。 （一）基本原理 加入有機溶劑后，會使系統(tǒng)（水和有機溶劑的混合液）的介電常數(shù)減小，而使溶質(zhì)分子（如蛋白質(zhì)分子）之間的靜電引力增加，從而促使它們互相聚集，并沉淀出來。水溶性有機溶劑的親水性強，它會搶奪本來與溶質(zhì)結(jié)合的自由水，使其表面的水化層破壞，導致溶質(zhì)分子之間的相互作用增大而發(fā)生凝聚，沉淀析出。 常用于生物大分子沉淀的有機溶劑： 甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工業(yè)上最常用的 （二）影響沉淀效果的因素 溫度pH中性鹽濃度金屬離子1.溫度的影響 有機溶劑存在下，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著的減小，因此低溫下（最好低于0oC）沉淀得完全，有機溶劑

12、用量可減少。 實際操作中： 有機溶劑與水混合時，會放出大量的熱量，使溶液的溫度顯著升高，從而增加對蛋白質(zhì)的變性作用。 整個操作過程應在低溫下進行。 具體操作時： 將待分離溶液和有機溶劑分別進行預冷： 蛋白質(zhì)溶液冷卻到0oC左右， 有機溶劑預冷到-10oC以下 為避免溫度驟然升高損失蛋白質(zhì)活力，操作時應不斷攪拌、少量多次加入。 使沉淀在低溫下短時間處理后即進行過濾或離心分離，接著真空抽去剩余溶液或?qū)⒊恋砣苋氪罅烤彌_溶液中以稀釋有機溶劑，旨在減少有機溶劑與目的物的接觸。 溫度的控制應根據(jù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而不同，穩(wěn)定性較差的物質(zhì)，冷卻至低溫是必要的；但對于穩(wěn)定性較好的物質(zhì)，如淀粉酶，溫度不需過低，10

13、-15oC。的影響 在等電點時蛋白質(zhì)溶解度最低，因此有機溶劑沉淀時溶液pH多控制在蛋白質(zhì)等電點附近。 pH的控制必須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性： 某些酶的等電點在pH4-5之間，比其穩(wěn)定的pH范圍低，因此pH應首先滿足蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件。 控制pH時應使大多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶相同電荷，不要讓目的物與主要雜質(zhì)分子帶相反電荷，以免共沉。 3.無機鹽的離子強度 少量的中性鹽能夠減少蛋白質(zhì)變性。在有機溶劑沉淀時中性鹽濃度以0.01-0.05 mol/L為宜。 常用中性鹽: 乙酸鈉、乙酸銨、氯化鈉 中性鹽濃度較高時（0.2 mol/L以上），由于鹽溶作用會增大蛋白質(zhì)的溶解度，此時需增加有機溶劑的用量才能使沉淀析出。

14、 對鹽析后的上清液或沉淀物，如進一步用有機溶劑沉淀法純化，必須先脫鹽。4.金屬離子 一些金屬離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，使蛋白質(zhì)溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并減少有機溶劑用量。 使用時避免能與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子存在（如磷酸根）。 常用的鋅鹽：醋酸鋅或硫酸鋅5.有機溶劑沉淀法的優(yōu)缺點（1）優(yōu)點： 乙醇等有機溶劑易揮發(fā)除去，不會殘留于成品中，產(chǎn)品更純凈（不需要脫鹽處理）； 有機溶劑密度低，沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易，適于用離心分離收集沉淀物。（2）缺點： 容易使蛋白質(zhì)變性，操作需要在低溫下進行，使用上有一定的局限； 采用大量有機溶劑

15、，成本較高。 為節(jié)省用量，通常將蛋白質(zhì)溶液適當濃縮，并回收溶劑。 有機溶劑易燃易爆，工業(yè)生產(chǎn)上車間和設備都應有防護措施。等電點沉淀法成鹽沉淀法高分子聚合物沉淀選擇性變性沉淀法 三、其他沉淀方法 1.等電點沉淀法 兩性物質(zhì)在pH=pI時，分子表面凈電荷為零，分子間靜電排斥作用減弱，因此吸引力增大，能相互聚集，發(fā)生沉淀。 不同的兩性物質(zhì)，pI不同，如不同蛋白質(zhì)。根據(jù)這一特性，用依次改變?nèi)芤簆H的方法可將不同的蛋白質(zhì)分別沉淀析出，達到分離純化的目的。 只適用于水化程度不大、在pI時溶解度很低的兩性物質(zhì)，如酪蛋白。 對于親水性很強的兩性物質(zhì)，在pI及pI附近仍有相當?shù)娜芙舛?，用該法沉淀不完全，而且許多

16、生物分子的pI很接近，因此很少單獨使用。 往往與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法結(jié)合起來。 采用該法時必須注意： 溶液pH不會影響到目的物質(zhì)的穩(wěn)定性。 等電點沉淀法可用于所需物質(zhì)的提取，也可用于沉淀除去雜蛋白及其他雜質(zhì)，實際工作中普遍采用該方法作為去雜手段。 如在工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時： 先調(diào)pH至去除堿性雜蛋白，再調(diào)pH至去除酸性雜蛋白。粗酶液經(jīng)過這樣的處理后純度大大提高，有利于后面的操作。 2.成鹽沉淀法 某些生化物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、抗生素等）能和重金屬、某些有機酸及無機酸形成難溶性的鹽類復合物而沉淀。金屬離子沉淀法有機酸沉淀法無機酸沉淀法注意：形成復合鹽后，常使蛋白質(zhì)發(fā)生

17、不可逆的沉淀，應用時必須謹慎。 （1）金屬離子沉淀法 許多有機物（包括蛋白質(zhì)）在堿性溶液中帶負電荷，因此能與金屬離子形成金屬復合鹽沉淀。 根據(jù)與有機物作用的機制不同，可將金屬離子分為三類： 能與羧基、含氮化合物和含氮雜環(huán)化合物結(jié)合，如Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+等 能與羧基結(jié)合，但不能與含氮化合物結(jié)合，如Ca2+, Ba2+, Mg2+, Pb2+等 能與巰基結(jié)合，如Hg2+, Ag+, Pb2+等 分離出沉淀物后，如何去除金屬離子？ 可用H2S使金屬變成硫化物而除去，也可采用離子交換法或金屬螯合劑EDTA等將金屬離子除去。 金屬離子沉淀法除提取生化物質(zhì)

18、外，還能用于沉淀去除雜質(zhì)： 如錳鹽能選擇性的沉淀發(fā)酵液中的核酸，降低發(fā)酵液黏度，以利于后續(xù)操作；ZnSO4能沉淀紅霉素發(fā)酵液中的雜蛋白以提高過濾速度。 （2）有機酸沉淀法 （有機酸：具有酸性的有機化合物） 某些有機酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸和三氯乙酸等，能與有機分子的堿性功能團形成復合物而沉淀析出。 這些有機酸與蛋白質(zhì)形成鹽復合物沉淀時，常發(fā)生不可逆的沉淀反應，所以用此法制備蛋白質(zhì)和酶時，需采用較溫和的條件，有時還加入一定的穩(wěn)定劑，以防止蛋白質(zhì)變性。 鞣酸（單寧）多元酚類化合物 分子上有羧基和多個羥基， 蛋白質(zhì)分子中有氨基、亞氨基和羧基，所以可與單寧分子形成為數(shù)眾多的氫鍵而結(jié)合在一起，生成巨大的

19、復合顆粒而沉淀下來。 如何使蛋白質(zhì)游離釋放出來？ 單寧與蛋白質(zhì)的結(jié)合比較牢固，不易分開，多采用競爭結(jié)合法：用比蛋白質(zhì)更強的結(jié)合劑與單寧結(jié)合，競爭性結(jié)合劑有PVP（與單寧形成氫鍵的能力很強），聚乙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇甘油酸酯 三氯乙酸（TCA） 沉淀蛋白質(zhì)迅速且完全，一般會引起變性。 低溫下短時間作用可使某些較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或酶保持原有活力，多用于目的物較穩(wěn)定且分離雜蛋白相對困難的場合。 雷凡諾吖啶染料 沉淀機制比一般有機酸鹽復雜，但與蛋白質(zhì)作用也主要是通過形成鹽的復合物而沉淀的。 提純血漿中-球蛋白有較好效果。 （3）無機酸沉淀法 （無機酸：能解離出氫離子的無機化合物，如硫酸、鹽酸、硝酸、

20、次氯酸等； 有機酸：具有酸性的有機化合物，最常見是羧酸） 某些無機酸如磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽離子形式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復合鹽，使蛋白質(zhì)沉淀析出。 無機酸如何去除？ 得到沉淀物后，可在沉淀物中加入無機酸并用乙醚萃取，把磷鎢酸、磷鉬酸等移入乙醚中除去；或用離子交換法除去。 3.高分子聚合物沉淀 某些水溶性的非離子型高分子聚合物是20世紀60年代發(fā)展起來的沉淀劑，近年來被廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)和酶的分離純化，包括不同分子量的聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等。 應用最多的是PEG，原因：無毒，對成品影響小 （1）用水溶性非離子聚合物沉淀生物大分子和顆粒的兩種方法： 選用兩種水

21、溶性非離子多聚物組成液-液兩相系統(tǒng)，使生物大分子或顆粒在兩相系統(tǒng)中不等量分配，進行分離。 機理：不同生物分子和顆粒表面結(jié)構(gòu)不同，有不同分配系數(shù)；且外加離子強度、pH和溫度等的影響，提高分離效果。 選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子或顆粒在同一液相中，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。 （2）PEG的沉淀 機理 勞蘭梯提出：通過空間位置排斥，使液體中的生物大分子、病毒和細菌等微粒被迫擠聚在一起而引起沉淀的發(fā)生。 影響因素 PEG濃度：PEG相對分子質(zhì)量：離子強度：蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量：pH：溫度：與溶液中鹽的濃度成反比越接近蛋白質(zhì)的pI，所需PEG濃度越低高分子量的PEG沉淀效果較好分子量越高，PEG越少 優(yōu)缺點 優(yōu)點：無毒，對成品影響小，所以廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、酶等的沉淀分離。 缺點：