(優(yōu)選)細胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用課件

1、（優(yōu)選）細胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用第一節(jié)細胞培養(yǎng)技術(shù)概述瓶子中的細胞細胞培養(yǎng)：將組織分散成單細胞，使其在類似于體內(nèi)生存環(huán)境、適宜的體外條件下的生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)與功能的技術(shù)。培養(yǎng)過程中細胞不再形成組織。培養(yǎng)對象（培養(yǎng)物）是單個細胞（群）。（1）概念類似、內(nèi)涵相近（2）培養(yǎng)對象、培養(yǎng)物的差異（3）二者無嚴格的界限，可以相互轉(zhuǎn)化辨別：細胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)的區(qū)別和聯(lián)系？動物細胞培養(yǎng) 植物細胞培養(yǎng)（1）技術(shù)的難度（2）專業(yè)的切合角度（3）關(guān)注熱度和應(yīng)用價值課程內(nèi)容微生物細胞培養(yǎng)營養(yǎng)要求復(fù)雜、培養(yǎng)條件嚴格培養(yǎng)的細胞容易發(fā)生變化培養(yǎng)與真實的生存環(huán)境有差異簡化生長環(huán)境、方便控制因素細胞群均一性好、大量、成本低大規(guī)

2、模生產(chǎn)生物制品細胞培養(yǎng)的利與弊細胞培養(yǎng)細胞工程細胞培養(yǎng)與細胞工程的關(guān)系細胞培養(yǎng)細胞工程細胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)各環(huán)節(jié)中承上啟下的紐帶。細胞培養(yǎng)細胞工程細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞工程的最基礎(chǔ)、最核心的技術(shù)。細胞培養(yǎng)細胞工程用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論方法，按照人們的設(shè)計，通過細胞水平上的操作，定向改造細胞或生物體、創(chuàng)造新種、加速繁育、獲得產(chǎn)物。細胞培養(yǎng)細胞融合 細胞器/核移植基因轉(zhuǎn)移染色體操作細胞培養(yǎng)細胞工程通過人工培養(yǎng)獲得細胞或細胞代謝產(chǎn)物細胞培養(yǎng)細胞工程獲得具有新遺傳特性或特定屬性的產(chǎn)物、組織或生物體細胞培養(yǎng)細胞工程細胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)各環(huán)節(jié)中承上啟下的紐帶。核移植、細胞培養(yǎng)、細胞融合、胚胎發(fā)育綜

3、合應(yīng)用克隆羊細胞培養(yǎng)細胞工程無限細胞系、細胞融合、細胞免疫的綜合應(yīng)用細胞培養(yǎng)細胞工程染色體技術(shù)、細胞培養(yǎng)的綜合應(yīng)用多倍體育種動物細胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史1907年：哈里森（Harrison），蛙胚神經(jīng)組織，單玻片懸滴培養(yǎng)法創(chuàng)始人。1923年，卡雷爾（Carrel），卡氏瓶培養(yǎng)法，細胞組織生存空間的開拓者。1951年， 厄爾（Eagle） ，體外培養(yǎng)動物細胞的人工合成培養(yǎng)基開發(fā)者。 波米拉（Pomerat），懸浮培養(yǎng)。1957年，杜爾貝科（Dulbecco），胰蛋白酶消化單層細胞培養(yǎng)法先行者。動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用動物育種生物制品生產(chǎn)生物基礎(chǔ)研究臨床醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)診斷與治療（1）疾病診斷（2）細胞植入治療羊

4、膜穿刺術(shù) 地中海貧血骨髓細胞（3）藥物效應(yīng)檢測動物篩選細胞篩選高效、經(jīng)濟、特異性檢測有毒物質(zhì),把致癌、致畸形的物質(zhì)加入培養(yǎng)液，對培養(yǎng)出的細胞進行染色體的檢驗,進而推斷物質(zhì)的毒性；生物制品的生產(chǎn)夢想現(xiàn)實OR？疫苗激素干擾素單克隆抗體這些都已經(jīng)成為現(xiàn)實動物細胞作為表達宿主，可生產(chǎn)蛋白質(zhì)類的生物制品，病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體 ；魚類病毒學(xué)：病毒的分離、鑒定以及病毒疫苗的制備魚類細胞毒理學(xué)：評價樣品對魚類細胞的毒性等水產(chǎn)生物基礎(chǔ)理論魚類免疫學(xué)細胞培養(yǎng)在水產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用第二節(jié)細胞培養(yǎng)的細胞生物學(xué)知識細胞的發(fā)現(xiàn) 英國科學(xué)家胡克（R.Hook,1635-1703),27歲成為英國皇家學(xué)會領(lǐng)導(dǎo)成員, 發(fā)表對

5、木栓的觀察，命名Cell。荷蘭人列文虎克（Antoni von Leeuwenhoek,1623-1723）用自磨鏡片做成顯微鏡第一次觀察了活的細菌和原生動物。19世紀中期細胞學(xué)說建立施萊登施旺19世紀中期細胞學(xué)說建立施萊登施旺細胞學(xué)說的要點：1、生物體都是由細胞構(gòu)成；2、細胞由分裂產(chǎn)生新細胞；3、細胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能（生命活動）的基本單位。非細胞結(jié)構(gòu):細胞結(jié)構(gòu)：病毒：HIV 、SARS、流感病毒、噬菌體等原核細胞：真核細胞：藍藻細菌 放線菌支原體 衣原體 立克次氏體所有動物除藍藻外的植物真菌：如蘑菇、酵母菌、霉菌生物原核細胞真核細胞原核細胞與真核細胞的本質(zhì)差異原核細胞真核細胞無以核膜為界限

6、的細胞核有以核膜為界限的細胞核較小較大只有核糖體一種細胞器多種復(fù)雜的細胞器無染色體，有DNA分子有染色體（DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成）原核細胞與真核細胞的本質(zhì)差異圓球形、 多面體形、 紡錘形、長梭形、 管狀、 長柱形、 分枝狀、 不規(guī)則性 。細胞的多樣性支原體巨型烏賊神經(jīng)細胞蕨藻鴕鳥卵卵細胞細胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核膜細胞核核仁線粒體高爾基體核糖體細胞膜溶酶體中心體葉綠體 細胞壁液泡動、植物細胞的結(jié)構(gòu)及區(qū)別動物細胞與植物細胞的比較 細胞器動物細胞植物細胞 細胞壁無有 葉綠體無有 液泡無有 溶酶體有無 圓球體無有 營養(yǎng)方式異養(yǎng)自養(yǎng) 通訊連接方式間隙連接胞間連絲 中心體有無 胞質(zhì)分裂方式收縮環(huán)細胞板細胞的分裂一個母細

7、胞經(jīng)過一系列復(fù)雜的變化后，分裂成兩個子細胞的過程，叫做細胞分裂。受精卵兩個子細胞四個子細胞細胞團細胞分裂的意義？單細胞生物個體數(shù)目增多細胞數(shù)目增多多細胞生物2、細胞的生長與生長周期子細胞從周圍吸收營養(yǎng)，合成自身的組成物質(zhì)、不斷地長大的過程。生長的結(jié)果？生長生長3、細胞的分化產(chǎn)生了各種不同形態(tài)、功能的細胞，它們構(gòu)成了生物體的各種結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)環(huán)境。細胞分化的結(jié)果：在個體發(fā)育中，由一個或一種細胞增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定差異的過程，叫細胞分化。12345細胞分裂細胞分裂細胞分化細胞生長細胞分裂、生長、分化的結(jié)果分裂：使細胞數(shù)目增多生長：使細胞體積增大分化：使細胞種類增多細胞有壽

8、命嗎?細胞能無限制的分裂嗎?細胞的衰老、死亡細胞的衰老： 一般指復(fù)制衰老，即體外培養(yǎng)的正常細胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止分裂，細胞形態(tài)和生理代謝活動發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象。形態(tài)：細胞水分減少導(dǎo)致細胞萎縮， 體積變小。結(jié)構(gòu)：核增大，色素積累， 染色質(zhì)固縮。功能：新陳代謝速度減慢， 呼吸速度減慢 （線粒體功能退化、形變） 有些酶的活性降低 （酪氨酸酶） 細胞膜通透性功能改變。 衰老細胞的主要特征細胞死亡自動死亡被動死亡(細胞凋亡)(細胞壞死)遺傳物質(zhì)控制外界因素 最主要的一種方式，受Bcl-2家族、caspase家族等基因控制的主動的生理性細胞自殺行為。凋亡的起始：細胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細胞

9、間接觸的消失，但細胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。凋亡小體形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞質(zhì)膜所包圍。細胞表面產(chǎn)生許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個凋亡小體。凋亡小體逐漸為鄰近的細胞吞噬并消化。細胞凋亡過程動物個體內(nèi)不同類型和壽命的細胞接近于動物的整體壽命的細胞，如神經(jīng)元和肌肉細胞等。在胚胎發(fā)育終了時，這些細胞不再增加數(shù)量，在個體的生長期中它們可增長細胞體積，以使其與軀體成比例。它們隨著個體衰老而衰老，或者由于這些細胞的衰老、死亡引起個體死

10、亡。緩慢更新的細胞，它們的壽命短于動物的平均壽命，如肝細胞，胃壁細胞等?？焖俑碌募毎?，如皮膚的表皮細胞、紅細胞和白細胞等。Hayflick界限 細胞（至少是培養(yǎng)的細胞），不是不死的、而是有一定壽命的。它們的增殖能力不是無限的，而是有一定界限的。Leonard Hayflick (1928 )正在檢查他培養(yǎng)的WI-38細胞 體外培養(yǎng)細胞增殖與個體壽命的關(guān)系物種 成纖維細胞傳代數(shù) 個體最長壽命（年）龜 90-125 175水貂 30-34 10雞 15-35 30小鼠 14-28 3.5人 胚胎 40-60 110 出生至15歲 20-40 15歲以上 10-30 早老病患者 2-10 10-2

11、0細胞的無限增殖與癌變癌 Cancer基因控制無限增殖衰老死亡梅艷芳 宮頸癌馬三立 膀胱癌文興宇 肺癌羅京 淋巴癌陳曉旭 乳腺癌腫瘤細胞正常細胞為什么會轉(zhuǎn)化成癌細胞？癌細胞正常細胞原癌基因抑癌基因突變突變癌基因失去抑制作用不能控制（致癌因子的作用）不受控制，惡性增殖原癌基因抑癌基因癌基因（1）物理致癌因子：輻射（紫外線、X射線、電離輻射等）致癌的外界因素（2）化學(xué)致癌因子：無機物如石棉、砷化物、鉻化物、鎘化物等；有機物如黃曲霉素、亞硝胺、尼古丁、甲醛、 苯、聯(lián)苯胺、煤焦油、苯并芘等（3）病毒致癌因子： 感染人的細胞，將其基因整合進入人的基因組，誘發(fā)癌變?nèi)纾焊腥疽腋尾《究烧T發(fā)肝癌； 感染人乳頭狀

12、病毒可誘發(fā)宮頸癌； EB病毒是一種皰疹病毒，使兒童患淋巴癌、成人 患鼻咽癌。如何預(yù)防癌癥？ 在多細胞生物中，每個個體細胞的細胞核具有個體發(fā)育的全部基因，只要條件許可，細胞都可發(fā)育成完整的個體。細胞經(jīng)分裂和分化后仍具有形成完整有機體的潛能或特性。細胞的全能性高度分化的植物體細胞具有全能性，離體植物細胞在一定營養(yǎng)的物質(zhì)、激素和其他適宜的外界條件下，能表現(xiàn)其全能性。高度分化的動物體細胞也具有全能性嗎？ 誘導(dǎo)多功能干細胞（iPScell）創(chuàng)始人之一。 2006年山中伸彌等科學(xué)家把4個轉(zhuǎn)錄因子通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)入小鼠的成纖維細胞，使其變成多功能干細胞。這意味著未成熟的細胞能夠發(fā)展成所有類型的細胞。 2

13、007年，他所在的研究團隊通過對小鼠的實驗，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)人體表皮細胞使之具有胚胎干細胞活動特征的方法。此方法誘導(dǎo)出的干細胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樾呐K和神經(jīng)細胞，為研究治療多種心血管絕癥提供了巨大助力，這一研究成果在全世界被廣泛應(yīng)用。山中伸彌京都大學(xué)IPS細胞研究所所長2012年，獲得諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎 細胞全能性高低與細胞分化程度有關(guān)，分化程度越高，細胞全能性越低，全能性表達越困難。胚胎干細胞成體干細胞多能干細胞全能干細胞專能干細胞干細胞動物細胞核的全能性第三節(jié)細胞培養(yǎng)的基本條件 細胞培養(yǎng)是以第一流的技術(shù)為基礎(chǔ)的，沒有其它可接受的標準。高深的理論知識本身不能產(chǎn)生良好的培養(yǎng)。我相信有了實踐才能產(chǎn)生滿意的結(jié)果。動物

14、組織培養(yǎng)英國，華斯萊實操理論動物細胞培養(yǎng)的難點1、營養(yǎng)要求復(fù)雜；2、動物細胞無細胞壁，機械強度低，對剪切力敏感；3、適應(yīng)環(huán)境能力差，對環(huán)境（pH、溶解氧、溫度、剪切力）敏感；4、倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染。動物細胞培養(yǎng)的基本條件（1）無菌條件無菌條件是細胞體外培養(yǎng)最基本的條件。！當細胞放置于體外培養(yǎng)時，與體內(nèi)相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細胞死亡。因此在進行培養(yǎng)中，保持細胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。蒸汽滅菌過濾除菌化學(xué)滅菌輻射滅菌火焰滅菌多重保險、確保無污染抗生素?zé)o菌室（十萬級）無菌操作臺（百級）著裝

15、視頻資料污染難100%避免及時確認污染采取必要措施看 檢及時確認發(fā)生的微生物污染最常發(fā)生的是霉菌和細菌污染。霉菌污染易于發(fā)現(xiàn)，如培養(yǎng)液中長出了各種菌落，肉眼可見，不難確認細菌感染時，有的引起培養(yǎng)液混濁，鏡下可見大量細菌，有的培養(yǎng)液無明顯改變?nèi)鐟岩晌廴荆匾獣r可向肉湯或瓊脂培養(yǎng)基里滴少量培養(yǎng)物，置37溫箱培養(yǎng)數(shù)日，觀察有無菌落形成，以驗證是否污染。經(jīng)常發(fā)生和難以發(fā)現(xiàn)的是支原體污染。PPLO體積小，只有0.25 1 m大小，且無細胞壁。 PPLO污染后的細胞仍然能生存，甚至無明顯變化，有時導(dǎo)致培養(yǎng)細胞發(fā)生不同程度的病理改變。（2）營養(yǎng)條件 動物細胞培養(yǎng)對營養(yǎng)要求非常嚴格，除氨基酸、維生素、無機鹽、

16、葡萄糖、核酸外，還需要血清。培養(yǎng)液是細胞營養(yǎng)的直接來源。碳水化合物：提供碳骨架和能量氨基酸：12種基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸）和谷氨酰胺維生素：常用的有煙酰胺、葉酸、核黃素、維生素B12、泛酸、吡哆醇及維生素C，維持細胞生長生長因子：包括激素類物質(zhì)和促生長因子，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、血小板生長因子、內(nèi)皮細胞生長因子、生長調(diào)節(jié)素等無機鹽：鉀、鈉、鈣、鎂、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如鐵、鋅、硒等血清成分：激素生長因子結(jié)合蛋白貼壁擴展因子微量元素如硒缺點：價格貴、質(zhì)量不穩(wěn)定（3）理

17、化條件溫度pH滲透壓氣分壓體外體內(nèi) 溫度維持細胞旺盛生長須有恒定適宜的溫度。細胞代謝強度與溫度成正比，低溫下會使細胞代謝速率降低。溫度過高導(dǎo)致細胞死亡，這主要是由酶和蛋白質(zhì)所需要的最適溫度決定的。如人體細胞最適溫度為36.50.5，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。恒溫培養(yǎng)箱 魚類是變溫動物，耐溫范圍較廣，因此魚類細胞培養(yǎng)對溫度的要求沒有哺乳動物細胞培養(yǎng)那么嚴格。牙鲆鰓細胞系大西洋鱈前腎巨噬細胞對蝦肌肉組織細胞草魚細胞水生哺乳動物2）pH值：動物細胞生長大多需要輕微堿性環(huán)境，最佳為7.27.過酸（低于6）或過堿（高于7.6）可導(dǎo)致細胞死亡。這主要與蛋白質(zhì)的變性和細胞膜的結(jié)構(gòu)

18、受損有關(guān)。耐受性強 耐受性差3）氣體二氧化碳培養(yǎng)箱氣體是細胞生長代謝的必需條件，主要包括氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)(TCA)，產(chǎn)生細胞生長增殖所需的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。二氧化碳主要具有調(diào)節(jié)pH的作用。供給的體積分數(shù)一般為5%。4）滲透壓 用平衡鹽溶液配制各種試劑、洗滌，主要含無機鹽和葡萄糖。魚類細胞可耐受的滲透壓范圍更廣。某些海水魚，需要添加1.5%的氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓。海洋節(jié)肢動物細胞培養(yǎng)（4）常用培養(yǎng)器培養(yǎng)板培養(yǎng)皿細胞反應(yīng)器疫苗、激素生產(chǎn)培養(yǎng)瓶第四節(jié)原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)一、培養(yǎng)細胞的生長類型和特征貼壁型細胞懸浮型細胞(非貼壁型)兼性貼壁細胞：種類較少成纖維細胞型上皮細胞

19、型不規(guī)則多角形放射狀梭形火焰形球形游走型、多形型密度高、適用大規(guī)模培養(yǎng)三大類培養(yǎng)細胞的生長特點a)貼附生長b)接觸抑制c)密度依賴性 細胞貼壁是一個非常復(fù)雜的多因素相關(guān)過程，支持物表面的清潔程度、所帶電荷以及培養(yǎng)基中的一些蛋白、激素、多肽類物質(zhì)都會影響，血清促進細胞貼壁主要是糖蛋白起的作用。三大特點 粘附是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式 粘附是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式含義：有兩方面結(jié)果：基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結(jié)合形成組織，有機體的絕大多數(shù)細胞必須粘附于一固相表面才能生存和生長。培養(yǎng)細胞的貼附、伸展1234接觸抑制：細胞在貼壁生長過程中，

20、隨著細胞分裂，數(shù)量增加，形成一個單層，此時細胞間相互接觸，細胞分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。50代以后失去接觸抑制接觸抑制1.培養(yǎng)的細胞之間仍有在形態(tài)和機能上的相互依存關(guān)系。在結(jié)構(gòu)上，如：上皮細胞仍見有橋粒在生理活動上，單個細胞雖能生長繁殖, 但不如群體細胞能力強，當相鄰細胞接觸，便導(dǎo)致運動停止，細胞相互溝通生物信息的結(jié)果。 2.培養(yǎng)的細胞和基質(zhì)之間 對細胞外基質(zhì)仍有依存性 去分化(脫分化):各種分化細胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能“個性”，表現(xiàn)出某種趨同性 如:培養(yǎng)的成纖維細胞 在適當刺激下，可分化為 其它結(jié)締組織細胞和肌組織細胞，表現(xiàn)出類似未分化的間充質(zhì)細胞的特性，返祖 。1. 去分化并不意

21、味著完全返回胚胎時期的原始細胞狀態(tài)如:高度分化的神經(jīng)細胞和心肌細已經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復(fù) 但已經(jīng)具備的生物電活動特性不會完全失去 2. 再分化：可重新表現(xiàn)出分化特點 如：把表皮細胞放在氣液界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的角質(zhì)細胞 、內(nèi)皮細胞，但，這種能力會隨著培養(yǎng)時間延長 逐漸喪失?？傊?，體外培養(yǎng),使細胞結(jié)構(gòu)與功能上的“可塑性”增大1、取材無菌器械鋒利及時培養(yǎng)剔除無關(guān)成分營養(yǎng)豐富記錄保存信息資料視頻 原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，是從供體取出組織或分離細胞接種培養(yǎng)后至第一次傳代之前的細胞培養(yǎng)階段。二、動物細胞的原代培養(yǎng)選取原則：個體健壯、無病，無外傷，避免選用某些攜帶內(nèi)源性病菌的魚類。個體越年

22、輕，其細胞一般保持較強的分裂能力，體外培養(yǎng)成功的可能性就越大。因此，胚胎或幼體應(yīng)該是細胞傳代的很好材料。組織材料的來源水生無脊椎動物：主要包括甲殼類、貝類、海綿等。水生脊椎動物，主要是魚類。 供培養(yǎng)的組織材料要經(jīng)過嚴格的擦洗、消毒與多次沖洗。海洋動物的組織還需用75%酒精、稀高錳酸鉀溶液或二氯化汞、雙氯苯雙胍己烷溶液等再處理，以殺滅海洋中一些弧菌類有機體。再用維持液反復(fù)沖掉多余消毒劑，這樣處理既能殺死細菌又能維持細胞活性。組織材料的清洗消毒弧菌是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌。如霍亂弧菌?；【鷮購V泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動物體內(nèi)。目前弧菌有91種。主要魚貝類致

23、菌為：溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌等細胞懸液的分離：組織材料的分離組織塊的分離：機械分散法（多級篩網(wǎng)）剪切分離法酶消化法離心法血液、羊水、胸腔水、腹水胰蛋白酶膠原蛋白水解酶 2、培養(yǎng)方法常用，操作簡便；成功率較高適合組織量少；生長較慢、耗時長注意事項：輕拿輕放，及時更換培養(yǎng)液將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法步驟繁瑣、易污染、成本高；適用大量組織、耗時短、效率高； 應(yīng)用消化分散法將組織細胞間質(zhì)（基質(zhì)、纖維）除去，使細胞分散，然后接種培養(yǎng)。酶消化酶消化法 采用較為廣泛的方法，適用于絕大多數(shù)組織，并且在貼壁細胞傳代時也多用此種方法。經(jīng)常采用的消化酶有胰

24、蛋白酶、膠原酶等。利用消化法得到的細胞量大，均一性好，細胞貼壁后可迅速形成單層。要注意不同組織需不同的消化酶濃度以及消化時間，否則會因消化過度而對細胞產(chǎn)生損傷。胰酶-EDTA消化液能與細胞間鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細胞連接松散冷消化熱消化a、貼壁培養(yǎng)法b、懸浮培養(yǎng)法少數(shù)動物細胞屬于懸浮生長型，如淋巴細胞和腫瘤細胞。懸浮生長的細胞其培養(yǎng)和傳代都十分簡便。傳代時不需要再分散，此法細胞增殖快、產(chǎn)量高。多數(shù)細胞屬于貼壁生長型，使分散的單細胞先貼附在瓶壁或支撐物上后，再進行培養(yǎng)的方法。最終在附著表面擴展成單層。有接觸抑制的特性，一旦細胞形成單層,生長就會受到抑制，細胞產(chǎn)量有限。（1）組織塊固定法當組織量較

25、少時可采用此法。它是將組織剪成約一立方毫米的小塊, 按一定比例將組織塊貼在瓶壁上, 至少三十分鐘以上, 然后輕輕加人營養(yǎng)液置溫箱培養(yǎng)。 （2）機械分散法此法適用于細胞間連接較松散的組織, 如胚胎組織及幼魚全魚。將組織剪成約一立方毫米耐的小塊, 放入底部有一銅網(wǎng)的注射器內(nèi), 用手的壓力將組織擠出網(wǎng)孔, 最后將分散的組織吹打后加人營養(yǎng)液分裝培養(yǎng)。（3）絡(luò)合劑分散法目前使用的絡(luò)合劑主要是乙二胺四乙酸, 它能與細胞間鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細胞連接松散, 經(jīng)吹打即可分散。該法目前主要用于囊胚細胞培養(yǎng)及上皮型細胞系的傳代。（4）酶消化法該法是目前采用極為廣泛的方法, 適用于絕大多數(shù)組織器官。所用的酶主要是

26、胰酶, 常用濃度是0.25%。根據(jù)酶消化時溫度的不同, 又可進一步分為冷消化法及熱消化法。（5）冷消化法此法是將組織剪成約刀的小塊, 然后置一倍體積的胰酶中, 四攝氏度培養(yǎng)。草魚肝臟組織細胞的原代培養(yǎng)：1魚體用0.01%高錳酸鉀溶液浸泡消毒半小時。2用70%酒精棉花擦洗解剖部位。3剖開腹腔，取出0.5cm3的組織，除去粘膜和血塊等，小燒杯中用小剪刀剪碎，用Hanks液洗34次。4轉(zhuǎn)入三角瓶，加0.25%胰酶20消化30分鐘。5消化完畢，加少許Hanks液，離心6倒去消化液，用Hanks液重懸12次。7用含有小牛血清的生長液重懸。8計數(shù)，分裝培養(yǎng)。實例視頻資料 細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后，傳到新

27、的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)的過程。進行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。需要進行傳代培養(yǎng)的原因？ 初次傳代的注意點：（1）充分生長；（2）消化時間的控制；（3）接種量大一些。細胞濃度應(yīng)在200萬個細胞/毫升以上，接種量太少不容易傳代成功。三、動物細胞的傳代培養(yǎng)1 懸浮細胞的傳代 直接傳代：使懸浮細胞沉底，吸掉約2/3上清，懸浮細胞，然后分別接種兩只或多只培養(yǎng)瓶。 離心傳代：將培養(yǎng)液于1000rpm離心，棄去上清，加入新的生長液，吹打懸浮細胞，然后分別接種兩只或多只培養(yǎng)瓶。2 貼壁細胞的傳代確認細胞有無污染，吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；消化液量要適當，以搖動時能蓋滿單層細胞為度；消化時間不宜過久，一般在室溫下靜置25min,當見細胞間隙變大，細胞層出現(xiàn)麻布樣網(wǎng)孔、細胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，即可終止消化。終止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基。用吸管輕輕吹打瓶壁，使細胞脫落制成懸液，計數(shù)后記錄其濃度。接種培養(yǎng)。消化傳代視頻資料1待細胞長成單層后，倒去培養(yǎng)液，加胰酶-EDTA消化液，當單層細胞呈白色一片，而且細胞間出現(xiàn)針孔狀空隙時，停止消化，再倒去消化液。2加入細胞生長液，吹打分散3分裝培養(yǎng)，一般一瓶傳二瓶，有的細胞株可以分裝三瓶培養(yǎng)細胞的生長增殖過程培養(yǎng)細胞的生命期一代貼附生長細胞的生長過程兩個 型曲線S培養(yǎng)細胞的生命期衰老死亡總細胞產(chǎn)量培養(yǎng)時間系列傳代原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)細胞的生命期細胞系連續(xù)細